盧 菲， 王世杰， 陳 祥， 白仲虎， 楊艷坤

(1. 江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室， 無錫 214122； 2. 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122； 3. 江南大學 糖化學與生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122)

葉酸是一種B族維生素，在人腦部發(fā)育過程中起重要作用，孕初期組織快速增長，大量補充葉酸，可有效預防新生兒神經管畸形等疾病[1-2]。葉酸可以輔助體內一碳單位的轉移并維持同型半胱氨酸的平衡，已有研究明確表明葉酸能夠醫(yī)治高同型半胱氨酸敗血癥，從而降低了患者腦卒中的發(fā)病率[3]。在我國實施的葉酸干預重大研究，確定了預防神經管缺陷最佳的葉酸增補劑量，為全世界制定預防出生缺陷的公共衛(wèi)生政策提供了科學依據(jù)。結合當前的形勢要求，我們研究出更加簡易、準確且易推廣的葉酸檢測技術。

目前在應用中的葉酸檢測方法有微生物法、相關的儀器分析法以及免疫法。微生物法耗時長不穩(wěn)定，儀器分析雖靈敏準確但儀器費用昂貴，樣品前處理復雜污染大且需培訓專業(yè)人員操作，局限性大[4-5]。其中化學發(fā)光免疫分析法因具有化學發(fā)光的高靈敏度、線性范圍大和免疫分析的靈活的選擇性，逐漸成為發(fā)展趨勢[6-7]。

本試劑盒的研制旨在解決這些弊端并建立一種高效精準的葉酸檢測方法，所以研究出了一種生物素-親和素(Biotin-Avidin—System，BAS)反應體系[8]，以生物素-鏈霉親和素包被微孔板，使生物素化的葉酸結合蛋白能夠結合到微孔板上，葉酸酶標辣根過氧化物酶(FA-HRP)與待測血清中的葉酸競爭結合到結合蛋白上，檢測發(fā)光信號值。因為親和素與生物素間結合專一效率高，能提高反應的靈敏度且縮短反應時間，同時本研究創(chuàng)新地研制出了新的樣本處理試劑和方法，使血清葉酸在液體環(huán)境中能夠充分快速地釋放，簡化了前期樣本的處理工序。在本研究中，前期我們使用的多為進口葉酸結合蛋白，因為其很難通過基因表達得到，價格昂貴，所以在完成本試劑盒時也對葉酸結合蛋白進行了牛奶中的提取、純化方面的創(chuàng)新以及對其親和力進行了驗證，葉酸結合蛋白與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，對多藥和耐藥性的醫(yī)藥研究變革有著重大指導意義[9]，后期我們自主提取和純化后，得到了較高親和力的葉酸結合蛋白，大大縮減了成本。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用化學發(fā)光板購于美國Costar公司。生物素化試劑盒和FA-HRP由江蘇拜明生物技術有限公司提供。上海交通大學附屬仁濟醫(yī)院和復旦大學附屬金山醫(yī)院進行臨床實驗時隨機選取了200例臨床血清樣本及參比試劑檢測值。葉酸質控品購自美國伯樂公司，實驗前期葉酸結合蛋白購于美國scripps研究所。參比試劑盒為美國Beckman(貝克曼)公司生產的葉酸測定試劑盒(化學發(fā)光法)。

1.2 儀器

廈門天中達化學發(fā)光免疫分析儀，檢測儀器型號為TZD-CL-200S。洗板機購于英國Anthos公司，型號為Fluido2。平板震蕩儀購于上海漢林，型號為Mix-1500。電熱恒溫培養(yǎng)箱購于上海三發(fā)。Sorvall ST16R離心機和脫鹽柱購于美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 包被板的制備

制備生物素化牛血清白蛋白(BSA-Biotin)：稱取BSA 10 mg，用pH 7.0的1 mL磷酸緩沖液溶解；用生物化試劑盒完成生物素化后用緩沖液連續(xù)洗脫，去除游離的生物素，得到包被所用的BSA-Biotin。

包被：制備好的BSA-Biotin溶于包被液中，混勻。移液200 μL連續(xù)加入每個板孔中，37℃恒溫箱孵育2 h后，用含有Tween-20的PBSY洗液洗板4次。然后將鏈霉親和素用包被液溶解以同樣方式加入每孔中，最后加入封閉液進行37℃恒溫箱孵育，30 min后拍板吹干，密封。

1.3.2 校準品的配制

首先復溶中檢驗的葉酸對照品(100248—201203)，得到理論濃度為2.5、5、10和25 ng/mL的系列標準濃度點，用參比試劑盒貝克曼公司的葉酸檢測試劑盒(化學發(fā)光法)進行參考和賦值，然后裝瓶置于4℃保存。

