鄧 萌，宋亞楠，程 宇，李 青，張 翔，王 歡，吳凱峰，劉曉麗，鄭興惠，黃 波△

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院PICU，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)研究生院，貴州遵義 563000)

早產(chǎn)兒出生時(shí)肺部發(fā)育不成熟，常需要氧氣支持和機(jī)械通氣治療。然而，長(zhǎng)期暴露在高氧環(huán)境極易造成氧化應(yīng)激，形成肺纖維化，使肺部發(fā)育遲緩，最終導(dǎo)致支氣管肺發(fā)育不良(BPD)[1]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族中重要成員之一，參與基因表達(dá)，細(xì)胞增殖、凋亡等重要生命過程[2]。大量研究顯示，高氧條件下可以觸發(fā)ERK途徑[3-5]?？Х纫蛲ǔＳ糜谥委熢绠a(chǎn)兒的呼吸暫停[6-7]，一項(xiàng)回顧性研究發(fā)現(xiàn)咖啡因在預(yù)防支氣管肺發(fā)育不良(BPD)中有非常重要的功效[8]。然而，咖啡因的肺保護(hù)作用機(jī)制目前尚不清楚。本研究以早產(chǎn) Wistar 大鼠為研究對(duì)象，復(fù)制高氧肺損傷動(dòng)物模型，觀察咖啡因干預(yù)后肺纖維化情況， ERK的分布及蛋白表達(dá)，并分析咖啡因干預(yù)對(duì)早產(chǎn)鼠高氧肺損傷修復(fù)的作用及其與MAPKs/ERK信號(hào)通路的關(guān)系，以期為臨床指導(dǎo)用藥及綜合治療BPD提供重要的臨床及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年Wistar大鼠[揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2012-0004]32只，其中雄性8只，雌性24只，體質(zhì)量200～250 g。分為8組，每組雌鼠和雄鼠按3∶1合籠交配，第2天上午8:00查見陰栓記為妊娠第1天，將孕鼠分籠并于妊娠第19天時(shí)行剖宮產(chǎn)取出早產(chǎn)鼠。

1.1.2主要試劑 牛血清清蛋白(BSA，德國(guó)Roche公司)；抗兔/鼠通用型免疫組織化學(xué)試劑盒[Real EnvisionTMHRP (rabbit/mouse)，丹麥Dako公司]；Phospho-p44/42(pErk)兔多克隆抗體(美國(guó)Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 8窩(72只)早產(chǎn)大鼠出生12～24 h內(nèi)聚攏，分配給代母鼠并分為4組，即空氣+9 g/L鹽水組(A+N組)、空氣+咖啡因組(A+C組)、高氧+9 g/L鹽水組(H+N組)、高氧+咖啡因組(H+C組)，每組18只。

1.2.2高氧模型復(fù)制 H+N組和H+C組持續(xù)暴露于高氧中，A+C組和H+C組予腹腔注射咖啡因29 mg·kg-1·d-1，A+N和H+N組每天腹腔注射同等體積的9 g/L鹽水。代母鼠每24小時(shí)在4組之間更換1次，以避免氧中毒，同時(shí)排除不同組間代母鼠影響。高氧暴露在自制氧箱內(nèi)完成，氧流量5 L/min，連續(xù)檢測(cè)氧濃度(CYS-1數(shù)字測(cè)氧儀，上海嘉定電子儀器廠)，使氧濃度維持于60%～70%。早產(chǎn)大鼠高氧、空氣暴露14 d，室溫維持在24～25 ℃ ，晝夜各12 h，自由進(jìn)食進(jìn)水，每天開箱15 min進(jìn)行清掃，無水氯化鈣和生石灰吸收水蒸氣和二氧化碳并每天更換。

1.2.3肺組織收集與制備 于早產(chǎn)仔鼠出生后3、7、14 d，各組選取6只進(jìn)行取材，3.5%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔麻醉大鼠，開胸并結(jié)扎右肺，剪開左心耳，右心室注入含肝素的生理鹽水，直到左心耳流出的液體清亮為止，分離心、肺。

1.2.4肺組織指標(biāo)檢測(cè) 留取左中肺組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)進(jìn)行切片、HE染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。在100倍光鏡下進(jìn)行輻射狀肺泡計(jì)數(shù)(RAC)，每張切片計(jì)數(shù)5次，取平均值。肺濕重/干重(W/D)測(cè)定：右肺取部分組織稱濕重后置80 ℃溫箱，48 h后稱肺干重，計(jì)算肺W/D值。

