陳 娜 周中銀

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科，消化系統(tǒng)疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省武漢市 430060，電子郵箱：614220735@qq.com)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分明確的慢性非特異性炎癥性腸病，病變主要累及直腸、乙狀結(jié)腸的黏膜層和黏膜下層，其發(fā)作期與緩解期交替出現(xiàn)，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等癥狀[1-2]。主流觀點(diǎn)認(rèn)為腸腔上皮屏障結(jié)構(gòu)的破壞使得腸道菌群失調(diào)，引起免疫細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，繼而導(dǎo)致腸道炎癥反應(yīng),其中輔助性T細(xì)胞(T helper cell，Th)1和Th2亞群的平衡失調(diào)是UC的發(fā)病機(jī)制之一[3-4]。咪唑喹啉胺類藥物咪喹莫特是一種Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)7激動(dòng)劑，屬于小分子免疫調(diào)節(jié)劑。咪喹莫特可以激發(fā)抗原提呈細(xì)胞,誘發(fā)樹突狀細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子以及表達(dá)多種共刺激分子，進(jìn)而活化機(jī)體的天然與獲得性免疫來(lái)發(fā)揮作用[5]。目前，咪喹莫特在臨床上尤其是皮膚科應(yīng)用廣泛，并且取得較好的療效[6]。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ )技術(shù)是一種同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)，可以對(duì)多達(dá)8種不同樣本進(jìn)行蛋白定量分析，具有較好的精確性和重復(fù)性，在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用廣泛[7-8]。本研究利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過分析咪喹莫特對(duì)UC小鼠結(jié)腸組織蛋白表達(dá)的影響，探討咪喹莫特治療UC的作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠30只，6～8周齡，體重18～20 g，購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，均飼養(yǎng)于武漢大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房[實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK(鄂)2015-0027]，室溫20℃～23℃，人工光照12 h/d，相對(duì)濕度40%～60%，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食。

1.2 主要試劑與儀器 咪喹莫特(上海TCI化工有限公司；批號(hào)：AMPWD-GF)；葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS；重均分子量:36 000～50 000；美國(guó)MP公司；批號(hào)：Q6182)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA；武漢楚誠(chéng)正茂科技有限公司；批號(hào)：CC1050003)；乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、硫脲、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)、丙酮(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；批號(hào)分別為：10009617、30166428、10022318、J7427、10000418)；二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT；批號(hào)：428F0422)、Tris-HCl(北京索萊寶科技有限公司；批號(hào)：613V072)；尿素(美國(guó)Sigma公司；批號(hào)：BCBJ1471)；蛋白marker(美國(guó)Fermentas公司；批號(hào)：00611093)；iTRAQ-8標(biāo)試劑盒(美國(guó)AB SCIEX公司；批號(hào)：4381663)；超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司；型號(hào)：JY92-11N)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；型號(hào)：TGL-20M);真空冷凍干燥器儀(丹麥LaboGene公司；型號(hào)：SCAN SPEED 40);電泳儀、電泳槽(北京六一儀器廠；型號(hào)分別為：DYY-6C、DYCZ-24DN);酶標(biāo)儀(上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：SM600);TripleTOFTM5600+質(zhì)譜系統(tǒng)(美國(guó)AB SCIEX公司)；Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo DINOEX公司)

1.3 動(dòng)物分組及模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只小鼠分為正常組、模型組、咪喹莫特組，每組10只。除正常組飲用蒸餾水外，其余兩組飲用3% DSS，連續(xù)飲用7 d，建立DSS誘導(dǎo)的小鼠急性UC模型。從造模第1天起，每日上午10：00分別給予正常組及模型組0.4 ml無(wú)菌磷酸緩沖鹽溶液灌胃，咪喹莫特組給予0.4 ml咪喹莫特[30 mg/(kg·d)]灌胃，所有藥品現(xiàn)配現(xiàn)用，連續(xù)治療7 d。于實(shí)驗(yàn)第8天頸椎脫臼處死各組小鼠，在冰浴條件下取出結(jié)腸組織，放入液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中備用。