1.3.3 最佳辣根過氧化物酶標葉酸(FA-HRP)、生物素化葉酸結合蛋白(FBP-Biotin)工作濃度的確定

因本研究采用競爭法即當FBP-Biotin或FA-HRP一方濃度相對過高或過低時都會對校準品曲線的形態(tài)造成影響，導致曲線梯度不分明，測值不準確等，所以要確定FA-HRP和FBP-Biotin的最佳動態(tài)濃度對需要從檢測校準品和質控品兩方面來入手。為減小非特異性吸附和底物等系統(tǒng)誤差對實驗信號值的影響，校準品最低信號值最好保持在50 000以上，經過預實驗后，選擇在濃度區(qū)間FA-HRP(0.1～0.3 μg/mL)、FBP-Biotin(0.2～0.6 μg/mL)篩選最佳工作濃度，對每一組濃度對作3組平行的校準品曲線和質控的測值，取校準品信號平均值作標準曲線用實測的質控信號代入標準曲線反算質控濃度，觀察校準品信號值梯度和反算質控品的準確度來選取最佳濃度對。

1.3.4 葉酸結合蛋白(FBP)的提取純化及親和力驗證

前期FBP來源主要為國外進口，成本較高，后期FBP主要來源為牛奶中提取純化。牛奶中有較多的FBP，且對血液中葉酸的主要活性形式具有較高的親和力，研究改良后的牛奶中FBP提取方法為：取HCl 調節(jié)新鮮牛奶至pH 3.0，4℃放置2 h；然后用NaOH調節(jié)至pH 4.8，40℃水浴30 min，紗布過濾后取稍渾濁的上清液，用離心機5000 r/min離心2 h，用0.22 μm濾膜過濾得澄清淡黃色溶液。期間可同時制備純化所用的FBP親和柱：取5 mL的EAH Sepharose 4B，用一定濃度的HCl和NaOH處理后，作為填料；取葉酸3 mg溶解于碳酸氫鈉溶液中，加入填料中沖洗偶聯(lián)并不斷用鹽酸調節(jié)pH值，至填料呈明黃色；向填料加入醋酸鈉和碳酸氫鈉溶液調節(jié)至pH 6，反應2 h后清洗填料，蛋白純化儀AKTA裝柱然后將處理后的牛奶溶液上柱純化，收取完成。

FBP親和力檢測方法：選擇進口FBP為對照組，純化所得FBP為實驗組，二者使用相同的包被工藝，工作濃度都為0.5 μg/mL包被于同一塊空白發(fā)光板上，再每孔加入相同的過量FA-HRP，比較兩組的發(fā)光信號值。 兩組實驗于同一塊發(fā)光板，相當于每組重復實驗48次。

1.3.5 樣本前處理方法

通過查找文獻確定強堿環(huán)境才能讓血清中的葉酸小分子與其結合蛋白分開，本研究選擇以硼酸為緩沖體系的強堿溶液作為變性劑[10-11]，二硫蘇糖醇(DTT)既具有變性作用還可以抗氧化，但在堿性條件下不穩(wěn)定，所以需另配制成穩(wěn)定劑，處理樣本前將變性劑與穩(wěn)定劑以1∶20的體積比混合制成樣本提取劑。由于整個酶促反應體系在接近pH中性的環(huán)境中進行[12]，因此在樣本處理后需要用中和劑將樣本pH調回中性，所以最后每離心管加入與樣品等量中和劑，樣品即處理完畢，待檢。

2 結果

2.1 包被工作液濃度的確定

化學發(fā)光板(SAC板)上加入不同濃度(1～10 μg/mL)BSA-Biotin的包被液后，再加入過量的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(SA-HRP)，檢測結果見圖1。表明BSA-Biotin在6 μg/mL時在SAC板上的結合量已經達到飽和。后續(xù)實驗即選用6 μg/mL作為BSA-Biotin的濃度。確定此濃度后，再加入不同濃度(2～14 μg/mL)的鏈霉親和素(SA)制備成不同的錨定蛋白液，用高濃度生物素作為樣本檢測，結果見圖2。表明SA包被濃度超過12 μg/mL后檢測信號強度已達到飽和，因此理論上12 μg/mL為最佳包被濃度。

2.2 校準品的賦值及校準曲線的繪制

貝克曼公司的葉酸檢測試劑盒賦值本研究校準品結果見表1。以實測值為準，定義葉酸校準品1～5的濃度分別為0、2.52、4.91、10.28和25.49 ng/mL。校準曲線以校準品濃度為X軸，所測信號值(RLU)為Y軸(見圖3)，校準曲線線性系數(shù)R2=0.9997。

表1 校準品賦值結果

圖1不同濃度包被BSA-Biotin對應檢測信號(RLU)

Figure 1 The RLU of different BSA-Biotin concentrations

圖2 不同濃度鏈酶親和素對應檢測信號

圖3 葉酸(FA)校準品曲線

2.3 最佳FA-HRP、生物素化FBP工作濃度的確定

實驗結果如表2所示，當生物素化FBP濃度為0.4 μg/mL，F(xiàn)A-HRP濃度為0.3 μg/mL時校準品信號值梯度適宜，測量質控品偏差小，均小于10%滿足檢測要求。

