劉磊，郝亞亞，鄧素輝，王坤，李江，王麗華，樊春海，李嘉雋,＊，柳華杰,＊中國科學院上海應(yīng)用物理研究所，上海 20800

2中國科學院大學，北京 100049

1 引言

隨著納米材料的蓬勃發(fā)展和在生物、環(huán)境、醫(yī)學等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，其帶來的生物安全性以及生物效應(yīng)等問題引起了社會的廣泛關(guān)注。例如，納米金、銀等貴金屬納米顆粒在臨床醫(yī)學診斷和抗菌等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用1,2。目前科學家已經(jīng)從多個層次開展相關(guān)研究，例如在分子層面研究了納米材料與聚合物高分子、小分子、生物大分子的相互作用3,4，在細胞層面研究了納米材料與細胞及其微環(huán)境的相互作用5,6，在活體層面研究了納米材料進入活體的過程和生物效應(yīng)等等7,8。細胞作為生命活動的基本單元，研究其與納米材料的相互作用機制對于我們理解納米材料產(chǎn)生的效應(yīng)具有重要意義。

顯微鏡成像技術(shù)在研究貴金屬納米材料與細胞的相互作用中發(fā)揮著重要作用9。例如電子顯微鏡、原子力顯微鏡、近場掃描光學顯微鏡、暗場顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等，利用顯微鏡可以觀察貴金屬納米材料在細胞內(nèi)的分布和定位等信息。然而由于成像方法本身的特點以及所用探針性質(zhì)的限制，目前對于實時觀察貴金屬納米顆粒與細胞的相互作用還存在著巨大挑戰(zhàn)。例如電子顯微鏡不能對活細胞進行成像，原子力顯微鏡和近場掃描光學顯微鏡的掃描速率很慢等，這些都限制了其在細胞與納米材料相互作用實時研究中的應(yīng)用。單分子、單顆粒水平的熒光成像技術(shù)提供了揭示細胞內(nèi)單分子水平生化反應(yīng)動態(tài)過程的有效手段，使實時追蹤納米顆粒的運動和定位信息成為可能10-12。然而，現(xiàn)有的基于熒光探針的單顆粒成像方法通常存在一對無法克服的矛盾：一方面，為了實現(xiàn)較高的時空分辨率，我們需要借助大功率光源激發(fā)單顆粒上標記的熒光探針，以便在較短時間內(nèi)搜集足夠的熒光信號；而另一方面，強光源帶來的熒光漂白作用又限制了長時間實時成像的能力。

貴金屬納米顆粒具有獨特的局域表面等離子體共振(LSPR)特性，其發(fā)出的散射光可以被暗場顯微鏡(Dark Field Microscope，DFM)探測到。近年來的研究表明，基于納米金等顆粒自身的LSPR性質(zhì)，進行單顆粒暗場成像，避免了熒光成像方法的光漂白問題，因此成為了研究貴金屬納米顆粒與細胞相互作用的有效手段13-16。利用暗場顯微鏡，在單分子水平上對金屬納米顆粒的動態(tài)行為進行分析，對研究活細胞和組織的生物學行為、制備納米功能材料、開發(fā)新的傳感器具有重要意義17-19。例如，通過檢測金屬納米顆粒的散射信號，可以分析其與細胞、生物分子的相互作用，揭示其聚集狀態(tài)與胞內(nèi)運輸情況20-22。Xu小組通過單納米顆粒追蹤技術(shù)，成功觀察到其進入細胞的動力學過程23-25，以及細胞膜和細胞壁對攝入金屬納米顆粒的選擇性26。Raschke、Nusz等多個小組研究了單個納米金顆粒與生物大分子的結(jié)合，并發(fā)展了相關(guān)的納米傳感器27-29。何彥課題組30基于納米顆粒間距離變化導(dǎo)致的 LSPR光譜變化，發(fā)展了研究細胞膜表面力學信號傳導(dǎo)動力學的新技術(shù)。

