王存琴，陳 穎，汪 雷，崔巧玉，段名揚，陳國軍

皖南醫(yī)學院藥學院，蕪湖 241002

大葉冬青(IlexlatifoliaThunb.)，為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(Ilex)常綠喬木，主要生長在海拔900 m以下的溝谷常綠闊葉林中，在我國安徽、江蘇、浙江、江西、福建、湖南、廣西、廣東等地均有分布[1]。藥用其葉，常于秋冬二季采收。大葉冬青主要含有多酚類、三萜及其皂苷、揮發(fā)油等化學成分[2-8]。作為苦丁茶的主要來源之一，大葉冬青可用于治療口齒疼痛、熱性痢疾、目赤腫痛、熱病煩渴等癥[9,10]?，F(xiàn)代研究表明，抗氧化作用是大葉冬青的主要藥理活性之一，其作用的主要物質(zhì)基礎是所含的多酚類成分[12-18]。然而，目前大葉冬青葉中多酚類成分的含量測定研究甚少，尤其缺乏同時測定大葉冬青葉中多種多酚類成分含量的方法，相關質(zhì)量評價標準的缺乏，影響了大葉冬青的開發(fā)和利用；同時，大葉冬青葉抗氧化作用與多酚類成分含量之間的相關性研究未見報道，影響了大葉冬青的藥用質(zhì)量和安全。本課題組擬在前期研究工作基礎上[2-7,11]，建立HPLC同時測定大葉冬青葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C 10種多酚類成分的定量分析方法，并以大葉冬青抗氧化活性為檢測指標，初步探討不同產(chǎn)地大葉冬青葉抗氧化活性與10種多酚類成分總含量間的相關性，從藥效和含量兩方面全面評價大葉冬青藥材的質(zhì)量，以便較為全面地反映大葉冬青藥材的品質(zhì)，為其質(zhì)量標準的建立和臨床應用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ(配二極管陣列檢測器、四元泵、自動進樣器)(安捷倫科技有限公司)，Agilent HC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷倫科技有限公司)，AUW220D型1/10萬電子天平(日本島津)，RHP-400A型高速多功能粉碎機(浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司)，KQ5200E型超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)，GKC型數(shù)顯控溫水浴鍋(上海波絡實驗設備有限公司)。

1.2 材料

新綠原酸(批號PS13122601-1，純度大于98.00%)、綠原酸(批號PS14050901，純度大于98.50%)、隱綠原酸(批號PS14011403，純度99.06%)、咖啡酸(批號PS161221-01，純度大于98.00%)、蘆丁(批號PS160113-02，純度大于等于95.00%)、異槲皮苷(批號PS13061301，純度99.77%)、異綠原酸B(批號PS13111502，純度大于98.50%)、異綠原酸A(批號PS13111501，純度大于98.00%)和異綠原酸C(批號PS13110401，純度大于98.50%)對照品均購自成都普思生物科技有限公司；對羥基肉桂酸(批號D-032-161216，純度大于等于98%)購自上海喬羽生物科技有限公司。色譜乙腈(德國，默克股份有限公司)，色譜甲醇(天津市科密歐化學試劑有限公司)，水為娃哈哈飲用純凈水，磷酸(天津市福晨化學試劑廠)，乙醇(無錫市蘇強化工有限公司)，DPPH(梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)。

實驗用大葉冬青藥材23批，于2017年實地采集，經(jīng)安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校汪榮斌副教授鑒定為冬青科冬青屬植物大葉冬青I.latifolia的葉，見表1。標本均保存于皖南醫(yī)學院藥學院。選擇其中來自不同產(chǎn)地的5個批次大葉冬青葉，分別是第3、7、11、13、14號進行抗氧化活性試驗(見表5)。

表123批藥材產(chǎn)地、采收時間表

Table 1 Sources of 23 batches of sample from different producing areas and harvest times

