白麗真，劉 偉，劉洪銀，張 帆

（北京順鑫農業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠，北京101301）

白酒是中國特有的一種蒸餾酒，是以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，以糧谷為主要原料，經蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、陳釀和勾兌釀制而成的各類白酒。品質優(yōu)良的白酒味道醇厚，且有綿甜之感，是因為白酒中含有多元醇、高級醇等甜味物質，這些物質是在白酒復雜特殊的釀造工藝和發(fā)酵過程中產生的。近年來，食品安全問題一直備受關注，尤其是食品添加劑引起的安全問題?，F在不少白酒生產企業(yè)為了改善白酒風味，增加回甜感，在白酒中添加少量的甜味劑，既降低成本還能提高生產效率[1]。

甜味劑是指能賦予軟飲料甜味的食品添加劑，按其化學結構和性質分為糖類和非糖類甜味劑。葡萄糖等糖類物質，因長期被人食用，且是重要的營養(yǎng)素，通常視為食品原料，在中國不作為食品添加劑。而非糖類的甜味劑分為天然甜味劑和人工合成甜味劑，因其甜度較高，熱值很低，有些甚至不參與代謝過程[2]，被稱為非營養(yǎng)型甜味劑，受到人們的廣泛關注。天然甜味劑有甜菊糖苷、甘草等。人工合成甜味劑有糖精、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜等。

人工合成甜味劑雖不會被人體吸收，但長期攝入會對人體的代謝系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等造成傷害[3-4]?！妒称钒踩珖覙藴适称诽砑觿┦褂脴藴省稧B 2760—2014中規(guī)定白酒中甜味劑不得檢出[5]。市場抽查的白酒中可能檢出的甜味劑有糖精鈉、安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖和甜菊糖苷等。

目前檢測白酒中的甜味劑的方法較多，其中液相質譜快速、靈敏的特點使其在白酒的甜味劑檢測中的應用越來越多[6-10]。本文建立了一種快速檢測白酒中最常見的7種人工合成甜味劑（安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、紐甜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、甜菊糖苷）的超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC-TQS）檢測方法[11-16]。該方法前處理簡單、進樣時間短、結果準確，可直接用于白酒生產企業(yè)白酒日常監(jiān)督檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：市售的清香型白酒、濃香型白酒、醬香型白酒各2種，配制酒2種，某品牌蘋果醋1種和某品牌碳酸飲料1種。

試劑及耗材：甲醇、乙腈（LC/MS級，Fisher）；甲酸（HPLC級，美國Waters公司）；實驗用水為Milli-Q超純水；7種甜味劑：糖精鈉（含量97%，北京百靈威科技有限公司），三氯蔗糖（含量98%，北京百靈威科技有限公司），紐甜（含量98%，北京百靈威科技有限公司），甜蜜素（含量99%，北京百靈威科技有限公司），甜菊糖苷（含量80%，北京百靈威科技有限公司），阿斯巴甜（含量98%，北京百靈威科技有限公司），安賽蜜（含量99%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）。

儀器設備：超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC?，美國Waters公司)-串聯四極桿質譜儀(ACQUITY?TQS，美國Waters公司)；Milli-Q Reference超純水發(fā)生器(美國Millipore公司)；電熱板（廣州格丹納儀器有限公司）；0.22 μm有機濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司）；萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準液制備

分別稱取一定量的糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、紐甜、甜蜜素、甜菊糖苷和阿斯巴甜標準品于10 mL容量瓶中，用超純水定容至10 mL，配制成各甜味劑標準儲備液。由于阿斯巴甜等在純水中不穩(wěn)定，易分解，配制時可加入少量乙酸調節(jié)pH4.3。標準液于4℃冰箱中保存。根據需要用超純水逐級稀釋至適當濃度的混合標準溶液。

1.2.2 樣品前處理

白酒樣品：準確吸取白酒樣品10 mL于50 mL燒杯中，用電熱板120℃蒸發(fā)去酒精后，用超純水定容至10 mL，經0.22 μm有機濾膜過濾，進液質檢測。

其他樣品：直接稀釋至合適濃度，經0.22 μm有機濾膜過濾，進液質檢測。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)；柱溫為 40 ℃；樣品室溫度為20℃；進樣量：1 μL；流動相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸水溶液；流速：0.35 mL/min；梯度洗脫程序：0 min，10%A；0～4 min，10%A～90%A；4.0～4.5 min，90%A；4.51～6.5 min，10%A。