上述對單個金屬納米顆粒的LSPR光譜研究，采用的都是暗場顯微鏡-光譜儀聯(lián)用裝置。但是，現(xiàn)有的商業(yè)化暗場顯微鏡由于自帶光源一般使用鹵素燈，光強度弱、光譜范圍窄，造成在進行單顆粒成像研究時，對散射信號較弱的樣品需要的光譜采集時間較長，對更弱的樣品甚至完全無法實現(xiàn)信號的采集。例如，對于粒徑在30 nm以下的小顆粒納米金，現(xiàn)有的商業(yè)化儀器無法在單顆粒尺度對其進行成像研究。另一方面，由于現(xiàn)有商業(yè)化儀器的封裝限制，只能進行細胞輪廓的結(jié)構(gòu)成像，無法進行功能成像，限制了對貴金屬納米顆粒與細胞相互作用研究的深入。例如現(xiàn)有暗場顯微鏡只能觀察到納米金進入細胞的過程和狀態(tài)，無法同時觀察其與特定的亞細胞結(jié)構(gòu)共定位，獲得納米金與細胞內(nèi)部相互作用的細節(jié)信息。

針對以上關(guān)鍵問題，本文首先通過設(shè)計重構(gòu)暗場顯微鏡的照明模式，實現(xiàn)了在單顆粒水平上，對散射信號較弱樣品的成功表征。我們利用超連續(xù)激光器作為外接光源，代替鹵素燈光源，在經(jīng)過光路耦合導(dǎo)入顯微鏡后，使對單個30 nm粒徑納米金的光譜采集時間可以縮短至1 ms。同時，對于細胞內(nèi)功能成像的需求，我們通過加裝光片成像系統(tǒng)，集成了熒光成像功能，可實現(xiàn)對亞細胞結(jié)構(gòu)進行性質(zhì)和功能上的分析。這一整合系統(tǒng)在商業(yè)化暗場下加裝了一條斜照明光路，通過精確調(diào)整斜入射照明光的高度，實現(xiàn)光片成像，并可以通過對濾塊的調(diào)整分別收集熒光信號和散射信號，實現(xiàn)多模式成像共定位。整套系統(tǒng)可以提供全光譜、高照明強度的暗場寬場照明模式以及暗場聚焦照明模式。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

Hela細胞購自上海生命科學研究院。3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、溶酶體染色劑(lysotracker)、CY3、胎牛血清(FBS)、雙抗青鏈霉素、胰酶(trypsin)均購買于英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，所有試劑未經(jīng)進一步純化直接使用。甲醇、乙醇購買自國藥集團化學試劑有限公司，分析純，可直接使用。納米金和納米銀購自生工生物工程(上海)股份有限公司，超純水稀釋之后直接使用。35 mm玻璃底培養(yǎng)板購于生友生物科技公司；蓋玻片、載玻片、細胞培養(yǎng)板和多孔板購于康寧公司。所有溶液采用Millipore系統(tǒng)的milli-Q超純水(18 M?·cm電阻)制備。所有光學透鏡和鏡架購于索雷博光電科技(上海)有限公司。

2.2 實驗過程

2.2.1 納米金成像樣品的制備

首先將納米金顆粒吸附在玻璃表面，玻璃表面根據(jù)參考文獻進行清潔和硅烷化處理31。具體地，將洗凈后的蓋玻片浸泡在摩爾濃度1% APTES的甲醇溶液中放置 12 h，然后依次用甲醇和超純水沖洗玻璃片以去除多余的APTES和甲醇，之后放在120 °C的烘箱中3 h進行老化。將20 μL濃度為 10-30 pmol·L-1的納米金溶液滴加在上述玻璃片上，5 min后用超純水沖洗玻璃片以除去沒有結(jié)合在玻璃片上的納米金，氮氣吹干后將玻璃片放在暗場顯微鏡的載物臺上進行觀察。