1.4 iTRAQ技術(shù)定量分析蛋白

1.4.1 樣品蛋白提取和定量測(cè)定：采用隨機(jī)數(shù)字表法將每組10份結(jié)腸樣本分成兩組(即正常組1、正常組2、模型組1、模型組2、咪喹莫特組1、咪喹莫特組2)后進(jìn)行混合，每小組取適量結(jié)腸組織用于提取蛋白；向樣品中加入蛋白裂解液(7 mol/L尿素/2 mol/L硫脲/4% SDS/40 mmol/L Tris-HCl(pH 8.5)/1 mmol/L PMSF/2 mmol/L EDTA)，加入終濃度為10 mmol/L的 DTT，冰浴超聲15 min，然后13 000 r/min 4℃離心20 min，取上清轉(zhuǎn)入新的離心管中；向離心管中加入4倍體積的冷丙酮，在-20℃靜置過夜。4℃下12 000 r/min離心20 min，收集蛋白沉淀，空氣中晾干。加入8 mol/L尿素/100 mmol/L三乙胺-碳酸緩沖溶液(pH 8.0)重新溶解蛋白，采用Bradford法[9]測(cè)定蛋白濃度。

1.4.2 蛋白酶解與標(biāo)記：每個(gè)樣品取等量的蛋白質(zhì)用于胰蛋白酶消化酶解。酶解后的肽段用C18柱脫鹽，根據(jù)iTRAQ-8標(biāo)試劑盒說(shuō)明書對(duì)真空冷凍干燥脫鹽后的肽段進(jìn)行標(biāo)記，其中正常組1、正常組2、模型組1、模型組2、咪喹莫特組1、咪喹莫特組2分別標(biāo)記為115、116、117、118、119、121，樣本標(biāo)記后混合。

1.4.3 蛋白分離與鑒定：將混合后的肽段運(yùn)用Ultimate 3000型高效液相色譜儀對(duì)肽段樣品進(jìn)行分級(jí)分離，共收集42個(gè)次級(jí)餾分并合并成12個(gè)組分，合并后的組分在Strata-X柱上脫鹽并真空干燥。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集使用TripleTOFTM5600+質(zhì)譜系統(tǒng)。

1.5 生物信息學(xué)分析 使用質(zhì)譜系統(tǒng)配套的ProteinPilotV4.5軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，以差異倍數(shù)≥1.5(上調(diào))或≤0.67(下調(diào))，且P≤0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白。采用BLAST2go(https://www.blast2go.com/)軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的基因本體論(gene ontology，GO)功能注釋，分別對(duì)細(xì)胞組分、分子功能和生物過程進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 3組小鼠的一般情況 模型組小鼠出現(xiàn)明顯腹瀉、黏液膿血便、體重減輕等表現(xiàn)，提示DSS成功誘發(fā)急性UC。咪喹莫特組小鼠以上癥狀減輕，提示咪喹莫特能有效改善DSS誘導(dǎo)的UC癥狀。

2.2 小鼠結(jié)腸組織中的差異表達(dá)蛋白 運(yùn)用iTRAQ技術(shù)聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，共鑒定到4 170個(gè)蛋白，其中模型組/正常組、咪喹莫特組/正常組、咪喹莫特組/模型組相對(duì)定量到的蛋白質(zhì)種數(shù)分別為4 019種、4 033種和4 030種。在相對(duì)定量結(jié)果中，模型組/正常組、咪喹莫特組/正常組、咪喹莫特組/模型組分別存在317個(gè)、253個(gè)和209個(gè)差異表達(dá)蛋白，見表1。模型組和正常組相比表達(dá)上調(diào)，而咪喹莫特組與模型組相比下調(diào)的蛋白有62個(gè)，見表2；模型組與正常組相比表達(dá)下調(diào)，而咪喹莫特組與模型組相比表達(dá)上調(diào)的蛋白有48個(gè)，見表3。