表2 濃度篩選結果

2.4 FBP親和力實驗結果

由來源為進口的FBP作為對照組，實驗純化所得的FBP作為實驗組，相同條件下發(fā)光值(RLU)對比結果如表3所示。兩組CV基本接近，說明包板誤差小，結果可信。相同條件下實驗組RLU平均值為6 996 210，對照組為4 189 347，兩組比值約為1.67，可說明本研究實驗純化所得的FBP較進口FBP親和能力高，可替代。

表3 質控品檢測結果

表4 試劑盒準確度檢測

2.5 試劑盒的性能驗證

2.5.1 最低檢出限

根據(jù)行業(yè)公認的最低檢測限方法通過平行3次測定10孔0 ng/mL 葉酸校準品，得到直接數(shù)據(jù)相對發(fā)光強度(RLU)，以及平均值(M)和標準差(SD)。利用劑量-反應曲線計算出(M-2SD)對應的濃度值為最低檢出限[13]。本試劑盒線性測量范圍為1.5～50 ng/mL，靈敏度為1 ng/mL，均居于國內領先。

2.5.2 準確度

根據(jù)精確度性能指標的相關方法，用標定濃度為2.5 ng/mL和15 ng/mL的伯樂質控品平行進行10次檢測，其檢測結果見表4，理論值與實測值的相對偏差均在±10%范圍內，證明本試劑盒準確度符合行業(yè)標準。

2.5.3 精密度

對高中低濃度(15、7和2.5 ng/mL)的伯樂質控進行隨機3個批次的平行10次檢測實驗，各質控檢測的平均數(shù)、標準差及變異系數(shù)(CV%)結果如表5，批內精密度小于10%，批間精密度小于15%，試劑盒精密度已能充分滿足檢驗要求。

表5 批內及批間精密度

2.5.4 熱穩(wěn)定性

將試劑盒各組分放置37℃下進行3、6和10 d的熱加速實驗，并與4℃冷藏條件下進行檢測對比，校準品的RLU下降幅度低于10%，伯樂質控品結果均穩(wěn)定，批內和批間精密度分別為2.1%～9.1%，8.2%～9.6%批內和批間精密度檢測均小于10%，熱加速穩(wěn)定性測試指標合格，說明本試劑盒可在2℃～8℃存放有效期可達到16個月，結果見表6。

表6 熱穩(wěn)定性考察結果

2.5.5 試劑盒的臨床應用

臨床實驗200份血清樣本的檢測結果如圖4。本試劑盒與參比試劑盒檢測結果的相關系數(shù)R2=0.9847，說明兩者的測定一致性高，可以替代參比試劑盒。

圖4 本試劑盒與參比試劑盒檢測血清樣本測定結果

3 討論與結論

目前血清的葉酸前處理面臨一個較大的困難，微生物法耗時較長且血清成分復雜，易產生不良代謝物影響實驗結果，熒光免疫分析等對血清葉酸的損耗較大，實驗誤差大。目前市場上流通較多的為葉酸酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，雖能大量檢測樣本但前處理樣本時需借助渦輪儀等儀器，方法復雜且反應時間長，線性窄誤差大，漏檢現(xiàn)象頻繁。同類型的化學發(fā)光試劑盒則樣品處理時間長，多為40 min以上，且存在葉酸釋放不充分、準確度不高等問題。本研究創(chuàng)新地采用了生物素-親和素(BAS)反應體系，成功將傳統(tǒng)的試劑與儀器處理相結合的復雜的樣品前處理，自主研發(fā)為純液體環(huán)境的試劑處理，并且快速充分地將葉酸小分子從血清樣本中提取出來。通過變性劑、穩(wěn)定劑和中和劑3種試劑的合理搭配，將前處理時間縮短到了20 min內，所用試劑安全、環(huán)保，使臨床操作更加安全便捷。并且改良了葉酸結合蛋白的提純方法，得到較高親和力的實用型蛋白，降低了整體的成本。研制成品的試劑盒的各項性能指標經驗證：最低檢出限為1 ng/mL，熱加速試驗下變異系數(shù)仍可保持在10%以內，有效期可達16個月，各項指標均居于國內領先水平，同時臨床實驗結果證實本試劑盒與參比試劑盒(Beckman)的檢測結果呈高度相關性。此研究為本試劑盒的臨床應用提供了理論支持，適用于大批量檢測，可替代國外同類試劑盒。

結合目前的市場發(fā)展，本研究可結合維生素B12、鐵蛋白、維生素D的檢測，研發(fā)相關儀器取代人工，完善孕婦的產前檢測等相關項目。磁珠是一種新興的反應載體和方式，它操作簡單，用時更短，可以大幅度提高分析檢測的靈敏度。本研究具有很大的進步空間，可以借助磁珠這一平臺進一步研發(fā)，擴大檢測量并縮短反應時間，提高檢測的準確程度，更加貼合市場需求。