王莎莎，王 吉，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

牛冠狀病毒(bovine coronavirus, BCV)是一類具有包膜，基因組為27～30 kb大小的線性單股正鏈的RNA病毒[1]，具有感染性，是所有RNA病毒中最大的。BCV是冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，目前冠狀病毒共分為α、β、γ以及新假定的一個屬共四類，牛冠狀病毒和鼠肝炎病毒以及SARS冠狀病毒等同屬β類冠狀病毒[2]。BCV與人腸道冠狀病毒4408株在抗原性和基因序列具有很高的相似性，存在潛在感染人的風險。BCV是引起新生犢牛腹瀉和成年牛冬痢、呼吸道疾病的主要病原，在全球普遍流行。BCV經(jīng)常與其他多種病原引發(fā)混合感染，難于診斷，通常需要實驗室病毒分離、血清檢測或者分子學(xué)檢測方法進行診斷。本研究建立了BCV特異的TaqMan探針法實時熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)檢測方法，能夠?qū)崿F(xiàn)快速批量檢測牛群中BCV的感染情況，并減少污染。該方法可應(yīng)用于牛源性生物制品BCV污染的檢測，為保證生物制品安全性提供依據(jù)，同時為開展BCV基因組的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品與毒種來源

牛冠狀病毒核酸為哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈，牛藍舌病病毒(bluetongue virus，BTV)核酸為第二軍醫(yī)大學(xué)惠贈，牛皰疹病毒1型(bovine herpesvirus 1，BHV-1)、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus 3, BPIV3)、牛病毒型腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、呼腸孤病毒III型病毒(reovirus 3，Reo3)、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)為本實驗室保存。牛肛拭子63份G1～G63，牛鼻拭子63份B1～B63采集于2016年內(nèi)蒙古牛群，牛源性生物制品33份NY1～NY33為本實驗室2015年應(yīng)急檢測樣品。

1.2 主要試劑與儀器

FQ-PCR Mix購自ABI; FQ-PCR引物探針由ABI公司合成。RNA快速提取試劑盒RNeasy Mini Kit(250)(批號：154043816)購自Qiagen，AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒AMV Reverse Transcriptase(批號：0000290291)購自Promega，TaqMan Universal PCR Master Mix(批號：1704286)購自ABI。熒光定量PCR儀ABI7500 Fast購自ABI公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計

選擇BCV N 基因保守區(qū)域設(shè)計引物探針，序列如表1所示。

1.3.2 質(zhì)粒標準品的制備

由TaKaRa公司合成BCV(NCBI ID:AF058942)7851～8090 bp的cDNA序列，轉(zhuǎn)入pMD19-T載體中，構(gòu)建BCV FQ-PCR的標準質(zhì)粒pMD19-BCVN，濃度為4.0×1010Copies/μL。

1.3.3 病毒cDNA的獲取

將牛冠狀病毒、牛皰疹病毒I型、牛副流感病毒3型、牛病毒型腹瀉病毒、呼腸孤病毒III型、小鼠肝炎病毒；牛肛拭子63份；牛鼻拭子63份；牛源性生物制品33份等樣品按照RNA快速提取試劑盒操作方法進行RNA提取。提取的RNA按照Promega AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 BCV FQ-PCR擴增體系及標準曲線的建立

經(jīng)條件優(yōu)化，PCR反應(yīng)體系為：TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL，探針引物混合物(10 μmol/L)1 μL，無RNA酶水7 μL，模板1 μL。反應(yīng)條件：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。

將pMD19-BCVN作為標準品，進行10倍系列稀釋為109～100copies/μL，將其作為模板，按上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行FQ-PCR反應(yīng)，每個稀釋度做3個平行實驗，選取線性較好的7個稀釋度繪制標準曲線。

表1 用于擴增N基因的引物與TaqMan探針序列

1.3.5 BCV FQ-PCR檢測方法的特異性、靈敏性、準確性和穩(wěn)定性檢測

使用建立的熒光定量PCR方法檢測BCV、牛皰疹病毒1型、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹瀉病毒、呼腸孤病毒Ⅲ型、小鼠肝炎病毒、牛藍舌病病毒的病毒核酸，并設(shè)立陰性對照N/C(空白樣品)檢測BCV實時熒光定量PCR檢測方法的特異性；使用4.0×109～4.0×100copies/μL稀釋的標準質(zhì)粒作為模板，進行BCV FQ-PCR反應(yīng)，每個稀釋度做三個平行，檢測方法的靈敏性；用BCV FQ-PCR檢測方法對3份不同陽性樣品進行重復(fù)檢測，評價本發(fā)明方法的準確性和穩(wěn)定性。

