許盼盼,楊世鵬,王麗慧,孫雪梅，3,高潔銘,李 莉,3,鐘啟文,3

(1.青海大學 農(nóng)林科學院 青海省蔬菜遺傳與生理重點實驗室，西寧 810016；2.青海大學 農(nóng)牧學院，西寧 810016; 3.青海大學 三江源生態(tài)和高原農(nóng)牧業(yè)國家重點實驗室，西寧 810016)

菊芋(HelianthustuborosusL．)又稱洋姜，菊科向日葵屬植物，是一種多年宿根性草本植物[1]。其塊莖中富含大量果聚糖，可作為生物、醫(yī)藥、能源、食品加工等方面的原材料，是一種多糖類新興能源作物[2]。近年來，國內(nèi)外對菊芋的研究主要集中于抗逆性[3]、品種選育[4]、種質(zhì)資源和遺傳特性[5]、能源轉(zhuǎn)化利用[6]和果聚糖代謝調(diào)控[7]等方面。目前，針對菊芋葉片的研究主要集中在其抗氧化、抗菌活性、綠原酸與黃酮類的提取工藝及其吸附性等方面。羅安凱[8]研究發(fā)現(xiàn)，菊芋莖葉對重金屬離子有較好的吸附作用，孫鵬程[9]研究發(fā)現(xiàn)，菊芋葉片可以作為提取綠原酸的一個新植物來源；鄭曉濤[10]研究發(fā)現(xiàn)，菊芋莖葉黃酮類化合物中的抗氧性組分主要存在于菊芋葉片中，其在食品和藥品中可作為抗氧化劑等。

葉綠體(Chloroplast)是植物光合作用的主要器官，是一切生命活動的物質(zhì)來源，同時其具有獨立的遺傳系統(tǒng)[11]。它普遍存在于綠色植物、藻類的色素，在綠色植物進行光合作用的過程中，相對于其他細胞器，葉綠體起著能量轉(zhuǎn)化的重要作用[12]。葉綠體中同時進行著多種物質(zhì)的合成，例如脂肪酸、淀粉、氨基酸等[13]。葉綠體基因組(Chloroplast DNA, cpDNA)是一種閉合環(huán)狀雙股結(jié)構(gòu)，含有10～30個基因，編碼200個蛋白質(zhì)。植物細胞中，細胞核、線粒體以及葉綠體都攜帶著DNA等遺傳物質(zhì)[14]。與核基因相比，細胞器基因組雖不具備大分子量與高復(fù)雜性，卻有著分子量小、結(jié)構(gòu)簡單及多拷貝的特點[15]。

葉綠體作為植物細胞的重要細胞器，其本身完整的基因組研究在植物基因組學的研究中越來越重要。提取高質(zhì)量菊芋葉綠體基因組DNA是開展葉綠體基因組組裝測序的關(guān)鍵一步，目前常用的植物葉綠體DNA提取方法有：無水法[16]、DNaseⅠ法[17]、改良高鹽-低pH法[18]、試劑盒法、離心法[19]等。謝海坤等[20]在中國野生葡萄葉綠體分離及葉綠體DNA提取的研究中發(fā)現(xiàn)，柱式植物葉綠體DNA提取試劑盒和改良高鹽-低pH法均分離得到中國野生葡萄的葉綠體，但改良高鹽-低pH法得到的cpDNA濃度高、雜質(zhì)少；劉少林等[21]利用DIECA和PVP，對高鹽-低pH法進行改進，并提取分離棉花葉片的葉綠體基因組，得到的cpDNA無雜質(zhì)污染，電泳條帶清晰無拖尾；陸丹等[22]采用高鹽-低pH法和CTAB法提取高粱葉片的cpDNA，并對緩沖液SDS濃度進行優(yōu)化，比較發(fā)現(xiàn)高鹽-低pH法提取高粱基因組DNA效果更好；梁鳳萍等[23]對27種菊科植物的葉綠體進行全基因組序列分析，提供了菊科植物分類鑒定和定位的依據(jù)，而對菊芋cpDNA的提取方法未報道。本試驗通過對比植物組織葉綠體DNA萃取試劑盒中物理法、化學法、Percoll密度梯度離心法、高鹽-低pH法和差速離心分離法，以期篩選出適合菊芋cpDNA提取的最佳方法，為菊芋和其他菊科作物葉綠體基因組的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取青海農(nóng)林科學院研發(fā)中心資源苗圃中的菊芋‘青芋1號’葉片。于2017-08-04采集菊芋成熟期的枝干頂端幼嫩葉片，用蒸餾水清洗干凈，濾紙吸干表面水分，避光，置于4 ℃，備用。