編號No.來源Source采收時間Harvest timeS1安徽南陵縣2017.10S2安徽南陵縣2017.10S3安徽南陵縣2017.10S4安徽石臺縣2017.10S5安徽石臺縣2017.10S6安徽石臺縣2017.10S7安徽石臺縣2017.10S8安徽石臺縣2017.10S9安徽石臺縣2017.10S10安徽石臺縣2017.10S11廣西南寧市2017.10S12廣西南寧市2017.10S13安徽祁門縣2017.10S14安徽蕪湖市2017.01S15安徽蕪湖市2017.03S16安徽蕪湖市2017.05S17安徽蕪湖市2017.06S18安徽蕪湖市2017.07S19安徽蕪湖市2017.08S20安徽蕪湖市2017.09S21安徽蕪湖市2017.10S22安徽蕪湖市2017.11S23安徽蕪湖市2017.12

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC同時測定大葉冬青葉中10種多酚類成分的含量

2.1.1 色譜條件

采用Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相為0.2%磷酸乙腈(A)-0.2%磷酸水(B)進行梯度洗脫，洗脫程序：0～15 min，10% A；15～16 min，10%～16% A；16～30 min，16% A；30～31 min，16%～18% A；31～50 min，18 % A；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；檢測波長320 nm；進樣量為10 μL。在上述色譜條件下，供試樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C色譜峰的保留時間與對照品保持一致。對照品溶液和供試樣品溶液HPLC圖(見圖1)。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品新綠原酸10.92 mg，綠原酸18.36 mg，隱綠原酸10.92 mg，蘆丁29.80 mg，異槲皮苷5.08 mg，異綠原酸B 11.28 mg，異綠原酸A 5.82 mg，異綠原酸C 4.06 mg，咖啡酸2.08 mg，對羥基肉桂酸1.60 mg混合置于20 mL容量瓶中，用50%甲醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得混合對照品儲備溶液。質(zhì)量溶度分別為0.546、0.918、0.546、1.490、0.254、0.564、0.291、0.20、0.104、0.08 mg/mL，4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取不同產(chǎn)地大葉冬青葉粗粉約2.0 g(過4號篩)，分別置250 mL具塞錐形瓶中，加50%甲醇125 mL，稱定重量，80 ℃超聲提取50 min，放冷，再稱定重量，加50%甲醇溶液補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液50 mL，水浴蒸干，用適量50%甲醇轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

圖1 對照品(A)與樣品(B)HPLC圖Fig.1 Chromatograms of reference standards (A) and Sample (B)注：1新綠原酸、2綠原酸、3隱綠原酸、4咖啡酸、5對羥基肉桂酸、6蘆丁、7異槲皮苷、8異綠原酸B 、9異綠原酸A、10異綠原酸C。Note:1 neochlorogenic acid,2 chlorogenic acid,3 cryptochlorogenic acid,4 caffeic acid,5 p-hydroxycinnamic acid,6 rutin,7 isoquercitrin,8 isochlorogenic acid B,9 isochlorogenic acid A,10 isochlorogenic acid C.

2.1.4 線性關系考察

精密吸取混合對照品儲備溶液適量，用50%甲醇稀釋成不同濃度的對照品溶液，按照2.1.1項下的色譜條件測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C的峰面積，平行測定3次，求得峰面積平均值，以對照品濃度(mg/mL)的常用對數(shù)為橫坐標(X)，色譜峰面積的常用對數(shù)為縱坐標(Y)，繪制標準曲線,結(jié)果見表2。

表2 大葉冬青葉10種酚酸類成分線性關系(n=6)

續(xù)表2(Continued Tab.2)

化合物Compounds回歸方程Regression equation 相關系數(shù)r線性范圍Linear range(μg/mL) IsoquercitrinY=1343.4X-2.527 20.99987.82～254.00Isochlorogenic acid BY=2866.7X-18.8940.999917.35～564.00Isochlorogenic acid AY=3211.6X+10.690.99998.95～291.00Isochlorogenic acid CY=3384.3X-5.336 10.99996.25～203.00

