魏 然，肖玉紅，徐維，曾 飛

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科，南昌 330006)

結(jié)直腸癌是一種常見的人類惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年有100萬患者受到結(jié)直腸癌的影響。在我國(guó)，結(jié)直腸癌在癌癥相關(guān)死因中已躍居第3位，成為男性第三大常見腫瘤和女性第二大常見腫瘤[1]。結(jié)直腸癌早期不易診斷，往往直至手術(shù)時(shí)才發(fā)現(xiàn)多數(shù)腫瘤已經(jīng)穿過漿膜，且多有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這為結(jié)直腸腺癌的治療增加了難度[2]。影響結(jié)直腸癌的侵襲和遷移的原因及影響因素較多[3]。有研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的被動(dòng)酶解是結(jié)直腸癌侵襲、遷移過程中的重要環(huán)節(jié)。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶類(MMPs)是參與破壞細(xì)胞外基質(zhì)的一種重要的蛋白水解酶，尤其是MMP-9，其表達(dá)產(chǎn)物在癌細(xì)胞侵襲、遷移過程中能使基底膜的主要成分Ⅳ型膠原酶解，還可以酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分[4-7]。MARSHALL等[8]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9的選擇性抑制劑可減慢原位移植結(jié)直腸癌模型小鼠腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，降低腫瘤轉(zhuǎn)移率。目前有研究提示，人參皂苷Rh1對(duì)人肝癌、惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響，并可以抑制腫瘤的侵襲和遷移[9-10]。而人參皂苷Rh1是通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化和轉(zhuǎn)錄，從而激活活化蛋白-1(AP-1)，進(jìn)而抑制了MMP-9及其他MMP蛋白的表達(dá)。同時(shí)有研究證明，人參皂苷Rh1抑制MAPK信號(hào)通路的方式不完全相同，這種差異可能來自腫瘤細(xì)胞本身的影響，但是都可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制AP-1[10-11]。本研究的目的是探究人參皂苷Rh1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480侵襲和遷移的影響，初步探索其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 從中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心購(gòu)得人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480。人參皂苷Rh1濃度為98.76%，購(gòu)自海永恒生物科技有限公司；佛波酯(PMA)購(gòu)自Gibcol公司；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Sigma公司；雙抗購(gòu)自Cellsignal公司；Transwell BD膠購(gòu)自O(shè)smonic公司；Western blot及提取蛋白質(zhì)的相關(guān)試劑材料購(gòu)自上海銳賽生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞分為對(duì)照組，50 ng/mL PMA處理組，30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組，100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組，300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組。

1.2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) SW480細(xì)胞在普通培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)換液，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到80%時(shí)，用胰蛋白酶消化并計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，按照細(xì)胞1×106/孔的密度接種于6孔板中，6孔板底部用黑色標(biāo)記筆做好標(biāo)記線，每孔3條平行線，間距0.5 cm左右。按在37 ℃及5%CO2條件下孵育，24 h后細(xì)胞面積至少達(dá)到90%。第2天，用高壓滅菌100 μL黃槍頭垂直且快速地進(jìn)行細(xì)胞劃痕，與標(biāo)記線垂直劃出3條線，建立損傷模型。后用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次，除去劃下的細(xì)胞。板上6個(gè)孔分為 6組，每孔分別加入含或不含PMA和人參皂苷Rh1(0、30、100、300 μmol/L)無血清培養(yǎng)基(人參皂苷Rh1預(yù)先處理細(xì)胞1 h，PMA后處理)，繼續(xù)孵育。此后通過光學(xué)顯微鏡每24小時(shí)記錄細(xì)胞劃痕進(jìn)程。無菌PBS洗滌2次，光學(xué)顯微鏡低倍(×10)觀察并拍照，每孔選取4個(gè)劃痕區(qū)視野拍攝劃痕寬度，應(yīng)用Image-Pro plus6.0軟件進(jìn)行處理，劃痕寬度=測(cè)量空隙的面積/長(zhǎng)度。