1.2.4 質譜條件

質譜儀選用電噴霧離子源，在負離子模式下檢測，采用多反應監(jiān)測模式(MRM)定量。毛細管電壓分別為2.5 kV，錐孔電壓為20 V，脫溶劑氣和錐孔氣流量分別設為800 L/h和50 L/h，脫溶劑氣溫度為

400℃。質譜參數見表1。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本實驗采用了HSS T3色譜柱。根據7種甜味劑的極性特點，以及乙腈的強洗脫能力和較強毒性，最終確定用甲醇作為有機相。然后對比甲醇-水和甲醇-甲酸水溶液兩種流動相體系，發(fā)現用0.1%甲酸水溶液作為水相流動相進樣時，7種甜味劑的峰形和響應明顯比用水做流動相更好，且穩(wěn)定性更好。最終確定用甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相。

表1 7種甜味劑的質譜條件參數

圖1 7種甜味劑的MRM色譜圖

表2 7種甜味劑線性回歸方程與相關系數

2.2 質譜條件的優(yōu)化

本實驗以電噴霧ESI源作為離子源，在負離子模式下，以直接進樣的方式對7種甜味劑標準樣品進行全掃描，找到其準分子離子峰，將其作為母離子，用惰性氣體氬氣轟擊，得到二級譜圖和相應的子離子。用MRM模式對選定的子離子進行質譜參數的優(yōu)化，取豐度最強的子離子作為定量離子。表1為7種甜味劑的質譜條件參數。圖1為7種甜味劑在優(yōu)化的質譜和色譜條件下的MRM色譜圖。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

由于白酒中含有較高濃度的乙醇，直接進樣分析會影響甜味劑在色譜柱上的保留時間和峰形，影響檢測結果的準確性，因此在進樣分析前會對白酒樣品進行前處理。本實驗用加水稀釋和蒸發(fā)去酒精兩種方式分別進樣對比，發(fā)現由于白酒樣品的酒精度分為3個等級，高度酒和低度酒的稀釋倍數成為影響樣品檢測結果的一個重要因素，且甜味劑作為白酒的安全指標，在白酒中的含量本來就很低，如果稀釋倍數過高，會影響結果的準確性，因此本實驗采用蒸發(fā)去酒精的方式處理樣品。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

由于各個甜味劑在質譜上的響應有差異，經過優(yōu)化，使它們的響應在同一個數量級。將配制好的混合標準溶液進行檢測，繪制標準工作曲線。以目標組分的峰面積y對相應的質量濃度x繪制標準曲線，結果表明，所有的甜味劑均有較好的線性關系，以信噪比（S/N）為3確定檢出限（LOD），以信噪比（S/N）為10確定定量限（LOQ），結果見表2。

2.5 精密度和回收率

用在空白樣品中添加標準溶液的方法，選擇某白酒酒樣做7種甜味劑檢測試驗，7種甜味劑含量均為未檢出，選擇高、低兩種濃度進行加標回收實驗，各做6次平行實驗，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD）。結果表明，白酒中7種待測物的回收率在91.8%～114%之間，RSD小于8%(表3)，方法的準確度和精密度均符合殘留分析的要求。

表3 7種甜味劑回收率和精密度

2.6 實際樣品的檢測

用本檢測方法對市售的清香型白酒、濃香型白酒、醬香型白酒各2種，配制酒2種，某品牌蘋果醋1種和某品牌碳酸飲料1種進行檢測，每個樣品做2次平行實驗，結果見表4。10個樣品中，白酒和配制酒中甜味劑均未檢出，蘋果醋飲料中三氯蔗糖有檢出，碳酸飲料中有3種甜味劑被檢出，分別是安賽蜜、三氯蔗糖和阿斯巴甜。從結果可以看出，甜味劑在飲料中有添加，有些飲料中添加的甜味劑不止一種，白酒中沒有甜味劑檢出。該方法操作簡單，成本低，快速準確，可用于白酒生產企業(yè)日常監(jiān)督檢測。

表4 實際樣品的檢測 (μg/mL)

3 結論

研究建立了用超高效液相色譜-串聯質譜同時對白酒中7種人工合成甜味劑含量快速測定和確證的方法，優(yōu)化了前處理方法、色譜和質譜參數。該方法操作簡便，與國標相比，前處理簡單，節(jié)約成本，進樣時間只有6.5 min，分離效率高，同時具有靈敏度高、選擇性好、檢出限低、結果準確的優(yōu)點，方法的回收率和重現性能夠滿足白酒中7種甜味劑的日常監(jiān)督檢測。此方法也可用于檢測其他液體樣品中的甜味劑含量，為從源頭上控制白酒中甜味劑的出現提供了技術支持[1]，具有較高的實用價值。