2.1.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，計算相對應的RSD，得出新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C對應峰面積的RSD分別為0.33%、0.12%、0.12%、0.11%、0.12%、0.18%、0.09%、0.22%、0.22%和0.21%，表明儀器精密度很好。

2.1.6 重復性試驗

精密稱取同一樣品(S13)，按2.1.3項下方法平行制備6份供試品溶液，照2.1.1項下色譜條件，分別進樣10 μL，測定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的色譜峰面積，計算平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.17%、0.75%、0.23%、0.003 7%、0.001 8%、0.50%、0.072%、0.060%、0.049%、0.068%，其RSD分別為0.91%、0.77%、1.02%、4.46%、4.54%、2.57%、1.64%、2.35%、2.58%、1.73%，結(jié)果表明該方法重復性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗

精密稱定大葉冬青藥材粉末約2.0 g，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，照2.1.1項色譜條件操作，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后進樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C對應峰面積的RSD分別為1.27%、1.18%、2.90 %、1.43%、1.04%、1.40%、0.97%、1.08%、1.84%、2.66%。說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的大葉冬青樣品(S13)6份，精密加入對照品適量，按2.1.3項所述的制備方法制備供試品溶液，照2.1.1項條件進行含量測定，計算10種成分的平均回收率及RSD，結(jié)果見表3。10種待測的成分的平均回收率在96.58%～112.03%，RSD均小于4.0%，表明方法的回收率良好。

表3 大葉冬青葉中10種成分的質(zhì)量分數(shù)及對應RSD(n=6)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

化合物Compounds樣品中量Amount in sample(mg)加入量Amount added(mg)測的量Measured quantity(mg)回收率Recovery rate(%)平均回收率Average recovery rate(%)RSD (%)隱綠原酸4.54752.10006.6965100.7499.810.87Cryptochlorogenic acid4.46322.10006.555599.894.50602.10006.6675100.934.41762.10006.477099.384.40492.10006.441599.024.46362.10006.490598.89咖啡酸0.07100.40250.4812101.64101.571.03Caffeic acid0.07470.40250.4794100.460.07560.40250.4820100.810.07950.40250.4862100.870.07120.40250.4866102.700.07410.40250.4907102.96對羥基肉桂酸0.03820.30750.3858111.60112.033.26P-hydroxycinnamic acid0.03710.30750.3614104.870.03600.30750.3896113.390.03370.30750.3872113.490.03380.30750.3897114.170.03670.30750.3946114.64蘆丁9.92445.730015.6700100.10100.520.38Rutin9.84275.730015.6275100.359.79155.730015.5365100.109.19485.730015.0670100.959.78695.730015.6420100.819.44505.730015.2950100.79異槲皮苷1.41290.97552.4825103.85103.891.02Isoquercitrin1.45460.97552.4860102.221.43720.97552.4925103.231.36410.97552.4480104.551.40370.97552.5055105.231.39080.97552.4700104.29異綠原酸B1.22952.17003.5625104.79107.521.86Isochlorogenic acid B1.22582.17003.5785105.371.17472.17003.6115107.981.15222.17003.5925108.141.16042.17003.6355109.161.17192.17003.6655109.68異綠原酸A0.99561.12002.050596.93101.333.60Isochlorogenic acid A0.99451.12002.056597.230.95961.12002.1265102.26

續(xù)表3(Continued Tab.3)

化合物Compounds樣品中量Amount in sample(mg)加入量Amount added(mg)測的量Measured quantity(mg)回收率Recovery rate(%)平均回收率Average recovery rate(%)RSD (%)0.92911.12002.0965102.320.92551.12002.1785106.500.95881.12002.1355102.72異綠原酸C1.27600.78252.1715105.49100.483.25Isochlorogenic acid C1.26230.78252.0605100.761.42090.78252.133096.801.34260.78252.059596.921.34800.78252.1645101.601.40640.78252.2180101.32

