王曉桃，何玉嬋，王航飛，陽(yáng)少芳，張俊艷，高彤彤，吳春葉

(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，廣西桂林 541199)

骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)是多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者常見(jiàn)的并發(fā)癥。MBD以進(jìn)行性骨質(zhì)破壞、多發(fā)溶骨性病變等為特征，是MM患者致殘的主要原因。研究表明，有70%左右的患者因MBD而危及生活質(zhì)量并增加死亡風(fēng)險(xiǎn)，給家庭及社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)[1]。因此，深入研究MBD發(fā)生機(jī)制，可為靶向治療MBD奠定理論基礎(chǔ)。

MBD發(fā)生的主要機(jī)制是在骨髓微環(huán)境中，瘤細(xì)胞與骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)通過(guò)多條信號(hào)通路導(dǎo)致破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)活性增強(qiáng)和成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)活性減弱，造成溶骨性損害，阻礙新骨生成[2-3]。本課題組的前期研究已證實(shí)，巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)能激活OC，介導(dǎo)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，并在MBD的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。最新研究發(fā)現(xiàn)，MIP-1α有抑制OB的作用[5]，但其具體機(jī)制不明確。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，大部分MM患者骨髓中MIP-1α和骨硬化蛋白(sclerostin，Scl)水平增高，兩者呈明顯的正相關(guān)[6]，Scl是Wnt/β-catenin通路的重要抑制劑[7]，β-catenin與T細(xì)胞因子相互作用，誘導(dǎo)OB堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性，促進(jìn)前體OB的生長(zhǎng)和早期分化、細(xì)胞外基質(zhì)成熟和礦化[8]。因此，本研究擬通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MIP-1α促進(jìn)瘤細(xì)胞表達(dá)Scl，從而抑制OB的分化與成熟、細(xì)胞外基質(zhì)成熟和礦化促進(jìn)OB凋亡，導(dǎo)致MBD的發(fā)生、發(fā)展。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇來(lái)自2015年1-12月本科室新確診的6例MBD患者，其中男4例，女2例，中位年齡64歲(47～73歲)。入選病例均按照國(guó)際骨髓瘤工作組的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為活動(dòng)性MM，如并發(fā)MBD癥狀的MM患者均需行X線片檢查骨盆、顱骨、肱骨、股骨等確診不同程度的MBD，如無(wú)MBD相關(guān)癥狀的MM患者需行全身低劑量CT或胸椎、腰椎MRI以明確有無(wú)并發(fā)MBD。所有入選患者均簽署知情同意書(shū)。細(xì)胞株：高表達(dá)MIP-1α和Scl的人骨髓瘤H929細(xì)胞(購(gòu)自天津血液病研究所[6])及MBD患者BMSCs分化成熟的第3代OB為研究對(duì)象。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器 胎牛血清、小牛血清、DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640干粉均購(gòu)自杭州四季青公司，淋巴細(xì)胞分離液、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所第一分所)，Bradford法蛋白定量試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅染色液(美國(guó)Sigma公司)。ALP改良鈣鈷法染液(南京建成科技有限公司)；MIP-1α和Scl ELISA試劑盒(美國(guó)Gibco公司)；MIP-1α和Scl蛋白，鼠抗人MIP-1α、Scl、IL-6和ALP單克隆抗體，免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Annexin V FITC細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒(美國(guó)R&D公司)；凝膠電泳儀、酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Rad公司)，IX73 倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分5組：對(duì)照組：常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng);MIP-1α組：培養(yǎng)基加0.2 ng/mL MIP-1α標(biāo)準(zhǔn)品；Scl組：培養(yǎng)基加0.2 ng/mL Scl標(biāo)準(zhǔn)品；MIP-1α單抗(MIP-1α-Ab)組：培養(yǎng)基加0.2 ng/mL MIP-1α單抗;sclerostin 單抗(Scl-Ab)組：培養(yǎng)基加0.2 ng/mL Scl單抗。

