彭密軍，張命龍，王志宏，彭 勝，楊秋玲，段葉輝，李鳳娜,4

1廣東省測試分析研究所 廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣州 510070；2吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，張家界 427000；3中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實驗室，中國科學(xué)院亞熱帶 農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，長沙 410125；4湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128

斷奶可造成仔豬心理、飼糧、環(huán)境等應(yīng)激，極易引起斷奶應(yīng)激綜合征，導(dǎo)致仔豬腸道菌群失調(diào)、采食量下降、生長緩慢、腹瀉甚至死亡，經(jīng)濟損失因而較大。因此，確保仔豬順利斷奶對提高養(yǎng)殖效益具有重要的意義?？股鼐哂酗@著的抗病、抗應(yīng)激和促生長效果，在斷奶仔豬以及生長肥育豬飼養(yǎng)過程中被廣泛應(yīng)用[1]。但是，抗生素殘留、細菌耐藥性增加、長期使用導(dǎo)致畜禽免疫力降低以及引起畜禽二次感染等問題，也引起了人們極大的關(guān)注[2]。因此，尋找抗生素替代品便成為現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)的一個研究熱點。杜仲(Eucommiaulmoides)是傳統(tǒng)中藥材，其皮、葉、果、枝條等部位均含有豐富的天然活性物質(zhì)，是一種多功能的植物[3]。但中醫(yī)僅以杜仲樹皮入藥，據(jù)中醫(yī)藥典記載，杜仲樹皮具有補肝腎、強筋骨、安胎的功效；并能抗高血壓，具有調(diào)脂與保護心血管的功能[4]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)杜仲葉含有與杜仲皮相似的醫(yī)藥活性成分與營養(yǎng)物質(zhì)，主要包括綠原酸、黃酮類、鞣質(zhì)、多糖、氨基酸等。其中，杜仲葉中綠原酸的含量豐富，具有較強的抑菌和抗氧化活性[5]。目前，杜仲除了在醫(yī)學(xué)上得到廣泛應(yīng)用外，近年來在動物養(yǎng)殖業(yè)中的研究和應(yīng)用也呈增加趨勢，有關(guān)報道已見于豬[6]、雞[7]、鼠[8]、草魚[9]、青魚[10]等動物，這些研究表明了杜仲具有提高動物生長性能、改善機體免疫的功能。近年來，用杜仲葉做飼料添加劑，其主要利用形式為杜仲葉干粉或杜仲葉提取物，而發(fā)酵杜仲葉的應(yīng)用鮮見報道，另杜仲葉以何種形式利用效果為最佳尚不清楚，且其能否替代抗生素應(yīng)用于斷奶仔豬飼糧的研究也未見報道。因此，本試驗通過在斷奶仔豬飼糧中添加不同形式的杜仲葉(即杜仲葉提取物、發(fā)酵杜仲葉、杜仲葉干粉)，研究其替代抗生素對斷奶仔豬生長性能、腹瀉率、抗氧化力及免疫功能的影響，為杜仲葉在斷奶仔豬生產(chǎn)中的科學(xué)應(yīng)用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

杜仲葉提取物和杜仲葉干粉由張家界恒興生物科技有限公司提供，發(fā)酵杜仲由湖南粒豐生物科技有限公司提供。其主要生物活性成分為總黃酮和綠原酸，實測值含量如下：杜仲提取物(總黃酮14.40%、綠原酸6.55%)，發(fā)酵杜仲葉(總黃酮6.52%、綠原酸3.01%)，杜仲葉干粉(總黃酮5.67%、綠原酸2.67%)。

1.2 試驗設(shè)計及飼糧

選用28±2日齡，平均體重為7.22±0.34 kg的“杜×長×大”斷奶仔豬50頭，隨機分為5個組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，單欄飼養(yǎng)。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，抗生素組在基礎(chǔ)飼糧中添加75 mg/kg金霉素，杜仲葉組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加0.5%杜仲葉提取物、6%發(fā)酵杜仲葉、6%杜仲葉干粉?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2012)標準配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 飼養(yǎng)管理