1.2.5各組肺組織膠原纖維含量檢測(cè) 采用Masson染色法，NikonDSRil偏振光顯微鏡下觀察4組仔鼠各時(shí)間點(diǎn)的膠原纖維分布情況。每張切片選取5個(gè)視野，采用病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)試陽性細(xì)胞倍數(shù)(陽性細(xì)胞倍數(shù)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.2.6免疫組織化學(xué)檢測(cè)磷酸化ERK(p-ERK)在肺組織中的分布 脫蠟,水化組織切片，3%H2O2孵育5～10 min，將切片浸于0.01 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)抗原，5%BSA封閉20 min，滴加pERK抗體(1∶250)，4 ℃過夜。滴加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG，1∶1 000)，37 ℃ 孵育20 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果判定：胞核和(或)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色即為陽性細(xì)胞。

1.2.7Western blot檢測(cè)肺組織p-ERK蛋白表達(dá)水平 各組分別提取肺組織總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，再采用Western blot方法檢測(cè)肺組織p-ERK蛋白表達(dá)水平，經(jīng)發(fā)光、曝光、顯影后分析結(jié)果，內(nèi)參蛋白為β-actin，以蛋白灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組肺組織病理學(xué)觀察 A+N組、A+C組3 d時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)不規(guī)則，肺泡腔小，肺泡間隔較厚；H+N組、H+C組3 d時(shí)可見肺泡內(nèi)少量紅細(xì)胞及液體滲出，偶見炎性細(xì)胞和肺水腫表現(xiàn)。A+N組、A+C組7 d時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)逐漸清楚，無液體和炎性滲出，肺泡間隔變薄。H+N組、H+C組7 d時(shí)肺泡壁增厚，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)細(xì)胞增加，肺泡內(nèi)大量紅細(xì)胞及液體滲出，炎性細(xì)胞增多。A+N組、A+C組14 d時(shí)肺泡結(jié)構(gòu)逐漸清楚，無液體和炎性滲出，肺泡間隔變薄。H+N組、H+C組14 d時(shí)炎性滲出減少，肺間質(zhì)增厚并伴隨纖維化，見圖1。

圖1 各組3、7、14 d時(shí)肺組織病理結(jié)構(gòu)(HE染色，×200)

圖2 各組3、7、14 d時(shí)肺組織p-ERK蛋白分布(Masson染色，×200)

2.2各組肺RAC、W/D、膠原纖維含量比較 第3天，H+N組的RAC較A+C組明顯降低(P<0.05)。H+N組、H+C組的膠原纖維含量與A+N組、A+C組比較明顯提高(P<0.05)，H+N組的膠原纖維含量較H+C組更高(P<0.05)。第7、14天，H+N組、H+C組的RAC、W/D值和膠原纖維含量與A+N組、A+C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，H+N組、H+C組的RAC降低，W/D值和膠原纖維含量增高；與H+C組比較，H+N組RAC更低，W/D值和膠原纖維含量更高(P<0.05)，見表1。

2.3各組肺組織p-ERK蛋白分布 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，p-ERK蛋白陽性反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，為棕黃色顆粒狀。與A+N組、A+C組比較，高氧暴露3、7、14 d時(shí)H+N組肺組織p-ERK平均光密度值均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而H+C組p-ERK平均光密度值較H+N組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2～3。

表1 各組肺組織RAC、W/D值、膠原纖維含量比較

a：P<0.05，與A+N組比較；b：P<0.05，與A+C組比較；c：P<0.05，與H+N組比較

2.4各組肺組織p-ERK蛋白水平 Western blot結(jié)果表明，各組在3個(gè)不同的時(shí)間段ERK蛋白水平無明顯差異(圖4B)。高氧暴露第3天、第7天和第14天時(shí)，p-ERK蛋白水平在H+N組中明顯升高，與A+C組、A+N組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中在第7天水平最高；在高氧暴露第7天和第14天時(shí)，H+C組中的p-ERK蛋白水平降低，與H+N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4C。各組p-ERK/ERK比值與p-ERK蛋白水平情況表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，見圖4D。

圖3 各組3、7、14 d時(shí)肺組織p-ERK的平均光密度值

A：ERK、P-ERK、β-actin蛋白灰度條帶；B：4組ERK灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；C：4組p-ERK灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；D：4組p-ERK/ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量柱狀圖