1.2.3純化并原代培養(yǎng)OB并鑒定 從MBD患者髂后上棘處抽取骨髓5～10 mL，肝素抗凝，結(jié)合全骨髓培養(yǎng)法，用等量的PBS稀釋，按1.0∶1.5比例加入紅細(xì)胞裂解液，680×g離心20 min，去除上清液，移至無(wú)菌培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)足完全培養(yǎng)基(15%胎牛血清,1%雙抗，DMEM)培養(yǎng)。5 d后首次換液，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞開(kāi)始變?yōu)樗笮?、貼壁，后每3天換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿視野70%～80%后首次傳代，經(jīng)0.25%胰酶消化，并接種于六孔板，改為OB誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(1×10-8mol/L地塞米松、50 g/mL抗壞血酸及10 mmol/L β-甘油磷酸)。每3天換液1次，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，行茜素紅染色，ALP免疫組織化學(xué)鑒定為OB后方可進(jìn)行傳代培養(yǎng)并留做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4茜素紅染色鑒定并觀察鈣離子沉積結(jié)節(jié) BMSCs分化的OB培養(yǎng)14 d后，換液，種至6孔板，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定30 min后，再用PBS沖洗3次，用0.1%茜素紅-Tris-HCl染色30 min，PBS沖洗，干燥，封固后，倒置相差顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)。

1.2.5OB的定性檢查 改良Gomori鈣鉆法ALP染色，倒置相差顯微鏡觀察。ALP陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黑色片狀顆粒。

1.2.6H929細(xì)胞傳代培養(yǎng) H929細(xì)胞在含10%澳洲胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)、5%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)。

A：BMSCs分離純化培養(yǎng)10 d；B：BMSCs分離純化培養(yǎng)14 d；C：茜素紅染色BMSCs分離純化培養(yǎng)14 d的OB；D：ALP染色BMSCs分離純化培養(yǎng)14 d的OB

圖1 BMSCs分離培養(yǎng)純化OB(×40)

1.2.7ELISA定量檢測(cè)H929細(xì)胞上清液中的MIP-1α和Scl水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的H929細(xì)胞，離心棄上清液，用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/mL，為防止其他細(xì)胞因子的干擾，加入終濃度為1.0 ng/mL的鼠抗人IL-6單克隆抗體，靜置4 h，以中和骨髓瘤細(xì)胞分泌的主要生長(zhǎng)因子IL-6，棄上清液，PBS沖洗3次，按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集各組的上清液，用MIP-1α、Scl ELISA試劑盒定量檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中的MIP-1α、Scl水平，ELISA具體檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.8各組OB活性定量檢測(cè) OB按1×105/mL種于六孔板中培養(yǎng)2 d，PBS沖洗2次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組予以更換相應(yīng)的培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后棄上清液，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，置于離心管,680×g離心10 min，去上清液，加TritonX-100裂解液1 mL，反復(fù)凍融3次(凍約30 min，融約3 min)取出樣品，按ALP試劑盒說(shuō)明書(shū)配制測(cè)定管、標(biāo)準(zhǔn)管和空白管，每個(gè)管混勻后37 ℃水浴10 min，再加上顯色劑，立即混勻，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)520 nm下進(jìn)行比色，測(cè)定各組細(xì)胞ALP活性，并用Bradford法進(jìn)行細(xì)胞蛋白標(biāo)準(zhǔn)化(按蛋白檢測(cè)試劑盒說(shuō)明操作)，最后用ALP/總蛋白的值計(jì)數(shù)ALP[單位:比活性(U/mg)]。