本試驗在中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所永安試驗基地開展，飼養(yǎng)管理嚴格按照商業(yè)養(yǎng)殖場規(guī)范操作，試驗期為28天。具體操作如下：試驗前對豬舍進行消毒，安排專人負責飼養(yǎng)，自然通風(fēng)，預(yù)試期5天。仔豬自由采食，每天8∶00和16∶00各喂1次，自由飲水。試驗期間每日記錄耗料量，認真觀察并記錄豬只健康狀況和外觀變化。試驗結(jié)束時，豬只禁食(自由飲水)12 h，稱體重并記錄。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

注：1)預(yù)混料為每千克飼糧提供：維生素A，10800 IU；維生素D3，4000 IU；維生素E，40 IU；維生素K3，4 mg；維生素B1，6 mg；維生素B2，12 mg；維生素B6，6 mg；維生素B12，0.05 mg；生物素，0.2 mg；葉酸，2 mg；煙酸，50 mg；D-泛酸，25 mg；銅，150 mg；鐵，100 mg；錳，40 mg；鋅，100 mg；碘，0.5 mg；硒，0.3 mg。2)消化能為計算值，其他營養(yǎng)成分為實測值。

Note:1)The premix provided the following per kg of diets:vitamin A,10800 IU;vitamin D3,4000 IU;vitamin E,40 IU;vitamin K3,4 mg;vitamin B1,6 mg;vitamin B2,12 mg;vitamin B6,6 mg;vitamin B12,0.05 mg;biotin,0.2 mg;folic acid,2 mg;niacin,50 mg;D-calcium pantothenate,25 mg;Cu (as copper sulfate),150 mg;Fe (as ferrous sulfate),100 mg;Mn (as manganese oxide),40 mg;Zn (as zinc oxide),100 mg;I (as potassium iodide),0.5 mg;and Se (as sodium selenite),0.3 mg.2)Calculated value for DE,and analyzed values for other nutrients.

1.4 測定指標

1.4.1 生長性能的測定

試驗全程每天記錄每欄仔豬的采食量，第1、15、28天08∶00對每頭仔豬空腹稱重，計算1～14天、15～28天及1～28天的平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)、平均日增重(average daily gain，ADG)以及料重比(feed / gain，F(xiàn) / G)。

1.4.2 腹瀉率

試驗期內(nèi)每天09∶00和17∶00分別觀察仔豬糞便，按照Marquardt等[11]的方法對糞便進行評分。0分：糞便條形或粒狀；1分：軟糞、能成形；2分：稠狀、不成形、糞水未分離；3分：液狀、不成形、糞水分離。當糞便評分為2或以上時認為仔豬發(fā)生腹瀉。根據(jù)以下公式計算仔豬的腹瀉率：

腹瀉率=試驗期內(nèi)每組仔豬腹瀉頭數(shù) / (每組試驗豬頭數(shù)×試驗天數(shù))×100%

1.4.3 血液生化指標

在試驗第28天08∶00開始，每頭仔豬空腹前腔靜脈采血5 mL于抗凝管中，采用CX4 Pro全自動生化分析儀(Beckman Coulter公司，美國)測定血液中總蛋白(TP，貨號：03183734190)、白蛋白(ALB，貨號：03183688122)、尿素氮(BUN，貨號：04460715190)和葡萄糖(GLU，貨號：04404483190)含量，所有試劑盒均由德國診斷有限公司生產(chǎn)。

1.4.4 血液抗氧化指標

采用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒測定血液中丙二醛(MDA，貨號：A003-1)、超氧化物歧化酶(SOD，貨號：A001-1-1)、總抗氧化力(T-AOC，貨號：A015-1)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX，貨號：A005)含量。

1.4.5 血液免疫指標

采用武漢華美生物工程有限公司試劑盒測定血液中的免疫球蛋白A(IgA，貨號：CSB-E13234p)、免疫球蛋白M(IgM，貨號：CSB-E06805p)和免疫球蛋白G(IgG，貨號：CSB-E06804p)的含量。

1.4.6 免疫器官的測定

試驗結(jié)束時，將所有仔豬電擊(250 V，0.5 A，5-6 s)后屠宰，切開腹腔取肝臟和脾臟，去除結(jié)締組織稱取濕重，并計算其器官指數(shù)。

器官指數(shù)(g / kg)=器官濕重/活體重

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2013進行初步處理，用統(tǒng)計分析軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行協(xié)方差分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，以P<0.01作為差異極顯著性判斷標準，試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加不同形式的杜仲葉對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