圖4 各組ERK和p-ERK蛋白在肺組織中的表達(dá)

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，氧療及機(jī)械通氣的應(yīng)用使早產(chǎn)兒存活率明顯提升，但過度或高濃度的氧氣治療極易導(dǎo)致BPD發(fā)生。近年來BPD在存活的早產(chǎn)兒中發(fā)生率為60%以上,嚴(yán)重影響兒童的生存質(zhì)量甚至導(dǎo)致其死亡。拮抗氧化應(yīng)激，抑制肺組織纖維化被認(rèn)為是減少BPD發(fā)生的重要因素，因此本研究擬對(duì)咖啡因干預(yù)早產(chǎn)鼠高氧肺損傷修復(fù)的作用及機(jī)制進(jìn)行研究。本課題組選用妊娠19 d破宮產(chǎn)仔鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，暴露于高氧環(huán)境后，其組織學(xué)變化模擬了早產(chǎn)兒的BPD[9]。通過病理切片發(fā)現(xiàn)，A+N組與A+C組中，肺組織隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸發(fā)育；高氧暴露7 d時(shí)，H+N組肺泡壁增厚，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺間質(zhì)細(xì)胞增加，肺泡內(nèi)大量紅細(xì)胞及液體滲出，炎性細(xì)胞增多，隨著高氧暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，H+N組肺間質(zhì)增厚并伴隨纖維化；咖啡因干預(yù)后，這一現(xiàn)象得以緩解。這與譚利平等[10]研究相符。

咖啡因是一種非選擇性的磷酸二酯酶(PDE)抑制劑，其在治療預(yù)防BPD中的益處是近幾年才被學(xué)界所發(fā)現(xiàn)的[11-12]。JING等[13]研究證實(shí)咖啡因通過改變?nèi)姿狲B苷環(huán)化水解酶(GCH1)和四氫生物蝶呤(BH4)水平，進(jìn)而改善內(nèi)皮一氧化氮合酶(eNOS)活性來保護(hù)新生仔鼠未成熟的肺免于高氧誘導(dǎo)的損傷。在家兔建立的高氧肺損傷模型中，也證實(shí)了咖啡因可減少肺部功能性和炎性改變[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，高氧暴露可導(dǎo)致仔鼠肺組織中RAC降低，W/D值與膠原纖維含量增加，而咖啡因干預(yù)后可明顯抑制這些現(xiàn)象，這充分說明高氧暴露可增加早產(chǎn)仔鼠肺部炎性反應(yīng)和肺組織纖維化，使肺發(fā)育受阻，咖啡因干預(yù)后炎性反應(yīng)和肺組織纖維化程度減輕。

MAPKs是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的中間體，包括ERK、c-Jun、P38和ERK5 4種不同級(jí)聯(lián)反應(yīng)，ERK作為其重要成員廣泛參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。高氧刺激可以激活ERK，這種現(xiàn)象通常歸因于細(xì)胞活性氧(ROS)生成[15]。LI等[16]利用吉非替尼抑制ERK激酶磷酸化拮抗博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化，說明ERK信號(hào)通路激活可以使肺組織纖維化。因此，能否抑制ERK信號(hào)通路的激活成為拮抗高氧誘導(dǎo)肺損傷的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高氧暴露后p-ERK水平明顯升高，咖啡因干預(yù)使p-ERK水平降低，說明高氧暴露使ERK信號(hào)通路激活，而咖啡因可以抑制這一現(xiàn)象。綜合病理切片、RAC、W/D值和膠原纖維含量結(jié)果，本研究認(rèn)為高氧暴露后，ERK信號(hào)通路被激活，導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)炎性反應(yīng)，肺纖維化程度增加；咖啡因干預(yù)后，通過降低p-ERK水平，抑制ERK信號(hào)通路激活，從而抑制肺組織纖維化來行使在早產(chǎn)仔鼠高氧肺損傷時(shí)的保護(hù)作用。

本研究雖然明確了咖啡因可通過抑制ERK信號(hào)通路的激活以起到在高氧肺損傷中的保護(hù)作用，但并未探討咖啡因是通過何種途徑對(duì)p-ERK水平產(chǎn)生影響。在今后的工作中，本課題組將著重探討咖啡因影響ERK信號(hào)通路行使保護(hù)作用的具體機(jī)制，為臨床防治BPD提供更多理論依據(jù)。