2.2.2 多模式全光譜暗場顯微鏡光路構(gòu)建

我們通過使用超連續(xù)激光器(NKT SuperK EXTREME EXW-12)作為照明光源，替代傳統(tǒng)的鹵素燈，并改變其照明方式。在保留暗場顯微鏡原有功能的情況下，完成了寬光譜采集、高采集速度的多模式成像暗場顯微鏡改造。如圖1光路圖所示，超連續(xù)激光器所產(chǎn)生的400-1200 nm波長的連續(xù)譜激光首先穿過由兩塊透鏡與一個針孔組成的空間濾波系統(tǒng)進行濾波與擴束。擴束后的激光由一塊中間帶有圓孔的反射鏡(ID1)反射，圓孔為橢圓形，長軸7 mm，短軸5 mm，長軸水平放置。此時，激光的外圍部分由反射鏡反射形成了環(huán)形光，中間部分則穿過了反射鏡的圓孔形成了光片照明模式的光源，直徑約5 mm。環(huán)形光被一組透鏡組(L3、L4)共軛至物鏡(OLYMPUS UPlanFLN)的后孔徑，并由后孔徑的邊緣被物鏡聚焦至一個尺度接近光學衍射極限的光斑。在原有濾片盒中二相色鏡的位置處安置一個尺寸與 ID1相同大小的圓孔反射鏡(ID2)。由樣品散射的光被同一個物鏡所收集，其中散射信號透過 ID2的中孔，由光分路器(FC)實現(xiàn)分光，并被 CCD(OLYMPUS DP70)或者光譜儀(PRINSTON SP2300i)所接收。

圖1 多模式全光譜暗場顯微鏡照明成像原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the multi-mode DFM.

該系統(tǒng)還整合了一套光片照明模式，從反射鏡(ID1)圓孔中透過的激光經(jīng)由反射鏡反射至樣品的斜上方，并由一塊400 mm焦距的柱狀凹面反射鏡(THORLABS CCM254-100-P01)聚焦，從側(cè)方形成100 μm厚度的光片，進行寬場照明。凹面反射鏡的高度調(diào)節(jié)可由手動升降臺提供。

2.2.3 納米金暗場光譜采集與成像

將涂有納米金的載玻片放在暗場顯微鏡的載物臺上，調(diào)節(jié)聚光鏡和物鏡的位置并移動載物臺，在視野里找到納米金并進行聚焦。切換使用60/0.5-0.9 NA的干物鏡，通過微調(diào)聚光鏡的位置來獲得最暗背景，微調(diào)Z軸和物鏡的數(shù)值孔徑(NA)來獲得最佳信噪比。調(diào)節(jié)CCD相機的曝光時間為100 ms，ISO靈敏度為400，獲取納米金的暗場照片。切換光路至光譜方向，利用配置了譜線600光柵的光譜儀，調(diào)整狹縫寬度來獲得單個納米金顆粒的光譜。

2.2.4 細胞內(nèi)納米金暗場成像

將HeLa細胞鋪在單孔玻璃底培養(yǎng)皿上，用1 ×PBS (磷酸緩沖液)將細胞洗滌2-3次，再加入0.2 mL含有 0.1 nmol·L-1納米金的培養(yǎng)基(gibco MEM)，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。觀察之前用1 × PBS洗滌 3-4次，并更換為不含酚紅的培養(yǎng)基后，放在載物臺上進行成像分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 多模式全光譜暗場成像原理

暗場顯微鏡又稱作暗視野顯微鏡，成像原理在于使用暗場聚光鏡將光源中間部分光線屏蔽并聚焦，使其避開物鏡的接收范圍，從而使檢測器只能接收到由樣品產(chǎn)生的散射光(見圖S1，Supporting Information)。在暗場模式下顯微鏡能極大的降低成像背景的亮度并提高成像信噪比，從而達到觀察弱散射信號樣品的目的。

傳統(tǒng)的暗場顯微鏡使用鹵素燈作為光源，其強度以及光譜范圍不足以對單顆粒金屬納米顆粒進行實時觀察。針對此，我們使用超連續(xù)激光器作為照明光源，并對光路進行重構(gòu)。我們采用一塊中間帶有圓孔的反射鏡將超連續(xù)激光器所產(chǎn)生的全光譜激光分為兩路。其中激光的外圍部分由反射鏡反射形成了環(huán)形光，這束高強度激光進而被物鏡聚焦在樣品上，產(chǎn)生較強的散射信號，極大地縮短了對單分子金屬顆粒采集光譜的時間。另一方面，激光的中間部分則穿過了反射鏡的圓孔形成了光片照明模式的光源，通過精確調(diào)整這束斜入射照明光的高度，我們可以提供寬光譜、高照明強度的暗場光片照明模式。通過在光路中加裝帶通濾片與選擇顯微鏡中與之對應(yīng)的濾片盒，該系統(tǒng)還能提供與暗場成像共定位的熒光成像功能。樣品所產(chǎn)生的散射光及熒光被同一個物鏡所收集，并進而被聚焦至CCD相機或光譜儀，可以分別實現(xiàn)暗場成像、熒光成像與光譜分析等功能。