由表2可知，在1～14天，飼糧中添加抗生素和不同形式的杜仲葉對斷奶仔豬的ADFI、ADG和F / G均無顯著影響(P>0.05)。在15～28天和1～28天，與對照組相比，杜仲葉提取物組顯著增加ADG并降低F / G(P<0.05)，且杜仲葉提取物組和杜仲葉發(fā)酵組ADG和F / G與抗生素組相比無顯著差異。在1～28天，ADFI未受飼糧處理的影響(P>0.05)。

與對照組相比，抗生素組顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，降低了45.55%，杜仲葉提取物組也顯著降低了仔豬腹瀉率，分別降低了41.88%(P<0.05)，杜仲葉發(fā)酵組和杜仲葉干粉組與對照組無顯著差異。

表1 杜仲葉對斷奶仔豬生長性能和腹瀉率的影響

注：同行無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P>0.01)；下表同。

Note:In the same row,values with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05),while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05),and with different capital letter superscripts mean significant difference (P>0.01).The same as below.

2.2 飼糧中添加不同形式的杜仲葉對斷奶仔豬血液生化指標的影響

由表3可知，飼糧中添加抗生素和不同形式的杜仲葉對血液TP、ALB、BUN和GLU含量影響均不顯著(P>0.05)。

2.3 飼糧中添加不同形式的杜仲葉對斷奶仔豬血液生化指標的影響

由表4可知，與對照組相比，抗生素組、杜仲葉提取物組、杜仲葉發(fā)酵組和杜仲葉干粉組血液中MDA含量均極顯著降低(P<0.01)，其中抗生素組和杜仲葉提取物組中MDA含量最低，且血液T-AOC含量極顯著升高(P<0.01)，其中抗生素組T-AOC含量最高。與對照組相比，飼糧中添加抗生素、杜仲葉提取物或杜仲葉發(fā)酵物極顯著升高血液中GSH-PX含量(P<0.01)，且這三組之間差異不顯著。飼糧中添加抗生素和不同形式的杜仲葉對血液SOD含量無顯著影響(P>0.05)。

表3 杜仲葉對斷奶仔豬血液生化指標的影響

表4 杜仲葉對斷奶仔豬血液抗氧化指標的影響

2.4 飼糧中添加不同形式的杜仲葉對斷奶仔豬血液抗氧化指標的影響

由表5可知，與對照組相比，抗生素組、杜仲葉提取物組和發(fā)酵杜仲葉組極顯著提高血液IgM含量(P<0.01)，且這三組之間無顯著差異。與對照組相比，飼糧中添加抗生素對斷奶仔豬血液中IgG含量無顯著影響，而杜仲葉提取物組、發(fā)酵杜仲葉組和杜仲葉干粉組有提高IgG含量的趨勢(P=0.06)。飼糧中添加抗生素和不同形式的杜仲葉對血液IgA含量影響不顯著(P>0.05)。

表5 杜仲葉對斷奶仔豬血液免疫球蛋白含量的影響

2.5 飼糧中添加不同形式的杜仲葉對斷奶仔豬免疫器官的影響

由表6可知，飼糧中添加抗生素對肝臟重量、脾臟重量和脾臟指數(shù)無顯著影響(P>0.05)。與對照組和抗生素組相比，杜仲葉提取物組可顯著提高肝臟指數(shù)(P<0.05)。

3 結(jié)論

近年來，關(guān)于杜仲促進養(yǎng)殖動物生長的報道在魚類[10]和禽類[12]方面較多，而在豬上的報道較少。有研究表明，飼糧中添加不同水平的杜仲葉提取物對豬(9.96～20 kg階段)的生長性能無顯著影響[6]。與前人研究不盡相同，本試驗添加0.5%杜仲葉提取物后提高了仔豬斷奶后第15～28天的日增重，使料重比水平降低至抗生素組水平，從而改善仔豬生長性能。另外，李婉濤等[13]報道，杜仲和桑葉提取物可以提高育肥豬的平均日增重，增加飼料報酬，提高生長性能。這些研究結(jié)果提示杜仲葉在斷奶仔豬上的利用以其提取物形式利用效果最佳，但杜仲葉提取物作用效果與使用階段和使用方式有關(guān)。Estienne等[14]指出，斷奶后2周是仔豬適應(yīng)斷奶的關(guān)鍵時期。與本試驗結(jié)果一致，說明杜仲葉提取物在斷奶后第2周使用效果最佳。