1.2.3細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)(Transwell小室法) 使用Boyden室(Millicell Millipore，美國(guó))評(píng)估細(xì)胞侵襲和遷移。實(shí)驗(yàn)前無血清DMEM培養(yǎng)基(不含雙抗)、Transwell小室、24孔板、槍頭等實(shí)驗(yàn)用品放入-20 ℃冰箱過夜進(jìn)行預(yù)冷，將小量分裝好的Matrigel膠從-20 ℃冰箱移入4 ℃冰箱進(jìn)行解凍。(1)包被基底膜：冰浴操作，將丙酸倍氯米松(BD)膠用基礎(chǔ)培養(yǎng)基1∶8稀釋。均勻鋪開且不能產(chǎn)生氣泡。每孔50 μL Matrigel注入Transwell小室中,37 ℃孵育Transwell孔板4～5 h。(2)水化基底膜：用1×PBS輕輕潤(rùn)洗1～2次，去掉未凝的膠。貼壁SW480細(xì)胞與各組DMEM完全培養(yǎng)基作用48 h后(人參皂苷Rh1預(yù)先處理細(xì)胞1 h，PMA后處理),制備SW480細(xì)胞懸液，即胰酶消化將細(xì)胞分散成單個(gè)制備細(xì)胞懸液，離心1 000 r/min 5 min，用無血清DMEM培養(yǎng)液重懸1次細(xì)胞，除去培養(yǎng)基中的血清，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL。往已包被好BD凝膠的上室加入200 μL無血清培養(yǎng)基細(xì)胞重懸液，下層的培養(yǎng)液中加入500 μL 含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含500 μL腫瘤細(xì)胞趨化因子)。將接種完畢的24孔板移入 37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。孵育結(jié)束后用棉簽擦去上室未穿過的細(xì)胞。將小室下端提起，浸潤(rùn)于95%乙醇中固定10 min。0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，清洗掉多余染液，室溫晾干后拍照記錄。計(jì)數(shù)每孔中6 個(gè)不同視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)以評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)MMP-9蛋白水平 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)期SW480細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，每孔150 μL接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵箱孵育24 h。移液管吸凈培養(yǎng)基，加入各組無血清DMEM培養(yǎng)基，24 h后終止培養(yǎng)，用0.22 μmol/L孔徑的濾過膜過濾培養(yǎng)基上清液，以除去懸浮的死細(xì)胞及部分代謝物，離心使上清液濃縮25倍，根據(jù)MMP-9 ELISA試劑盒說明書檢測(cè)其中MMP-9的蛋白水平，最小檢出量為7.3 pg/mL。

1.2.5Western blot檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá)灰度值 細(xì)胞處理同ELISA，待SW480生長(zhǎng)至90%，消化離心后，再清洗1次后離心，提取沉積物。用中等細(xì)胞裂解液和PMSF 100∶1，冰上裂解提取細(xì)胞的總蛋白，使用BCA蛋白質(zhì)分析盒確定蛋白水平。蛋白以10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，再將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素(PVDF)膜上。常規(guī)5%脫脂牛奶封閉，TBST 3次5 min洗膜后，加一抗4 ℃孵育過夜。后繼續(xù)TBST洗膜，加入對(duì)應(yīng)抗兔二抗室溫孵育1 h。二抗孵育結(jié)束后，用ECL法顯色，X射線曝光條帶，洗膜。用ImageJ檢測(cè)蛋白表達(dá)灰度值。

2 結(jié) 果

2.1劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、300μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組的SW480細(xì)胞的遷移距離比分別為50 ng/mL PMA處理組的(0.76±0.03)、(0.60±0.04)、(0.29±0.08)倍(P<0.05)，見圖1。

2.2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組、50 ng/mL PMA處理組、30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組細(xì)胞穿過基質(zhì)膠的數(shù)量分別為261.6±29.7、729.7±36.5、581.7±49.9、359.0±34.4、265.0±34.1。對(duì)照組與300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組比較差異無統(tǒng)計(jì)意義(P=0.907)，其余組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

A：對(duì)照組劃痕愈合實(shí)驗(yàn)； B：50 ng/mL PMA處理組劃痕愈合實(shí)驗(yàn)； C：30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組劃痕愈合實(shí)驗(yàn)； D：100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL處理組劃痕愈合實(shí)驗(yàn)；E：300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組劃痕愈合實(shí)驗(yàn)；F：各組細(xì)胞遷移能力柱狀圖。1：對(duì)照組；2：50 ng/mL PMA處理組；3：30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組；4：100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL處理組；5：300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組

圖1 人參皂苷Rh1抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的遷移能力(×100)

A：對(duì)照組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)； B：50 ng/mL PMA處理組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)； C：30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)； D：100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL處理組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；E：300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)；F：各組細(xì)胞遷移能力柱狀圖。1：對(duì)照組；2：50 ng/mL PMA處理組；3：30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組；4：100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL處理組；5：300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組

圖2 人參皂苷Rh1抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的侵襲能力(姬姆薩染色，×100)

1：對(duì)照組；2：50 ng/mL PMA處理組；3：30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組；4：100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL處理組；5：300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組

