黃 祺，唐洪波，胡明冬，梁華平

抗菌藥物耐藥性（AMR）是微生物（如細(xì)菌，病毒和一些寄生蟲）阻止抗菌藥物（如抗生素，抗病毒藥物和抗瘧藥）對抗它的能力［1］?？股啬退幘陙碓谌蜓杆俣鴱V泛地傳播，由于AMR的出現(xiàn)，使得傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)治療策略變得無效，并且存在傳播給其他人的風(fēng)險。根據(jù)現(xiàn)有的研究報道，全球每年約700 000人死于抗生素耐藥性，盡管目前很難預(yù)估AMR的發(fā)生率及死亡率，但預(yù)計到2050年，抗生素耐藥性導(dǎo)致的死亡人數(shù)將增加到每年1000萬，經(jīng)濟負(fù)擔(dān)為100萬億美元。不幸的是，盡管目前已有應(yīng)對AMR的策略，但抗菌藥物的耐藥率預(yù)計仍會不斷地增長［2-4］。2009年—2016年中國臨床分離菌株（CHINET）細(xì)菌耐藥性監(jiān)測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，中國的AMR形勢也十分嚴(yán)峻［5］。在2016年在杭州召開的 G20峰會上，AMR問題亦被提上各國領(lǐng)導(dǎo)人討論議程，可以看出AMR問題在全球越來越受重視。作為醫(yī)務(wù)工作者，我們對AMR的認(rèn)識仍需不斷深入，對其治療新技術(shù)的研究進(jìn)展更需系統(tǒng)地了解，筆者整合了近5年來國內(nèi)外最新文獻(xiàn)，現(xiàn)就快速診斷技術(shù)、抗生素新藥研發(fā)、老藥新用、抗菌藥物聯(lián)合運用、噬菌體療法、免疫療法、基因編輯技術(shù)運用等對策進(jìn)行概述，鑒于筆者前期發(fā)表的綜述已撰寫了部分措施，該文則重點對快速診斷技術(shù)、抗生素新藥研發(fā)、老藥新用、免疫療法、基因編輯技術(shù)運用等對策進(jìn)行綜述。

1 快速診斷技術(shù)

機體感染病原菌后，針對病原菌及藥敏的檢測至關(guān)重要，特別是在耐藥菌感染方面。因早期經(jīng)驗性選用的抗生素可能對該病原菌不敏感，所以若能早期快速獲得準(zhǔn)確病原菌及耐藥情況，將為臨床選用更具針對性及有效性抗生素提供重要作用。目前針對病原菌的快速診斷方法主要包括表型篩查和基因檢測。表型篩查主要包括 E-test法、改良Hodge 實驗等［6］，但這類方法往往耗時長、特異性差、靈敏度低，極易出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果?；驒z測主要包括普通PCR法、熒光定量PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、基因芯片技術(shù)等［7，8］，這些方法具有快速、特異及敏感等優(yōu)點。而針對病原菌耐藥情況的檢測除針對基因檢測外，目前針對蛋白檢測更加優(yōu)勢，主要包括LC-MS/MS法和PCR-P法。LC-MS/MS法首先獲得待測菌株的全蛋白溶液并進(jìn)行蛋白電泳，多個蛋白條帶分別進(jìn)行酶解后，通過LC-MS/MS獲得各條帶對應(yīng)的特異性肽指紋圖譜，之后采用Mascot將LC-MS/MS檢測結(jié)果在Swis-sProt數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌分類中進(jìn)行搜索比對，即可判斷待測菌株是否為陽性耐藥菌株，該技術(shù)除了對產(chǎn)碳青霉烯酶的培養(yǎng)粗提物進(jìn)行檢測外，也成功檢測到了動物感染血液中的碳青霉烯酶的存在［9］，新技術(shù)的進(jìn)步對早期耐藥菌感染的確診，并對其開展相應(yīng)治療具有重要作用。

2 新藥研發(fā)