1.2 菊芋葉綠體的提取

1.2.1 改良高鹽-低pH法 在葉綠體的提取與純化過程中加入氯仿∶異戊醇=24∶1(體積比) 1 mL，顛倒離心管5 min，12 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至新離心管，對照上面的方法重復(fù)抽提5次。加入2 mL 20 ℃預(yù)冷的無水乙醇及2 mL乙酸鈉溶液(2.4 g/L)和24 mmol CTAB/NaCl溶液1 mL，混勻后-20 ℃靜置2 h沉淀析出DNA，4 ℃ 13 000 r/min離心10 min，回收DNA沉淀。沉淀用φ=75%乙醇漂洗2次，置于室溫干燥。加入800 μL TE(Tris-EDTA buffer solution)緩沖液(購自北京索萊寶科技有限公司)和10 μL的RNaseA，37 ℃下反應(yīng)4 h。小心顛翻離心管 5 min，10 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液。上清液加φ=1/10乙酸鈉溶液(2.4 g/L)，混勻后加無水乙醇(-20 ℃預(yù)冷)2 mL，4 ℃ 13 000 r/min離心10 min，棄上清，用φ=75%乙醇漂洗1次，室溫干燥，加入TE緩沖液20 μL溶解并混勻沉淀，-20℃保存，備用。其他步驟均參考黎金燕等[24]的方法。

1.2.2 GENMED試劑盒物理法和GENMED試劑盒化學法 GENMED試劑盒購自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，將菊芋葉片去中脈并切小，稱取1 g。放入暗室4 ℃過夜，液氮研磨，按使用說明書進行。

1.2.3 Percoll密度梯度離心法 將菊芋葉片去中脈并切小，稱取10 g。放入暗室4 ℃過夜，液氮研磨，后續(xù)步驟參考Michaud等[25]。

1.2.4 DNaseⅠ差速離心法 將葉片去中脈并切小，稱取20 g。放入暗室4 ℃過夜，后續(xù)步驟參考姜少俊等[26]。

1.3 菊芋葉綠體顯微鏡觀察

分別從以上5種方法提取的cpDNA粗提液中吸取20 μL，制作臨時載玻片，在奧林巴斯BX53顯微鏡下經(jīng)40×物鏡觀察提取得到的葉綠體細胞的情況并拍照。

1.4 菊芋cpDNA質(zhì)量檢測與電泳檢測

cpDNA濃度和純度檢測：從備用的cpDNA樣品中吸取2 μL，用核酸蛋白檢測儀(北京天根生化科技有限公司)測定cpDNA濃度，用ddH2O作空白對照校0點，記錄OD260/OD280、OD260/OD230和cpDNA濃度，其中標準DNA OD260/OD280在1.80～2.0，OD260/OD230在0.8～1.2，根據(jù)OD260/OD280和OD260/OD230評價cpDNA質(zhì)量。

凝膠圖譜檢測：從備用cpDNA液中吸取 2 μL，稀釋10倍。吸取稀釋液2 μL，加2 μL的 6×DNA loading buffer染色，以λDNA HindⅢ為marker，在10 g/L瓊脂糖凝膠上用恒壓80 V電泳50 min后，在Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。

1.5 PCR引物擴增

隨機選取RAPD引物4對[27]，分別以5種方法提取的cpDNA為模板進行PCR擴增反應(yīng)(PCR引物擴增的試劑均購自北京天根生化科技有限公司)。PCR反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系為25 μL，其中包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、引物1 μL、ddH2O 10.5 μL、模板cpDNA 1 μL。PCR擴增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，40 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s，循環(huán)42次；72 ℃延伸5 min。用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)進行拍照分析。引物名稱及序列見表1。