通過以上改造，該儀器在基本暗場采集成像功能基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了400-1200 nm寬光譜暗場與熒光信號的采集與成像、單個30 nm粒徑納米金顆粒1 ms時間高采集速度的多模式成像功能。熒光成像與暗場成像相互補充，可實現(xiàn)對納米金顆粒與亞細胞結(jié)構(gòu)共定位功能成像。

3.2 暗場信號采集與成像性能的提升

暗場顯微鏡成像收集得到的信號通常與樣品的散射和照明光源強度相關(guān)。在本系統(tǒng)中，通過引入具有高照明光源強度的超連續(xù)激光器，可以實現(xiàn)對散射信號較弱的樣品光譜的快速采集。

首先，為了驗證光片模式下暗場成像效果的提升，我們分別使用了70 nm邊長的納米金三角片和50 nm粒徑的納米金球顆粒作為研究對象(圖2)。兩者的形貌使用透射電子顯微鏡進行了表征(圖2a，b)。圖2c是用普通鹵素燈作為光源對納米金三角片的暗場成像結(jié)果(曝光時間100 ms，ISO靈敏度為400，鹵素燈照明強度100%，輸出為DC 12 V 8.4 A)，分析后表明信號極其微弱。與之相反，圖 2e顯示在超連續(xù)激光暗場光片照明模式下(曝光時間100 ms，ISO靈敏度為400，照明強度20%，實測照明功率5.7 mW)，在大視野下可清晰地觀察到單個70 nm納米金三角片獨有的紅色特征峰的散射信號。對50 nm納米金球的表征反映了同樣的結(jié)果(圖2d，f)。在相同的曝光時間下(100 ms)，利用超連續(xù)激光使用光片照明，通過比較綠色特征峰的散射信號，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)(見表S1、S2，Supporting Information)，其信噪比相較于鹵素燈照明提高了 100倍(圖 2g，計算方法見 Supporting Information)。以上結(jié)果證明，我們自行搭建的超連續(xù)激光暗場成像系統(tǒng)在成像效果方面有了顯著提升。

圖2 超連續(xù)激光光源顯著提高納米金的信號強度Fig. 2 The contrast of the Signal intensity before and after improvement.

然后，我們將光片照明模式切換至聚焦模式來實現(xiàn)更大光強照明，提高光譜采集速度，借此實現(xiàn)對更小顆粒的快速信號采集，達到對納米金屬單顆粒進行實時光譜分析的目的。在對某一特定單顆粒進行光譜測量時，在聚焦模式下，通過嚴格控制照明光斑的形狀來實現(xiàn)照明中心的高強度，實現(xiàn)在極短時間內(nèi)收集到足夠強的光譜信號。圖3是在聚焦模式下獲得的30 nm納米金顆粒與40 nm納米銀顆粒的暗場成像信息與光譜數(shù)據(jù)。相對于光片照明，聚焦式照明的散射信號強度有了明顯提升。在實測照明總功率170.1 μW、曝光時間100 ms的條件下，納米金顆粒(圖3a)與納米銀顆粒(圖3c)具有很強的散射信號，甚至產(chǎn)生嚴重過曝現(xiàn)象。對兩者進行光譜分析(圖3b，d)，確定了納米金顆粒在540 nm、納米銀顆粒在480 nm有強散射特征峰。

圖3 多模式暗場聚焦模式成像Fig. 3 Imaging of Multi-mode DFM in focus illumination mode.

圖4 聚焦模式暗場測得30 nm金在不同曝光時間下的光譜信息Fig. 4 The spectrums of 30 nm gold nanoparticles with different exposure times measured in focus illumination mode.