表1 兩兩樣品間差異表達(dá)蛋白數(shù)量(個(gè))

表2 模型組與正常組相比表達(dá)上調(diào)而咪喹莫特組

續(xù)表2

表3 模型組與正常組相比下調(diào)而咪喹莫特組與模型組相比上調(diào)的蛋白及其差異倍數(shù)

2.3 蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析 對(duì)表2及表3中的差異蛋白進(jìn)行GO分析。這些差異蛋白主要分布在細(xì)胞器、細(xì)胞及胞外區(qū)，分子功能以結(jié)合功能、催化功能、結(jié)構(gòu)分子功能及酶調(diào)節(jié)活性為主，主要參與細(xì)胞進(jìn)程、生物調(diào)節(jié)及代謝過程，見表4。

表4 差異蛋白的GO功能

3 討 論

UC是一種病因尚不明確的慢性非特異性炎癥性腸病。在過去幾十年中，UC的發(fā)病率在發(fā)達(dá)國(guó)家穩(wěn)定增長(zhǎng)，在發(fā)展中國(guó)家急劇增長(zhǎng)，這種高發(fā)病率和流行性主要表現(xiàn)在歐美國(guó)家，可能與西方的生活環(huán)境和方式(藥物使用、高糖高脂飲食、環(huán)境污染、生活壓力等)有關(guān)[9-10]。雖然新的藥物和治療方法不斷出現(xiàn)，但療效并不顯著。咪喹莫特是一種小分子免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗病毒和抗腫瘤的作用[11]。有學(xué)者報(bào)告，咪喹莫特作為一種TLR7激動(dòng)劑能夠緩解小鼠的結(jié)腸炎[12-13]，本課題組前期研究結(jié)果也顯示咪喹莫特對(duì)UC小鼠具有治療作用。我們以前期研究為基礎(chǔ)，采用iTRAQ技術(shù)分析咪喹莫特治療UC小鼠前后差異蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示模型組/正常組、咪喹莫特組/正常組、咪喹莫特組/模型組分別存在 317、253和209個(gè)差異表達(dá)的蛋白；其中模型組和正常組相比上調(diào)而咪喹莫特組與模型組相比下調(diào)的蛋白有62個(gè)，模型組與正常組相比下調(diào)而咪喹莫特組與模型組相比上調(diào)的蛋白有48個(gè)；生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示這些差異表達(dá)的蛋白主要分布在細(xì)胞及胞外區(qū)，以結(jié)合催化調(diào)節(jié)功能為主，參與細(xì)胞進(jìn)程、生物調(diào)節(jié)及代謝過程。以下就幾個(gè)典型差異表達(dá)的蛋白質(zhì)做相關(guān)描述。

S100鈣結(jié)合蛋白A8(即S100A8)屬于鈣結(jié)合蛋白S100蛋白家族成員，是重要的促炎細(xì)胞因子，主要在炎癥和免疫過程中發(fā)揮作用，常與S100A9蛋白通過Ca2+依賴的方式形成S100A8/A9異二聚體共同發(fā)揮生物學(xué)作用[14]。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，S100A8主要定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架，介導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫和生物學(xué)功能。有學(xué)者認(rèn)為S100A8能刺激人中性粒細(xì)胞向炎癥部位遷移與黏附以及其他促炎活性[14]。目前，S100A8 已被作為一種炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)記物，用以監(jiān)測(cè)疾病狀態(tài)以及評(píng)估治療效果[15]。其促炎活性的機(jī)制可能是機(jī)體免疫復(fù)合物可以刺激中性粒細(xì)胞分泌S100A8/A9，通過與晚期糖基化終末產(chǎn)物和TLR4結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和核因子-κB信號(hào)通路分泌白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α等細(xì)胞因子從而產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)[16]。另外，S100A8/A9還可以促進(jìn)MAPK和核因子-κB信號(hào)通路的激活，以及結(jié)腸炎相關(guān)性癌癥中腫瘤細(xì)胞的增殖[17]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織S100A8鈣結(jié)合蛋白表達(dá)上調(diào)，而與模型組比較，經(jīng)咪喹莫特治療后的小鼠結(jié)腸組織S100A8鈣結(jié)合蛋白表達(dá)下調(diào)，提示S100A8有助于UC的臨床診斷，而降低結(jié)腸組織中的S100A8可能是咪喹莫特治療UC機(jī)制之一。