圖3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的MMP-9蛋白水平

2.3ELISA檢測(cè)MMP-9蛋白水平 對(duì)照組、50 ng/mL PMA處理組、30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-9蛋白水平分別為(86.67±8.80)、(293.33±31.02)、(196.00±41.51)、(166.33±30.14)、(110.33±26.50) pg/mL。對(duì)照組與300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組比較差異無統(tǒng)計(jì)意義(P=0.350)。其余組兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.4Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞MMP-9的蛋白表達(dá)水平 30 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、100 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組、300 μmol/L人參皂苷Rh1+50 ng/mL PMA處理組的MMP-9蛋白表達(dá)分別為50 ng/mL PMA處理組的(0.80±0.04)、(0.47±0.03)、(0.06±0.00)倍(P<0.05)，見圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞MMP-9的蛋白表達(dá)水平

3 討 論

近年來，越來越多的研究團(tuán)隊(duì)開始研究人參皂苷Rh1在腫瘤治療中的作用。孫倩[12]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh1在人宮頸癌Hela細(xì)胞系及白血病K56細(xì)胞中發(fā)揮了重要的作用，可以抑制B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)的表達(dá)及促進(jìn)Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，同時(shí)其作用和藥物濃度有密切的關(guān)系。CHOI等[11]證明人參皂苷Rh1可以在人單核白血病細(xì)胞中通過抑制細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)1/2，JNK和p38 MAPK的磷酸化進(jìn)而抑制MAPK信號(hào)通路，從而抑制腫瘤的侵襲遷移。YOON等[9]證明人參皂苷Rh1可以抑制AP-1二聚體C-fos和C-Jun的表達(dá)，而AP-1被認(rèn)為在MMP啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄激活中起主導(dǎo)作用，因而人參皂苷Rh1可以下調(diào)MMP-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。JUNG等[10]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh1可以抑制MAPK和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(P13K/Akt)信號(hào)通路和下游的轉(zhuǎn)錄因子核因子κB(NF-κB)、AP-1的活性及表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)MMP-1、MMP-3、MMP-9，從而抑制人惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

MMP的表達(dá)水平與結(jié)腸癌分期及預(yù)后密切相關(guān)，然而大部分MMP抑制劑因?yàn)椴涣挤磻?yīng)大導(dǎo)致作用效果欠佳。因此，研發(fā)新的、不良反應(yīng)小的MMP選擇性抑制劑用于結(jié)腸癌臨床治療具有重要意義。有一些天然藥物表現(xiàn)出MMP抑制特性。芒果苷就是通過PI3K/AKt和MAPK通路，抑制轉(zhuǎn)錄因子AP-1、NF-κB與MMP-9的結(jié)合，從而抑制MMP-9基因的表達(dá)[13]。另外青蒿素等也能抑制MMPs的表達(dá)，此類天然藥物具有毒副作用少、毒性低的特點(diǎn)[14]。本實(shí)驗(yàn)利用Transwell小室內(nèi)Matrigel膠重建基底膜實(shí)驗(yàn)研究人參皂苷Rh1對(duì)SW480細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果表明，PMA能顯著地促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲，當(dāng)Rh1水平為30 μmol/L時(shí)發(fā)揮拮抗PMA的作用，并呈濃度依賴性，在人參皂苷Rh1濃度為300 μmol/L時(shí)，可以基本上抑制PMA促腫瘤侵襲的作用。細(xì)胞侵襲的數(shù)量隨藥物濃度的增加明顯降低，因此說明Rh1能明顯抑制SW480細(xì)胞的突破基底膜、胞外基質(zhì)的能力?；啄な悄[瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的第一道屏障的重要部分，當(dāng)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲時(shí)，通過膜表面受體與基底膜成分進(jìn)行黏附,然后釋放并激活蛋白酶降解基底膜，定向運(yùn)動(dòng)穿越基底膜形成的缺損部位。人參皂苷Rh1可抑制SW480細(xì)胞突破基底膜的能力，降低發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率。本研究使用細(xì)胞劃痕模擬這一環(huán)節(jié)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PMA能促進(jìn)SW480細(xì)胞遷移，30 μmol/L Rh1開始拮抗PMA的作用，并呈濃度依賴性，在人參皂苷Rh1濃度為300 μmol/L時(shí)，PMA促腫瘤侵襲作用基本上完全被抑制。因此Rh1可以有效降低SW480細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力而降低遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA、Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)、外MMP-9蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，50 ng/mL PMA組MMP-9蛋白表達(dá)量明顯提高，當(dāng)人參皂苷Rh1濃度為30 μmol/L時(shí)，MMP-9蛋白表達(dá)量較50 μmol/L PMA組明顯下降。本研究結(jié)果進(jìn)一步說明了人參皂苷Rh1在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用，作用機(jī)制可能是抑制了MMP-9的表達(dá)，但其更為詳細(xì)的作用機(jī)制還不清楚，因此，人參皂苷Rh1在結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。