眾所周知，新型抗菌藥物的研發(fā)周期長，資金需求大，研發(fā)的速度滯后于細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥的速度。盡管開發(fā)新抗生素的努力從未停止，但新藥獲批的數(shù)量在過去幾年卻逐步減少。自2010年以來，很少有新的抗生素獲得FDA和（或）EMA批準(zhǔn)用于抗多藥耐藥G-菌的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗，這其中就包括：頭孢唑嗪/他唑巴坦，頭孢他啶/阿維嘧啶，美羅培南/他巴比妥，Plazomicin 及 Eravacycline［10］。20世紀(jì)70年代以來，僅有2種新型抗菌藥物［利奈烷酮類（利奈唑胺）及環(huán)脂肽類（達(dá)托霉素）］上市并投入臨床［11］。近年來，科研人員一直堅持不懈地篩選具有殺滅耐藥菌的有效物質(zhì)，就有學(xué)者利用MDR感染的線蟲模型，對1300多種藥用植物內(nèi)生真菌提取物進(jìn)行抗耐藥菌作用篩選，并成功發(fā)現(xiàn)了4種抗耐藥菌有效的提取物。2015年，一種少見的縮肽類化合物被發(fā)現(xiàn)并命名為Teixobactin，該化合物多種多重耐藥菌有很強抗菌活性，且目前未見有對此藥耐藥的相關(guān)報道，美國NovoBiotic Pharmaceuticals公司現(xiàn)正對其進(jìn)行進(jìn)一步研發(fā)。此外具有較好抗耐藥菌能力的納米化抗生素 （如納米金，納米銀）也在被進(jìn)一步被研發(fā)［5］。綜上，新藥研發(fā)策略將給耐藥菌的治療帶來了新的希望。

3 老藥新用

抗菌藥物老藥新用指的是將抗菌藥物通過采用現(xiàn)代分析和藥效、藥代動力學(xué)等方法對舊抗菌藥物重新開發(fā)并利用，多黏菌素的臨床新運用就是該策略成功的一個案例［12］。2010年新德里金屬β內(nèi)酰胺酶-1（NDM-1）超級細(xì)菌被首次報道以來，大部分抗菌藥物對之無效，曾一度引起人們恐慌。之后有學(xué)者研究報道，多黏菌素在體外具有顯著的抗超級細(xì)菌能力。目前在全球大多數(shù)地區(qū)，多黏菌素對G-菌依舊敏感，耐藥檢出率處于較低水平，因其顯著的抗G-多重耐藥菌療效，而被作為危重病患者抗感染治療的最后防線之一。隨著研究繼續(xù)深入，磷霉素、夫西地酸等老藥因在抗MDR菌方面的顯著療效也重獲關(guān)注［5］。老藥新用策略的合理使用，將更有效利用現(xiàn)有資源，并將可能產(chǎn)生的耐藥性最小化。

4 免疫療法

4.1 抗體 抗體是指機體在抗原刺激后而產(chǎn)生的具有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)，在人體被動免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因在前期動物實驗過程中發(fā)現(xiàn)了抗體在抗多重耐藥菌感染的積極療效，日益受到關(guān)注。但目前大多數(shù)抗體藥物正處于臨床試驗階段（表1）。

表1 抗多重耐藥菌感染的抗體

眾所周知，多重耐藥金黃色葡萄球菌（MRSA）已經(jīng)成為臨床感染上主要的耐藥陽性菌，MRSA在機體中引起炎癥反應(yīng)及生物膜的形成需要脂磷壁酸參與，Biosynexus公司針對脂磷壁酸研制出的嵌合抗體Pagibaximab，目前該藥物已開展相關(guān)臨床試驗。隨著廣譜抗生素在臨床的廣泛使用，重癥患者發(fā)生腸道艱難梭菌耐藥菌感染風(fēng)險逐漸增加，Merck公司研發(fā)了針對艱難梭菌毒素的單抗Bezlotoxumab，并在2017年先后被FDA和歐洲藥品管理局批準(zhǔn)上市，用于成人艱難梭菌的感染治療當(dāng)中［13-16］。疫苗的研制為耐藥菌的治療提供了一種新手段。

4.2 疫苗 接種疫苗是預(yù)防和控制耐藥菌感染的新策略，是減少疾病發(fā)生、減少醫(yī)療費用的有效手段，在動物模型中取得一定療效并獲得關(guān)注。不過針對耐藥菌的疫苗的研究，目前大多處于臨床前試驗或臨床試驗階段。

Jiang等［17］將toxAm基因和pcrV基因組合到真核質(zhì)粒pIRES上組成DNA疫苗pIRES-toxAmpcrV，在小鼠體內(nèi)，抗銅綠假單胞耐藥菌感染中有一定療效。Merck公司針對金黃色葡萄球菌靶點IsdB設(shè)計的亞單位疫苗V710在恒河猴模型中表現(xiàn)出免疫保護(hù)作用［18］，針對艱難梭菌毒素A和毒素B設(shè)計的亞單位疫苗VLA84，臨床試驗志愿者在接種疫苗后體內(nèi)抗毒素A和抗毒素B抗體滴度明顯增高，臨床預(yù)后獲得改善，該疫苗現(xiàn)已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗［19］。當(dāng)前結(jié)核桿耐藥菌在全球肆虐，而唯一針對結(jié)核分枝桿菌的疫苗卡介苗對敏感個體及已感染個體缺乏保護(hù)作用，H1/IC31疫苗是ESAT6蛋白和結(jié)核分枝桿菌抗原Ag85B輔以IC31佐劑制備而成，不過近期臨床試驗結(jié)果顯示，該疫苗可以有效增強感染患者保護(hù)性免疫能力［20］。