2.1 .9 樣品含量測定

按2.1.3項下方法制備供試品溶液，照2.1.1項色譜條件進行測定，記錄峰面積，用外標法計算23批大葉冬青藥材中10種化合物的含量，見表4，圖2和圖3。

表4 23批大葉冬青葉藥材中10種成分的質(zhì)量分數(shù)

續(xù)表4 23批大葉冬青葉藥材中10種成分的質(zhì)量分數(shù)

2.2 DPPH法測定大葉冬青葉的抗氧化活性

DPPH在含有自由基的化學反應中作為一種監(jiān)測反應的物質(zhì)，典型的用于抗氧化成分的體外抗氧化活性評價[19]。本實驗選擇廣泛用于定量測定生物試樣和食品抗氧化能力的DPPH法進行大葉冬青葉的抗氧化活性測定。

2.2.1 溶液的制備

DPPH·乙醇溶液：精密稱取DPPH粉末9.85 mg至250 mL棕色容量瓶中，加200 mL無水乙醇，超聲30 min后加無水乙醇定容至刻度，搖勻，分別制成0.10 mmol/L的DPPH·乙醇溶液。避光，備用。

大葉冬青樣品溶液:①供方法學考察，取大葉冬青粉末約0.6 g，精密稱定，置250 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液200 mL，稱定重量，80 ℃超聲提取50 min，放冷，再稱定重量，加50%甲醇溶液補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液100 mL，水浴蒸干，定容至50 mL容量瓶中，作為大葉冬青儲備液，質(zhì)量濃度6.0 g/L(藥材)。②供活性測定，分別取不同體積的大葉冬青儲備液，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，制成藥材質(zhì)量濃度分別為5.40、4.80、4.20、3.60、3.00、2.40、1.80、1.20 g/L(藥材)的安徽南陵產(chǎn)大葉冬青50%甲醇提取液，藥材質(zhì)量濃度分別為1.05、0.90、0.75、0.60、0.45、0.30 g/L(藥材)的安徽蕪湖產(chǎn)大葉冬青50%甲醇提取液，藥材質(zhì)量濃度分別為1.80、1.50、1.20、0.90、0.60、0.30 g/L(藥材)的安徽石臺產(chǎn)大葉冬青50%甲醇提取液，藥材質(zhì)量濃度分別為1.80、1.50、1.20、0.90、0.60、0.30 g/L(藥材)的安徽祁門大葉冬青50%甲醇提取液和藥材質(zhì)量濃度分別為0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.05 g/L(藥材)的廣西南寧大葉冬青50%甲醇提取液，備用。③空白樣品溶液，取6 mL無水乙醇與1.0 mL 50%甲醇溶液，置15 mL具塞刻度試管中，混勻，即得。

2.2.2 測定方法[20]

取0.10 mmol/L DPPH·乙醇溶液6 mL，置15 mL具塞刻度試管中，分別加入不同濃度大葉冬青樣品溶液1.0 mL，搖勻，反應65 min后，將6 mL無水乙醇與1.0 mL 50%甲醇溶液作為空白組，6 mL DPPH·乙醇溶液與1.0 mL 50%甲醇溶液作為對照組。在紫外-可見分光光度計517 nm波長下測定其吸光度，并計算自由基清除率。自由基清除能力計算公式如下：清除率=[1-(Asample-Ablank) /Acntrol]× 100%。

2.2.3 抗氧化能力的測定

分別取不同產(chǎn)地的大葉冬青藥材，按2.2.1項下方法制備大葉冬青50%甲醇溶液，照2.2.2項下方法進行測試，得到不同藥材濃度下各溶液的吸光度，并計算清除率及IC50值(見表5)。