1.3.6 BCV FQ-PCR污染實驗

將100～10-7梯度稀釋的BCV病毒液和100～10-7梯度稀釋的BCV RNA 0.1 mL與0.2 mL的鼠神經(jīng)生長因子混合后按1.3.3所述方法獲取cDNA，并使用BCV FQ-PCR方法進行檢測，驗證其適用性，每個稀釋度做3個平行。

1.3.7 BCV FQ-PCR的應(yīng)用

使用建立的FQ-PCR方法檢測63份牛肛拭子，63份牛鼻拭子以及33份牛源生物制品中BCV的感染情況。如有陽性結(jié)果，使用PCR引物BCV-PF：5’-CGATGAGGCTATTCCGACTAGG-3’；BCV-PR：5’-GCTTAGTTACTTGCTGTGGC-3’(未發(fā)表)對其進行PCR擴增，產(chǎn)物送北京英濰捷基公司進行測序鑒定，以進一步驗證。

2 結(jié)果

2.1 BCV FQ-PCR擴增體系及標準曲線的建立

使用4.0×109copies/μL到4.0×103copies/μL的標準質(zhì)粒作為模板進行FQ-PCR反應(yīng)，擴增曲線如圖1，構(gòu)建的標準曲線如圖2。擴增曲線各稀釋度間距均勻，標準曲線相關(guān)系數(shù)Slope為-3.417(在-3～-3.5之間)，r2值為0.999(>0.99)說明相關(guān)性高，定量結(jié)果有效，擴增效率Eff為96.195%(90%-110%之間)。標準品及待測樣本3個重復(fù)的標準差(CTSD值)均小于0.218。

2.2 BCV FQ-PCR特異性檢測

如圖3所示，建立的BCV FQ-PCR檢測BHV-1、BPIV3、BVDV、Reo3、BTV均無S型擴增曲線，而BCV有S型擴增曲線，CT值為22，陰性對照無S型擴增曲線，說明該方法能特異的檢測BCV。

2.3 BCV FQ-PCR靈敏性檢測

如圖4所示，4.0×109～4.0×101copies/μL各稀釋度的3個平行實驗均有S型擴增曲線，101copies/μL標準品檢測的 CT值為34.088，拷貝數(shù)為43.45copies，而100copies/μL的3個平行實驗只有1個實驗有S型擴增曲線，CT值>35，說明BCV FQ-PCR檢測方法最小能可靠的檢測到40copies的樣品。同時確定該檢測方法的判定標準為樣品循環(huán)閾值(CT)≤35,同時拷貝數(shù)(Copies)≥10,判定該樣品檢測結(jié)果為陽性；循環(huán)閾值(CT) ≥35、拷貝數(shù)(Copies)<10，或者循環(huán)閾值(CT) <35、拷貝數(shù)(Copies)≥10，或者循環(huán)閾值(CT) <35、拷貝數(shù)(Copies)<10,此樣品超出檢測限，不能確定被檢樣品是陽性樣品，結(jié)果判為陰性。

2.4 BCV FQ-PCR準確性和穩(wěn)定性檢測

起始濃度分別為4.0×106copies/μL、4.0×105copies/μL、4.0×104copies/μL的標準品的最終實測值的均值分別為4.78×106、3.89×105、3.7×104copies/μL，對應(yīng)CTSD值分別為0.038、0.113、0.102，CV值分別為0.228、0.547、0.424。3個濃度梯度3次重復(fù)實驗Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于5%，表明方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

2.5 BCV FQ-PCR污染實驗

BCV FQ-PCR檢測BCV病毒液的污染實驗結(jié)果顯示其檢測100～10-5稀釋度的CT值平均值分別為21.11、23.51、27.14、30.46、32.16、34.75，10-6BCV病毒液的CT值平均值為37，超出檢測限。BCV FQ-PCR檢測BCV RNA污染實驗結(jié)果顯示其100～10-2稀釋度的CT值平均值分別為25.88、30.17、33.7，10-3BCV RNA的CT值平均值為36.49，超出檢測限。污染實驗結(jié)果說明BCV FQ-PCR在檢測BCV病毒和BCV RNA污染的樣品時有很好的適用性。

2.6 BCV FQ-PCR的初步應(yīng)用

檢測63份牛肛拭子、63份牛鼻拭子以及33份牛源生物制品中BCV的感染情況，檢測結(jié)果如表1所示。其中僅有1份牛肛拭子G63和2份牛源生物制品NY12、NY17出現(xiàn)陽性結(jié)果，G63的CT值為34.506，NY12、NY17的CT值分別為33.78和34.21。使用1.5中所述的引物進行2次PCR擴增后G63、NY12可以得到457 bp比較明顯的擴增條帶，測序結(jié)果在NCBI上比對，與BCV B1-28F株(NCBI序列號：KU558923)的同源性為99%，與人冠狀病毒OC43株(NCBI序列號：KF530072)的同源性為97%。