1.2.9Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中的ALP蛋白的表達(dá) 按1.2.3方法鑒定OB后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代OB按1×105/mL加入6孔培養(yǎng)板，按實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按凱基全蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取第3代OB的總蛋白，再按BCA蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)定量后于-20 ℃保存。取30 μg總蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗ALP(1∶500)一抗、GAPDH(1∶600)，冰箱4 ℃孵育過(guò)夜，室溫培育1 h，TBST溶液清洗3遍，每遍5 min，TBST洗膜后用ECL法顯影。條帶用Imαge J軟件分析，測(cè)定灰度值。目的條帶與對(duì)應(yīng)的GAPDH條帶的灰度比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.10流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)OB凋亡率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代OB置入10%小牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106/mL，按實(shí)驗(yàn)分組再在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中共同培育24 h后，收集細(xì)胞約5×106個(gè)進(jìn)行如下操作：用Binding Buffer洗1次，室溫804.96×g離心10 min，收集細(xì)胞；洗滌后用100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC，避光孵育20 min，再加10 μL碘化丙啶(PI，濃度為1 mg/mL)室溫下避光孵育15 min，Binding Buffer洗滌、重懸，立即上FCM檢測(cè)，每個(gè)樣品至少檢測(cè)5×106個(gè)細(xì)胞。利用Cell Quest功能軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和數(shù)據(jù)分析。每組樣品重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1OB鑒定及傳代 原代BMSCs培養(yǎng)5 d換液后，即可觀察到貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)短小，呈長(zhǎng)梭型，細(xì)胞之間無(wú)突起連接，培養(yǎng)至第10天，細(xì)胞明顯增多、變長(zhǎng)、變大，長(zhǎng)梭型形態(tài)更加明顯，見(jiàn)圖1。培養(yǎng)至第14天時(shí)，細(xì)胞基本鋪滿皿底，細(xì)胞排列呈螺旋狀，長(zhǎng)梭型。經(jīng)茜素紅染色發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)14 d后的OB能見(jiàn)到少部分鈣離子沉淀結(jié)節(jié)，ALP染色可發(fā)現(xiàn)OB細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中有棕褐色顆?；虼笃瑺畛恋砦矬w，顯示 ALP 染色陽(yáng)性，符合OB的特征。

2.2H929細(xì)胞上清液中MIP-1α和Scl的水平 按實(shí)驗(yàn)分組檢測(cè)各組H929細(xì)胞上清液中MIP-1α和Scl蛋白水平，結(jié)果顯示，MIP-1α組上清液中的MIP-1α和Scl的水平明顯高于對(duì)照組(t=6.42、3.56，P=0.000、0.012)，MIP-1α-Ab組上清液中的MIP-1α、Scl水平明顯低于對(duì)照組(t=3.42、2.78P,P=0.001、0.012)；而Scl及Scl-Ab組中的MIP-1α水平較對(duì)照組增減不明顯(t=0.618、0.744，P=0.552、0.474)、Scl水平較對(duì)照組增減明顯(t=6.97、3.17，P=0.000、0.013)，見(jiàn)表1。

2.3各組OB的鈣離子沉積結(jié)節(jié)分析 運(yùn)用茜素紅染色鈣離子沉積結(jié)節(jié)以檢測(cè)OB外基質(zhì)成熟情況，按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)至第6天，發(fā)現(xiàn)MIP-1α、Scl組較對(duì)照組鈣離子沉積結(jié)節(jié)減少(P<0.05)。MIP-1α-Ab、Scl-Ab組鈣離子沉積結(jié)節(jié)較對(duì)照組明顯增多(P<0.05)。但各組形態(tài)變化不顯著，見(jiàn)表2、圖2。

表1 各組細(xì)胞上清液中的MIP-1α、Scl水平

a：P<0.05，b：P<0.01,與對(duì)照組比較

A:對(duì)照組；B:MIP-1α組；C:Scl組；D:MIP-1α-Ab組；E:Scl-Ab組

圖2 不同組OB的鈣離子沉積結(jié)節(jié)(×40)

