薛麗霞，賴曉燕，鄭定容

1 深圳市寶安區(qū)西鄉(xiāng)預(yù)防保健所 (廣東深圳 518102)；2 寶安區(qū)中心醫(yī)院社區(qū)健康服務(wù)管理中心(廣東深圳 518102)

研究表明，葉酸缺乏會擾亂正常細胞的DNA合成、修復(fù)和甲基化，使孕婦具有致癌的易感性[1]。甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)和亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是兩種重要的葉酸代謝酶，具有重要的生理功能，其基因多態(tài)性會影響體內(nèi)同型半胱氨酸及葉酸的代謝水平。近年來，大量的臨床流行病學(xué)研究資料表明，MTHFR、MTRR與妊娠高血壓、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、神經(jīng)管畸形和心腦血管疾病的發(fā)生有密切關(guān)系[2-3]，嚴重影響母嬰的心身健康。本研究針對深圳市地區(qū)孕婦，開展MTHFR和MTRR基因多態(tài)性的分子流行病學(xué)分析，旨在闡明本地區(qū)人群的MTHFR和MTRR基因多態(tài)性遺傳特征，為深圳市地區(qū)孕婦個體化的孕期保健提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院2017年1月至2018年7月進行孕期檢查的孕婦2 466名作為研究對象，年齡18～45歲，平均(26.7±6.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)相互間無血緣關(guān)系；(2)孕婦知情并同意本研究；(3)深圳市戶籍；(4)同意進行口腔黏膜細胞采樣。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)患有精神類疾病無法配合；(2)患有風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾??；(3)嚴重肝腎功能不全；(4)合并有惡性腫瘤或其他惡性疾病。本研究均獲得深圳市寶安區(qū)西鄉(xiāng)預(yù)防保健所醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1試劑及儀器

Taq DNA聚合酶由德泰生物科技(南京)有限公司提供，dNTP由北京百奧萊博科技有限公司提供，牛血清白蛋白(BSA)由合肥博美生物科技有限責(zé)任公司提供，10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)緩沖液由上海遠慕生物科技公司提供，DNA片段長度標(biāo)準(zhǔn)物PBR322DNA/HacⅢ Makers由華美生物工程(廣州)公司提供，Hinf I限制性內(nèi)切酶及其緩沖液由北京百奧萊博科技有限公司提供，其余試劑為分析純。實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)儀器采用美國伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司 Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀，步驟均嚴格按照說明書進行操作及判定結(jié)果。

1.2.2引物的設(shè)計及合成

參照Tsuyoshi等[4]方法設(shè)計正反及探針義鏈，內(nèi)參基因為β-actin均由FAM標(biāo)記，由廣州中山大學(xué)達安基因有限公司合成，MTRR A66G、MTHFR A1298C和MTHFR C677T引物序列見表1。

表1 引物與探針序列

1.2.3PCR檢測

(1)PCR反應(yīng)體系：2×緩沖液10.0 μl，10.0 μmol/L的引物P1 1.0 μl，10.0 μmol/L引物P2 1.0 μl，模板DNA 1.0 μl，雙蒸H2O 7.0 μl。PCR反應(yīng)條件及循環(huán)：93 ℃變性2 min，95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，75 ℃延伸5 min，基因分析采用Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀自帶的基因分析應(yīng)用軟件，嚴格按照說明書進行操作及判定結(jié)果，再進行各組中MTRR A66G、MTHFR A1298C和MTHFR C677T的基因表達水平的比較。(2)質(zhì)量控制：每批次均設(shè)置陰性質(zhì)控和陽性質(zhì)控，試劑盒由中山大學(xué)達安基因股份有限公司提供，步驟嚴格按試劑盒使用說明操作，檢測服務(wù)由中山大學(xué)達安基因股份有限公司提供。

1.2.4標(biāo)本采集

采集受檢者首先用溫開水漱口，接著用醫(yī)用消毒棉簽在頰黏膜兩側(cè)輕刮多次，然后置于1.5 ml 0.9%氯化鈉注射液的離心管中，最后多次攪動棉簽讓口腔黏膜上皮細胞盡可能多地落入0.9%氯化鈉注射液中，之后用柱式抽提試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司提供)抽提DNA標(biāo)本；吸取5 μl DNA標(biāo)本，加水稀釋至1.0 ml，充分震蕩混勻，并應(yīng)用SWB-800型微量紫外可見分光光度計(由深圳市速王科技有限公司提供)260 nm和280 nm處讀取吸光度(OD)值，測定DNA濃度/純度，滿足濃度2～20 ng/μl，純度A260/A280=1.7～2.0，儲存于DW-40L188立式醫(yī)用低溫冰箱(由青島海爾集團有限公司提供)-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以率表示，多組間比較采用行×列表資料的χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