4.3 免疫佐劑 免疫佐劑又稱免疫調(diào)節(jié)劑或免疫增強劑，它可以增強免疫原性、抗體滴度，改變抗體產(chǎn)生的類型并引起或增強遲發(fā)超敏反應(yīng)，現(xiàn)有研究報道其在對耐藥菌感染的治療中可起到輔助作用。早期研究報道了抗菌肽、克拉霉素、磷霉素等具有免疫調(diào)節(jié)活性的作用，并在抗耐藥菌感染中起了一定療效。近期報道的一種佐劑，以Cremophor EL-35作為表面活性劑，丙二醇作為輔助表面活性劑，該佐劑可以提高血清中免疫球蛋白（Ig）G和相關(guān)亞類（如 IgG1，IgG2a和 IgG2b，以及 IgA）的特異性免疫應(yīng)答，并提高M(jìn)RSA感染小鼠的存活率［21］。Tocotrienols（T3s）是鮮為人知的維生素E異構(gòu)體，具有許多生物學(xué)特性，已被公認(rèn)為免疫調(diào)節(jié)劑，在MRSA引起的傷口感染的小鼠模型，T3S聯(lián)合達(dá)托霉素運用可顯著提高達(dá)托霉素的療效［22］。

5 基因編輯技術(shù)的運用

抗生素耐藥性與抗生素的使用相生相伴，由于抗生素的大量應(yīng)用，在動物及人體內(nèi)可誘導(dǎo)出抗生素耐藥基因，這些基因進(jìn)入環(huán)境以后，通過橫向轉(zhuǎn)移機制誘導(dǎo)耐藥菌的產(chǎn)生。目前通過（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）/常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白（associated proteins，Cas）CRISPR-Cas 技術(shù)可與全基因組測序及耐藥性突變篩選結(jié)合，使得CRISPRCas工具成為研究熱點，并已經(jīng)用于靶向特異序列的抗微生物制劑的設(shè)計生產(chǎn)［23，24］，通過 CRISPR/Cas技術(shù)對溫和及溶解性噬菌體進(jìn)行編程，可以致敏并殺死具有抗生素抗性的細(xì)菌［25］。Citorik等利用CRISPR-Cas技術(shù)設(shè)計的靶向特定DNA序列的RNA導(dǎo)向核酸酶（RGNs），該酶可通過噬菌體或攜帶質(zhì)粒的細(xì)菌有效地傳遞給微生物群體，靶向作用于微生物與抗生素耐藥性和毒力有關(guān)的基因序列，從而改善其耐藥性及減輕毒力提升感染小鼠模型的存活率［26］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)Cas9重新編程的靶向毒力基因可以殺死毒性金黃葡萄球菌，編程后的基因可破壞具有抗生素抗性基因的葡萄球菌質(zhì)粒，并在小鼠在體實驗中驗證了其對金黃色葡萄球菌殺滅功效［27］。

綜上所述，當(dāng)今全球AMR形勢十分嚴(yán)峻，對抗AMR之路任重道遠(yuǎn)。盡管現(xiàn)在針對AMR已經(jīng)有了較為系統(tǒng)的應(yīng)對策略，如改進(jìn)耐藥菌快速診斷技術(shù)、抗生素管理策略、抗生素新藥研發(fā)、老藥新用、聯(lián)合運用策略、噬菌體療法、抗菌肽療法、免疫療法、基因編輯技術(shù)等，但仍存在一定的局限性。部分策略尚處于研究的早期階段，不能用于臨床，或者臨床運用范圍較窄，效果有限，如基因編輯技術(shù)的實際運用，免疫佐劑、疫苗、抗體療法等策略。此外應(yīng)當(dāng)注意到，目前絕大部分新提出的抗生素耐藥性應(yīng)對策略亟須等待下一步的臨床轉(zhuǎn)化，將研究成果轉(zhuǎn)化為確實可行、安全有效的臨床抗AMR的新手段、新策略。人們有理由相信在不久的將來，AMR難題逐步會被攻克，耐藥問題會得到有效解決。