表2 BCV FQ-PCR初步應(yīng)用檢測結(jié)果

圖1 BCV 103～109 copies/μL擴增曲線Figure 1 BCV 103～109 copies/μL amplification curve

注：斜率：-3.417 ，Y軸截距：39.686 ，相關(guān)系數(shù)：0.999 ，擴增效率：96.195%。圖2 BCV FQ-PCR標準曲線Note. Slope: -3.417, Y-lnter:39.686, r2:0.999, Eff%:96.195.Figure 2 BCV FQ-PCR standard curve

注：1：BCV；2-8：BHV-1、BPIV3、BVDV、Reo3、MHV、BTV、N/C。圖3 BCV FQ-PCR特異性實驗擴增曲線Figure 3 BCV FQ-PCR specificity test amplification curves

圖4 BCV FQ-PCR靈敏度檢測擴增曲線Figure 4 BCV FQ-PCR sensitivity test amplification curves

3 討論

BCV檢測方法有很多，但常規(guī)檢測方法存在耗時長、靈敏性差等不足，F(xiàn)Q-PCR技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強等優(yōu)點在基因表達水平分析、突變和多態(tài)性研究、病原體的定性和定量檢測等方面得到廣泛應(yīng)用。該方法提供了檢測BCV的FQ-PCR的引物和探針，以實現(xiàn)對樣品的批量檢測，有很高的靈敏度和特異性。國內(nèi)有一些學(xué)者建立了BCV的染料法熒光定量PCR[3],TaqMan探針法比染料法熒光定量PCR特異性更高[4]。

為了準確檢測BCV，研究人員選取保守性較高，且與MHV序列差異較大的N基因進行引物探針設(shè)計。所建立的FQ-PCR檢測方法，以重組質(zhì)粒為標準品，建立的標準曲線各稀釋度間距均勻，其標準曲線相關(guān)系數(shù)Slope為-3.417，相關(guān)系數(shù)r2為0.999，擴增效率Eff為96.195%。該方法檢測BCV的敏感度為40 copies，經(jīng)特異性驗證確定其對BHV-1、BPIV3、BVDV、Reo3、MHV、BTV等病毒無交叉反應(yīng)，準確性和穩(wěn)定性檢測驗證該方法3個濃度梯度3次重復(fù)實驗Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于5%，有很好的穩(wěn)定性和準確性。

污染實驗結(jié)果說明BCV FQ-PCR在檢測BCV病毒和BCV RNA污染的樣品時有很好的適用性。污染實驗中，可以準確檢測的BCV病毒稀釋度為10-5，而BCV RNA的稀釋度為10-2，有可能是因為RNA在樣品的處理過程中降解嚴重，雖然使用了無RNase的耗材，RNA的降解有可能是使用的鼠神經(jīng)生長因子或者別的一些原因。

2017年北京制定了實驗用牛的地方標準，BCV并未被列入普通級實驗用牛需要排除的病原體，然而實驗用牛群感染BCV存在一定的病發(fā)風險，在進行使用牛做動物實驗時也應(yīng)做全面的考慮[5]。Gomez等[6]對286份牛糞便樣本進行BCV檢測，發(fā)現(xiàn)在健康牛和腹瀉牛糞便中均能檢測出BCV核酸，且腹瀉牛糞便樣本的檢出率高于健康牛糞便樣本。建立的BCV FQ-PCR方法在內(nèi)蒙古的健康牛群中檢測出陽性樣本也說明BCV在國內(nèi)牛群中的普遍流行。BCV可引發(fā)冬痢，冬痢的臨床病癥為腹瀉，有時候便血、發(fā)燒、抑郁、牛奶減產(chǎn)、厭食癥、有時也咳嗽和流鼻涕，致死性不高，然而BCV感染群體有很高的發(fā)病率，造成很大的經(jīng)濟損失[7]。

使用2次PCR的方法對陽性樣本進行了BCV片段擴增，G63和NY12樣品成功擴增出了BCV片段。測序顯示其核酸序列與BCV和人冠狀病毒都有很高的同源性，與人冠狀病毒4408株的序列同源性高達98%。這與文獻報道一致[8]，且BCV在環(huán)境中存活時間較長[9]，人鼻粘膜、皮膚、口腔黏膜以及頭發(fā)都有可能成為BCV的傳播載體[10]，在人工飼養(yǎng)的牛群和野生反芻動物之間存在交叉感染[11]。因此，為保證牛源性生物制品的安全性，要加強牛源生物制品的質(zhì)量管理，建立的BCV FQ-PCR檢測方法為高通量高敏感性的BCV檢測提供了技術(shù)支持。