2.4各組OB的ALP活性 MIP-1α-Ab、Scl-Ab組的OB較對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)快，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形更明顯，有的呈纖維樣生長(zhǎng)，細(xì)胞體積增大、而MIP-1α-Ab、Scl-Ab組的OB較對(duì)照組生長(zhǎng)慢，細(xì)胞較短小，有的呈多角形，呈樹(shù)枝狀突起。經(jīng)ALP 活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)后，ALP蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)和核均出現(xiàn)棕黑色顆粒。定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MIP-1α-Ab、Scl-Ab組中OB的ALP的活性明顯高于對(duì)照組(均P<0.01)。而MIP-1α、Scl組中OB的ALP的活性明顯低于對(duì)照組(均P<0.01)，見(jiàn)表2。

圖3 Western blot檢測(cè)各組OB的ALP蛋白質(zhì)表達(dá)

A:對(duì)照組；B:MIP-1α組:C Scl組;D:MIP-1α-Ab組;E:Scl-Ab組；F:凋亡率分析;a:P<0.05,與對(duì)照組比較

圖4 各組OB細(xì)胞的凋亡率

表2 不同組成骨細(xì)胞的鈣沉積結(jié)節(jié)

a：P<0.05，b：P<0.01,對(duì)照組比較

2.5各組OB的ALP蛋白表達(dá)水平 Western blot檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)至第6天發(fā)現(xiàn)MIP-1α、Scl組OB中ALP蛋白的灰度值較對(duì)照組表達(dá)減少，MIP-1α-Ab、Scl-Ab組OB ALP蛋白的灰度值較對(duì)照組表達(dá)明顯增多，見(jiàn)圖3。

2.6各組OB的凋亡率 FCM檢測(cè)顯示，MIP-1α、Scl組的OB凋亡率明顯高于對(duì)照組(t=2.19,P=0.02)，MIP-1α-Ab、Scl-Ab組的OB凋亡率明顯低于對(duì)照組(t=3.12，P<0.01)，見(jiàn)圖4。

3 討 論

MBD的發(fā)生、發(fā)展是多因子、多信號(hào)通路相互作用的結(jié)果，本團(tuán)隊(duì)既往研究發(fā)現(xiàn)MIP-1α在MBD的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用，并與Scl具有一定的關(guān)聯(lián)性。但它們之間到底如何影響并不清楚。體外研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)MIP-1α和Scl的MM細(xì)胞株H929，加入MIP-1α試劑后，H929細(xì)胞株表達(dá)更多的Scl。但當(dāng)加入Scl后，細(xì)胞表達(dá)的MIP-1α并不增加，說(shuō)明MIP-1α可能通過(guò)不同方式促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)Scl，而Scl并不促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)MIP-1α。反之運(yùn)用同樣的方法，在高表達(dá)MIP-1α和Scl的H929細(xì)胞中加入MIP-1α-Ab中和MIP-1α后，細(xì)胞的MIP-1α和Scl水平均下降，而加入Scl-Ab中和Scl后，細(xì)胞的MIP-1α水平卻并不下降，這說(shuō)明了抑制MIP-1α表達(dá)，也會(huì)影響骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)Scl；而抑制骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)Scl，則并不影響骨髓瘤細(xì)胞分泌MIP-1α。這也間接說(shuō)明了骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)Scl可能受MIP-1α調(diào)控。

MIP-1α如何促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞分泌Scl，經(jīng)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均未見(jiàn)明確報(bào)到。有研究報(bào)道將人骨髓瘤細(xì)胞系移植給鼠構(gòu)建鼠骨髓瘤模型，發(fā)現(xiàn)其血漿中鼠源性Scl水平增高，說(shuō)明Scl可能是由骨髓微環(huán)境產(chǎn)生的[9-10]。也可能是在MM患者中，骨髓瘤細(xì)胞與局灶的破骨祖細(xì)胞直接接觸、相互黏附后，通過(guò)多種途徑促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞表達(dá)Scl[11]。也有可能骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)多種途徑激活毗鄰的破骨祖細(xì)胞，局灶增多的破骨細(xì)胞(OC)會(huì)促進(jìn)骨細(xì)胞分泌Scl增多。還有學(xué)者認(rèn)為Scl是由破骨祖細(xì)胞產(chǎn)生的[12]，而MIP-1α是一種非常重要的OC激活因子。因而，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，骨髓瘤細(xì)胞通過(guò)自分泌或旁分泌途徑分泌MIP-1α，當(dāng)MIP-1α與受體結(jié)合后，使核因子κB(NF-κB)受體激動(dòng)劑配體ligand of receptor activator of nuclear factor kappa B，RANKL)表達(dá)增高，增高的RANKL與骨髓巨噬細(xì)胞(bone marrow macrophages，BMM)膜上的RANK受體結(jié)合，再通過(guò)膜內(nèi)部分特定區(qū)域激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)BMSCs分化破骨祖細(xì)胞增多，導(dǎo)致Scl增多。