表6 杜仲葉對斷奶仔豬免疫器官的影響

在斷奶過程中，仔豬受到心理、飼糧以及環(huán)境等應(yīng)激時極易引起微生態(tài)區(qū)系紊亂，導(dǎo)致有害菌大量繁殖，從而引起腹瀉的發(fā)生。本試驗結(jié)果顯示，杜仲葉提取物顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，并達到了與抗生素組相同的水平。杜仲葉提取物降低仔豬腹瀉率的作用可能與提取物中多羥酚特別是丁香苷有關(guān)，據(jù)研究顯示，丁香苷能抑制α-麥芽糖酶的活性，抑制病原表面多聚糖蛋白的形成，從而控制腹瀉[6]。因此，杜仲葉提取物有替代抗生素用來預(yù)防仔豬腹瀉的潛力，并改善斷奶仔豬的生產(chǎn)性能。

血液是動物機體內(nèi)環(huán)境重要的組成部分，血液中生理生化指標的改變可反映動物機體或器官的代謝和健康狀況。血液中總蛋白含量可反映機體蛋白質(zhì)代謝狀況，白蛋白由肝臟合成，是機體蛋白質(zhì)的主要來源之一。血液中BUN含量可反映機體氨基酸平衡狀況[15]。本試驗中，飼料中添加抗生素和不同形式的杜仲葉對總蛋白、白蛋白和BUN影響均不顯著。因此，我們推測不同形式的杜仲葉對機體蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡均無負面影響，此推測需進一步試驗進行驗證。

氧自由基能夠通過生物膜中不飽和脂肪酸的過氧化損傷細胞，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物如MDA、羥基等，破壞細胞膜蛋白質(zhì)構(gòu)象，損傷膜蛋白功能。SOD、T-AOC和GSH-PX作為抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成部分，機體主要依靠GSH-PX和SOD等清除這些自由基或脂質(zhì)過氧化物[16]。本試驗結(jié)果與孫玉麗等[17]研究結(jié)果一致，都顯示杜仲葉提取物提高了GSH-PX含量，降低了MDA含量。另外，與杜仲葉提取物類似，杜仲葉發(fā)酵也能改善仔豬抗氧化能力，可能是由杜仲葉提取物和發(fā)酵杜仲葉所含的生物活性物質(zhì)如黃酮類化合物[18]和綠原酸[19]發(fā)揮抗氧化活性。

血清免疫球蛋白含量的高低是反映機體免疫系統(tǒng)狀態(tài)的重要指標。IgG是哺乳動物血清中含量最高的免疫球蛋白，約占總量的80%，是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，該抗體能夠抵抗外來抗原，有效地保護機體不受感染。IgM是機體初次接觸抗原物質(zhì)時最早出現(xiàn)的免疫球蛋白，在抗感染中起著關(guān)鍵作用。在機體受到病原菌和病毒感染時，IgM能與體內(nèi)補體結(jié)合，清除病原體[20]。本試驗結(jié)果表明，飼糧中添加杜仲葉提取物可顯著提高血液中IgG和IgM的含量，使其達到抗生素組水平，這說明在飼糧中添加一定水平的杜仲葉提取物可改善斷奶仔豬的體液免疫。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[6,14]。

前期報道顯示，杜仲能促進免疫器官的發(fā)育，增強機體的免疫應(yīng)答能力，從而提高機體的抵抗力[21]。本研究中，添加杜仲葉提取物可顯著提高仔豬肝臟指數(shù)，而肝臟和脾臟重量以及肝臟和脾臟指數(shù)在抗生素組、杜仲葉發(fā)酵組和杜仲葉干粉組中無顯著差異，這表明杜仲葉提取物可顯著促進仔豬肝臟的發(fā)育，改善其免疫功能。關(guān)于杜仲葉提取物促進仔豬肝臟發(fā)育的機制，有待進一步深入探究。

本研究證實了飼糧中添加杜仲葉提取物可降低斷奶仔豬腹瀉率，提高日增重和改善其料重比，且部分改善抗氧化能力和免疫功能，從而提高斷奶仔豬的生長性能，其效果優(yōu)于杜仲葉發(fā)酵或干粉，并具備一定的抗生素替代潛力。