在此基礎(chǔ)上，我們進一步優(yōu)化曝光時間，來獲得更快的時間分辨率，從而進行實時動態(tài)成像。我們對30 nm的納米金在聚焦模式照明下進行光譜分析，曝光時間分別為1、5、15、25 ms，如圖4所示。結(jié)果顯示，在聚焦模式下僅需1 ms的曝光時間就足以獲得完整的光譜信息，其特征峰與長時間曝光所得數(shù)據(jù)保持一致，這為觀察納米金屬顆粒的動態(tài)過程奠定了基礎(chǔ)。超高的時間分辨率可以及時捕捉生化事件的動態(tài)信息，極大的降低動態(tài)追蹤過程中重要信息和事件的丟失率。通過檢測光譜的實時變化可以判斷納米金的聚集狀態(tài)以及實時變化過程。

圖5 多模式暗場在生物分析的應(yīng)用Fig. 5 Application of the Multi-mode DFM in bioresearch.

3.3 多模式成像用于實際生物分析

該系統(tǒng)除了暗場模式，通過激發(fā)與發(fā)射濾塊的組合與切換，還能同時提供熒光成像模式來實現(xiàn)細胞內(nèi)熒光與納米金散射圖像的共定位，這為納米金顆粒在細胞內(nèi)的分布和定位提供了依據(jù)。

圖5為利用暗場成像模式和熒光成像兩種模式來觀察金納米顆粒進入細胞的過程。圖5a是用Cy3標記獲得的溶酶體熒光成像結(jié)果，5b為暗場成像模式下納米金顆粒的分布信息，5c是二者的共定位。從中可以看出，溶酶體和納米金有很好的共定位，初步反映納米金進入細胞后會被溶酶體吞噬。此外，我們還對納米金顆粒進行了實時追蹤檢測(見Supporting Information中的視頻)，可以通過其顏色與光譜的變化，觀察納米金的聚集過程。在整個追蹤過程中，暗場中首先觀察到初始的綠色亮點轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，表明單顆粒在進入細胞后發(fā)生了聚集，這可能反映了納米金被溶酶體所吞噬。然后，又轉(zhuǎn)變?yōu)閱晤w粒納米金所具有的綠色，這有可能是被溶酶體吞噬后又重新在胞內(nèi)釋放的結(jié)果。由此可見，改造后的多模式全光譜暗場顯微鏡既具有超高的時間分辨率，又具有熒光顯微鏡功能成像共定位的能力。通過對納米金等具有LSPR特性的探針進行長時間實時檢測，我們可以對亞細胞結(jié)構(gòu)里的生物生化反應(yīng)過程進行追蹤和分析，為研究納米材料與細胞的相互作用提供了有力手段。

4 結(jié)論

本文通過引入超連續(xù)光譜激光器，改變照明模式等對暗場顯微鏡進行改造，提高了暗場成像光源的亮度與光譜的范圍，大大提高單顆粒光譜采集的時間分辨率，拓展了光譜采集的波長范圍。在對納米金的檢測效果上，顯著提高了納米金的信號強度、檢測靈敏度和檢測速度。相較于改造之前的暗場-光譜儀聯(lián)用顯微鏡，我們獲得了高于鹵素燈照明 4個數(shù)量級的信號，可以檢測到尺寸低至30 nm的納米金顆粒、數(shù)目低至單個顆粒的光譜，同時可以將全光譜采集時間從100 ms縮短至1 ms。該體系可以顯著降低動態(tài)追蹤過程中重要信息和事件的丟失率，可以滿足實時研究生物體內(nèi)的生化反應(yīng)的需求，例如，蛋白-蛋白相互作用、核酸-蛋白相互作用等32-37。同時保留了暗場成像可長時間實時追蹤的優(yōu)勢。該成像系統(tǒng)可以更精確地用于細胞內(nèi)單顆粒的動態(tài)追蹤，為生物學基礎(chǔ)研究與生物醫(yī)學應(yīng)用提供有力的工具。同時我們還在商業(yè)暗場顯微鏡上實現(xiàn)了熒光成像和暗場成像的聯(lián)用，并用該系統(tǒng)證明了納米金進入細胞后定位在溶酶體內(nèi)部。該系統(tǒng)的成功搭建為研究納米材料與細胞的相互作用提供了有力手段。

Supporting Information:available free of chargeviathe internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.