腸黏液屏障防御機(jī)能失調(diào)是UC發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素之一。黏蛋白2(mucin 2，MUC2)是腸黏液層主要成分，主要由杯狀細(xì)胞分泌，它在調(diào)節(jié)黏膜免疫方面起著重要作用[18]。研究表明UC患者結(jié)腸黏液層厚度與正常人相比明顯變薄，腸黏膜通透性增高，細(xì)菌穿透黏液層侵襲上皮細(xì)胞引起腸黏膜損傷[19]，而黏膜損傷又會(huì)影響杯狀細(xì)胞分化和MUC2的表達(dá)，兩者相互作用導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，MUC2主要位于胞外區(qū)，參與機(jī)體的代謝和生物調(diào)節(jié)過程。有學(xué)者指出MUC2基因敲除小鼠(MUC2-/-)可以出現(xiàn)自發(fā)性結(jié)腸炎，出現(xiàn)明顯的隱窩破壞，隱窩膿腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及黏膜下水腫，提示MUC2具有保護(hù)腸黏膜的作用[20]。Tadesse等[21]認(rèn)為MUC2-/-小鼠在腸上皮細(xì)胞中的中間代謝途徑發(fā)生改變，包括改變脂質(zhì)代謝，提高葡萄糖利用率等，這些改變可以使腸道穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致結(jié)腸炎癥產(chǎn)生，嚴(yán)重者甚至可以發(fā)展成結(jié)直腸癌。目前，MUC2在腸道黏膜屏障損傷中的具體作用機(jī)制及意義尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中的MUC2表達(dá)下調(diào)，而與模型組比較，咪喹莫特治療后的小鼠結(jié)腸組織中MUC2表達(dá)上調(diào)，與既往研究[20]結(jié)論相似，提示咪喹莫特可能是通過增加黏膜屏障保護(hù)因子來(lái)修復(fù)受損黏膜從而起到治療作用。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，角蛋白家族蛋白Krt7、Krt8、Krt18、Krt19、Krt20在模型組小鼠結(jié)腸組織中表達(dá)水平均下調(diào)，而與模型組比較，咪喹莫特治療后的小鼠結(jié)腸組織中以上蛋白表達(dá)均上調(diào)。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，這些蛋白主要參與細(xì)胞骨架的形成。腸道中的角蛋白除了參與細(xì)胞骨架作用外還有其他重要功能。研究表明，Krt8、Krt18、Krt19通過多種方式與MAPK和P53通路存在相互作用關(guān)系，Krt8還對(duì)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有重要作用，而這些通路都與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[22-23]。此外，Owens等[24]發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分化時(shí)，Krt8骨架的重建可能使腸黏膜上皮細(xì)胞易脆，腸道黏膜屏障功能受損，進(jìn)而導(dǎo)致UC的發(fā)生。這均說(shuō)明角蛋白在介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及分化中具有重要作用。

綜上所述，S100鈣結(jié)合蛋白A8、黏蛋白2、角蛋白等有可能成為咪喹莫特治療UC的重要分子靶點(diǎn)。應(yīng)用iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)可以全面快速地了解咪喹莫特治療UC的作用機(jī)制，但本實(shí)驗(yàn)僅為初步研究，所篩選出的一系列差異蛋白的具體功能及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。