表5 不同產(chǎn)地大葉冬青抗氧化能力測定

2.2.4 大葉冬青抗氧化能力與10種多酚類成分含量相關性初步分析

結(jié)合表4和表5分析，5批不同產(chǎn)地大葉冬青樣品中10種多酚成分總含量較高者，對應IC50相應較低，其抗氧化活性相對較好，其中安徽蕪湖一月份采集樣品中總多酚含量最高，抗氧化活性最好，IC50值最低。廣西南寧采集樣品10種多酚成分總含量比安徽石臺樣品含量略低，但其抗氧活性優(yōu)于安徽石臺樣品，通過對這兩個產(chǎn)地大葉冬青葉10種多酚類成分含量比對發(fā)現(xiàn)，廣西南寧樣品中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸三者含量均高于安徽石臺樣品。進一步分析5批不同產(chǎn)地(3、7、11、13、14號)大葉冬青葉中10種多酚類成分含量差異，結(jié)果顯示新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸三者含量高者抗氧化活性好。據(jù)此推測，大葉冬青葉抗氧化能力大小與10種多酚成分總含量有關，其中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸三者含量對大葉冬青葉抗氧化能力大小影響較大。

3 結(jié)論

本文建立了HPLC同時測定大葉冬青葉中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸、蘆丁、異槲皮苷、異綠原酸B、異綠原酸A和異綠原酸C 10種多酚類成分含量的方法。以10種多酚類成分總含量和浸出物含量為考察指標，比較不同超聲時間(30、50、80 min)，不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水)，不同超聲溫度(30、60、80 ℃)對提取效率的影響，最終選擇50%甲醇為提取溶劑，溫度為80 ℃，提取時間50 min作為供試品的最佳提取條件?？疾靁MC-ODS C18、Agilent HC-C182種型號色譜柱對各待測成分的分離效能，結(jié)果表明Agilent HC-C18色譜柱可以獲得較為平穩(wěn)的基線，且各待測成分峰形和分離度較好，保留時間較穩(wěn)定。比較了甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、0.2%磷酸乙腈-0.2%磷酸水溶液系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果表明，以0.2%磷酸乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，在流速1.0 mL/min的情況下，10種化學成分出峰時間在50 min以內(nèi)，并與相鄰峰的分離度良好。比較了各待測成分在280、320、328 nm處吸收情況，結(jié)果表明10種成分在320 nm處有較大吸收，且色譜圖的基線較為平穩(wěn)，故選擇320 nm作為檢測波長。

通過建立的該方法對不同產(chǎn)地、不同采收期的23批大葉冬青樣品中10種多酚類成分的含量進行測定，結(jié)果顯示，10種多酚類成分總含量主要以新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸為主，不同產(chǎn)地、不同采收時間大葉冬青葉中10種多酚類成分的含量總和存在一定差異。同時采自10月份的5個不同產(chǎn)地樣品比較發(fā)現(xiàn)，采自安徽石臺和廣西南寧的樣品中總多酚含量較高，其次是安徽蕪湖、安徽祁門和安徽南陵。比較了采自安徽蕪湖不同采收時期的10批大葉冬青樣品，其中6批樣品(采收時間：8、9、10、11、12、1月)總多酚含量高于其他月份采集樣品，說明大葉冬青葉適合秋冬季節(jié)采收，此時有效成分累積達到高峰。

對大葉冬青葉抗氧化活性與10種多酚類成分總含量相關性分析發(fā)現(xiàn)，大葉冬青50%甲醇提取液抗氧化活性與10種多酚類成分總含量基本呈正相關，其中新綠原酸、綠原酸和隱綠原酸三者與抗氧化活性成正相關，可能是大葉冬青抗氧化活性的主要有效成分。

綜上所述，單獨從多酚類化合物的含量不能準確評價大葉冬青藥材的質(zhì)量情況。將抗氧化活性測定與總多酚含量測定結(jié)果兩方面相結(jié)合，可更加全面反映大葉冬青藥材的質(zhì)量。此外，目前對大葉冬青藥材質(zhì)量標準的研究很少，缺乏相關的質(zhì)量控制標準，影響到大葉冬青藥材臨床應用的安全性和可靠性。因此，本實驗的研究可為大葉冬青藥材質(zhì)量標準的制定提供科學依據(jù)。