深圳地區(qū)孕婦MTHFR C677T位點基因型純合突變TT型頻率為15.8%(390/2 466)，高于廣東省惠州[5]的10.9%，低于河南省鄭州[6]的40.7%和河北省三河市[7]的37.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MTHFR A1298C位點基因型純合突變CC型頻率為5.8%(143/2 466)，高于河南省鄭州[6]的1.3%和河北省三河市[7]的2.3%，低于廣東省惠州[5]的7.2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；MTRR A66G位點基因型純合突變GG型頻率為3.8%(94/2 466)，低于廣東省惠州[5]的5.6%、河北省三河市[7]的7.5%和河南省鄭州[6]的5.4%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3 討論

廣東是我國出生缺陷高發(fā)省份之一，出生缺陷是導(dǎo)致圍生兒死亡的重要因素，也是影響人口素質(zhì)的重要因素，出生缺陷的發(fā)生受環(huán)境、營養(yǎng)和遺傳因素的共同影響。

MTRR和MTHFR是葉酸代謝的關(guān)鍵酶，MTHFR介導(dǎo)5，10-亞甲基四氫葉酸(MTHF)轉(zhuǎn)變成5-MTHF，在MTRR及其輔酶維生素B12的催化下提供一個甲基給同型半胱氨酸(Hcy)，使之轉(zhuǎn)化成為甲硫氨酸，而自身轉(zhuǎn)換為四氫葉酸。甲硫氨酸則在ATP供能的情況下轉(zhuǎn)化為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)，SAM是體內(nèi)生化反應(yīng)的甲基儲備物質(zhì)，可以為細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA甲基化反應(yīng)提供原料；THF是一種還原型葉酸，是輔酶形式的葉酸的母體化合物，對正常血細胞的生成具有促進作用；當(dāng)葉酸缺乏或葉酸相關(guān)的還原酶活性降低，使THF缺乏或者葉酸不能轉(zhuǎn)變?yōu)門HF，無傳遞碳單位，使多種生物合成受阻，造成巨幼紅細胞性貧血。在懷孕期，葉酸代謝通路發(fā)生障礙導(dǎo)致Hcy不能順利轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸，使血漿中Hcy濃度增高。Hcy是甲硫氨酸代謝產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，Hcy可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激促進炎癥反應(yīng)進程，容易引起孕婦血管內(nèi)皮細胞損傷和功能異常，引起胎盤血栓性病變，導(dǎo)致胎兒發(fā)生神經(jīng)管畸形。

MTHFR A1298C、C677T和MTRR A66G位點的多態(tài)性會降低酶活性，影響葉酸代謝和利用，與唇腭裂、唐氏綜合征、先天性心臟病、神經(jīng)管畸形等出生缺陷，以及妊娠高血壓、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等孕期疾病密切相關(guān)。

本研究首次分析了MTHFR A1298C、C677T和MTRR A66G基因多態(tài)性在廣東深圳地區(qū)孕婦中的分布情況，與已報道的其他地區(qū)的數(shù)據(jù)進行比較，顯示深圳地區(qū)孕婦MTHFR A1298C、C677T和MTRR A66G 位點多態(tài)性與其他地區(qū)漢族女性的頻率存在差異，該種差異可能與人群對多種疾病的群體易感性有關(guān)，具有不同的遺傳分布特征。

MTHFR C677T和MTRR A66G等位基因頻率呈現(xiàn)南方低北方高的趨勢，與我國出生缺陷發(fā)病率南方低北方高的趨勢基本一致；MTHFR A1298C突變等位基因頻率基本上呈現(xiàn)北方低南方高的趨勢。MTHFR C677T的C被T取代后氨基酸發(fā)生錯譯，位于催化區(qū)域的丙氨酸被纈氨酸代替會導(dǎo)致MTHFR的熱穩(wěn)定性和酶活性下降22%，MTHFR C677T的CT型和MTHFR A1298C的AC型存在協(xié)同作用，它們會導(dǎo)致對應(yīng)的MTHFR酶活性下降到正常的36%，嚴重影響葉酸在體內(nèi)的有效利用；MTRR A66G的A被G取代后氨基酸發(fā)生錯譯，位于催化區(qū)域的蘇氨酸被丙氨酸取代導(dǎo)致MTRR的熱穩(wěn)定性和酶活性下降，從而引起葉酸和甲硫氨酸代謝障礙，最終造成葉酸吸收的下降及Hcy在人體內(nèi)蓄積，MTRR A66G基因多態(tài)性導(dǎo)致神經(jīng)管畸形風(fēng)險增加2.6倍；如果在懷孕期間給孕婦補充葉酸，能夠?qū)⑾忍煨孕呐K病、神經(jīng)管缺陷和唇腭裂發(fā)生率降低至少60%。

綜上所述，深圳地區(qū)孕婦的MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布特征存在差異，通過對深圳地區(qū)孕婦進行遺傳篩查，針對存在葉酸代謝障礙的遺傳風(fēng)險人群，給予葉酸補充干預(yù)，更合理地指導(dǎo)孕婦增補葉酸，是有效達到出生缺陷及孕期疾病一級預(yù)防目的的重要方法。

表2 不同地區(qū)MTRR A66G和 MTHFR A1298C、C677T基因型分布比較[名(%)]