表1 引物名稱及序列Table 1 The name and sequence of primers

2 結(jié)果與分析

2.1 5種方法分離菊芋葉綠體電鏡觀察結(jié)果

通過顯微鏡對5種提取方法得到的菊芋葉綠體粗提液觀察發(fā)現(xiàn)，在40×物鏡下分別得到分離的葉綠體、葉綠體個數(shù)及形狀。根據(jù)(圖1)對比發(fā)現(xiàn)DNaseⅠ差速離心法分離出的葉綠體最少，改良高鹽低-pH法得到的葉綠體數(shù)目多，含量高；相比較而言，其他4種方法分離得到的菊芋葉片葉綠體含量、數(shù)目較少。從表2可以看出，5種方法提取分離的葉綠體細胞均呈現(xiàn)扁圓形，且改良高鹽-低pH法分離出的葉綠體個數(shù)高達610個。因此，改良高鹽-低pH法能分離出更高質(zhì)量的菊芋葉綠體。

2.2 菊芋cpDNA質(zhì)量檢測與電泳檢測

2.2.1 核酸蛋白檢測儀檢測結(jié)果 對5種方法分離后提取的cpDNA進行核酸蛋白檢測儀檢測，分析菊芋cpDNA的濃度和不同波長下吸光度數(shù)值，從表2中可知，5種方法提取的cpDNA指標差異顯著，除了改良高鹽-低pH法提取的OD260/OD280高于1.8外，其他4種提取的OD260/OD280低于1.8，為1.353～1.750，低于純凈DNA(1.8～2.0)；DNaseⅠ差速離心法和Percoll密度梯度離心法OD260/OD230高于純凈DNA，表明這2種方法提取的樣品中可能有較多的未純化完全的多糖和多酚類物質(zhì)；對比5種方法提取的cpDNA濃度發(fā)現(xiàn)，高鹽-低pH法的cpDNA質(zhì)量濃度可達到295.63 μg/μL。結(jié)果表明改良后的高鹽-低pH法提取菊芋葉片中的cpDNA純度較好。由上述結(jié)果看出，高鹽-低pH法提取cpDNA質(zhì)量較高，糖類及酚類物質(zhì)污染較輕，因此，更能滿足植物葉綠體基因組建庫測序的要求。

2.2.2 凝膠電泳檢測結(jié)果 由10 g/L瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果(圖2)看出：高鹽-低pH法、GENMED試劑盒物理法有明顯的條帶， GENMED試劑盒化學法、Percoll密度梯度離心法、DNaseⅠ差速離心法沒有條帶。GENMED試劑盒化學法條帶比高鹽-低pH法條帶的亮度有所降低，可能由于多糖的干擾；GENMED試劑盒化學法的條帶幾乎看不清楚，說明cpDNA有降解；Percoll密度梯度離心法和DNaseⅠ差速離心法沒有條帶，表明cpDNA濃度較低且降解。相反高鹽-低pH法條帶清晰、整齊，亮度均勻，完整性較好。通過對比可知，高鹽-低pH法提取的cpDNA產(chǎn)量高于其他方法，即提取cpDNA的質(zhì)量好于其他方法，與核酸蛋白檢測儀的定量分析結(jié)果吻合。

A.GENMED試劑盒物理法 Physical method of GENMED kit；B.GENMED試劑盒化學法 Chemical method of GENMED kit；C.DNaseⅠ 差速離心法 DNaseⅠdifferential centrifugation；D.Percoll密度梯度離心法 Percoll density gradient centrifugation method； E.改良的高鹽-低pH法 Improved High salt-low pH method

圖1 5種方法分離提取菊芋葉綠體顯微圖片F(xiàn)ig.1 The micrographs of chloroplast isolate by five methods

表3 5種方法提取菊芋cpDNA質(zhì)量的檢測結(jié)果Table 3 The quality of cpDNA extracted from Jerusalem artichoke by five methods