Scl是SOST基因精細(xì)編碼的一種糖蛋白，是骨細(xì)胞分泌的重要信號(hào)分子，參與骨形成調(diào)節(jié)，決定骨重建過(guò)程中的骨量和結(jié)構(gòu)。在MBD患者BMSCs分化OB的體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)加入MIP-1α和Scl干預(yù)時(shí)，OB的凋亡率增加，鈣離子沉積及ALP活性均下降；而加入MIP-1α和Scl單抗干預(yù)時(shí)OB凋亡率則減少，鈣離子沉積及ALP的活性則增加，這說(shuō)明MIP-1α和Scl可能抑制成骨祖細(xì)胞向OB分化、增殖，減弱細(xì)胞外基質(zhì)的成熟及礦化作用，促進(jìn)OB凋亡。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)可推測(cè)MIP-1α抑制OB分化與成熟的機(jī)制可能是通過(guò)其促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞分泌Scl來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Scl是 Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑，Scl水平增高可直接減弱骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)的活性，抑制骨細(xì)胞的生成[13]，Scl還可抑制Fra-1基因表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性，從而導(dǎo)致APL、骨鈣素(BGP)、Ⅰ型膠原和膠原酶等基因活性下降影響骨基質(zhì)的形成[14]；Scl可直接抑制Wnt/β-catenin及下游的信號(hào)通路，導(dǎo)致OB數(shù)量下降，骨量降低，細(xì)胞外基質(zhì)成熟障礙、礦化降低。Scl還上調(diào)RANKL的表達(dá)，增加OC形成，抑制OB的分化成熟。本團(tuán)隊(duì)在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在晚期MBD患者中，骨髓瘤細(xì)胞負(fù)荷較高時(shí)，骨髓瘤細(xì)胞分泌的Scl可使RhoA/ROCK1信號(hào)途徑失活。ROCK1蛋白質(zhì)序列中含有Erk1/2結(jié)合結(jié)構(gòu)域，當(dāng)Scl抑制ROCK1時(shí)，就會(huì)暴露Erk1/2，從而啟動(dòng)Bax凋亡通路，促進(jìn)OC凋亡。從而導(dǎo)致MBD的發(fā)生、發(fā)展[15]。當(dāng)加入MIP-1α和Scl單抗時(shí)，可能克服骨髓瘤細(xì)胞抑制Runx2表達(dá)，防止OB和骨細(xì)胞凋亡[16]；加入單抗后，還可降低骨髓瘤細(xì)胞分泌RANKL，直接抑制破骨細(xì)胞前體分化，從而潛在地有助于OB的功能恢復(fù)[17]。這也間接地說(shuō)明MIP-1α和Scl可導(dǎo)致MBD的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，MIP-1α可通過(guò)促進(jìn)MM患者的骨髓瘤細(xì)胞分泌Scl，Scl通過(guò)多種途徑抑制MM患者BMSCs向OB的分化、成熟，促進(jìn)其凋亡，參與MBD的發(fā)生發(fā)展，MIP-1α和Scl單抗可促進(jìn)MBD患者OB的功能恢復(fù)和數(shù)量增加，促進(jìn)MBD的改善，為MIP-1α和Scl單抗治療MBD奠定基礎(chǔ)，但其詳細(xì)的作用途徑及具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。