M.λDNA/Hind Ⅲ marker；1.改良高鹽-低pH法 Improved high salt-low pH method；2.GENMED試劑盒物理法 Physical method of GENMED kit；3.GENMED試劑盒化學法 Chemical method of GENMED kit；4.Percoll密度梯度離心法 Percoll density gradient centrifugation method；5.DNaseⅠ差速離心法 DNaseⅠdifferential centrifugation;下同 The same below

圖2菊芋cpDNA電泳檢測
Fig.2ElectrophoresispatternofchloroplastDNAextractedfromJerusalemartichoke

2.3 PCR擴增

使用5種方法提取的cpDNA分別對4對RAPD的引物進行PCR擴增，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳的擴增，結(jié)果顯示(圖3)，在4對RAPD引物的擴增結(jié)果中，改良高鹽-低pH法cpDNA在4對RAPD引物中均擴增特征標記圖譜，條帶清晰，帶型一致；GENMED試劑盒物理法cpDNA在第4對引物中未擴增出特征標記條帶；GENMED試劑盒化學法的cpDNA只在第A對和第D對引物擴增出特征標記圖譜，而在A引物中的擴增條帶幾乎看不到，在第B對和第C對引物中未擴增出特征標記圖譜；Percoll密度梯度離心法、DNaseⅠ差速離心法的cpDNA在4對RAPD引物中均未擴增出特征標記圖譜。因此，進一步驗證了高鹽-低pH法提取的菊芋cpDNA的完整性。

M.D2000 marker; A.OPA10;B.OPE02;C.OPS12;D.OPS15

3 討 論

提取高質(zhì)量菊芋葉綠體基因組DNA是開展葉綠體基因組組裝測序的關(guān)鍵一步，然而在cpDNA提取過程中，葉綠體較難分離，同時存在核DNA與線粒體DNA污染情況。此外，不同植物具有不同特性，選取方法、試劑等因素均會導(dǎo)致植物cpDNA提取效果不同[15-19]。目前，沒有專門針對提取菊芋葉片cpDNA的方法，因此，篩選出適合菊芋cpDNA 的提取方法十分重要。本試驗在參考其他植物cpDNA分離提取方法的基礎(chǔ)上，選擇5種常見的cpDNA 提取方法對菊芋cpDNA的提取效果進行比較，發(fā)現(xiàn)5種方法均可提取到菊芋cpDNA。試劑盒法操作雖然快速、簡單，但獲得的cpDNA含量較少，成本較高[28]；Percoll密度梯度離心法操作比其他方法繁瑣，同時成本高、耗時長、產(chǎn)率低[29]；DNaseⅠ差速離心分離法很難得到完整葉綠體膜、純度以及含量都較低[30]；而改良高鹽-低pH法不僅操作簡單，且可快速獲得完整葉綠體以及高質(zhì)量、高產(chǎn)率的cpDNA[31]。

菊芋中富含大量的果聚糖，其占菊芋塊莖鮮質(zhì)量的20%或者干物質(zhì)量的90%，由于糖類物質(zhì)的存在對DNA分離、純化及cpDNA的穩(wěn)定性造成一定困難，趙孟良等[32]在提取菊芋DNA過程中進行改良，避免多糖類物質(zhì)對DNA質(zhì)量的影響。本試驗在其他植物cpDNA提取方法的基礎(chǔ)上，加入24 mmol CTAB/NaCl溶液1 mL，以減少混入多糖對cpDNA的影響，結(jié)果較為明顯，利用改良高鹽-低pH法提取的cpDNA含量和質(zhì)量均比較高。試驗過程中使用商品化的TE(Tris-EDTA buffer solution)緩沖溶液，減少了試劑配制的步驟，且易于溶解。此方法提取及獲得的cpDNA條帶清晰、干凈且亮度高，其中OD260/OD280為1.926，質(zhì)量濃度為295.63 μg/μL，表明提取的菊芋cpDNA質(zhì)量高，純度高，是一種較合適的菊芋cpDNA提取方法，可為后續(xù)的菊芋cpDNA其他分子研究奠定基礎(chǔ)。