冉 云， 張思嘉， 冉照收， 徐繼林， 廖 凱

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

縊蟶(Sinonovaculaconstricta)是常見(jiàn)的海鮮食材，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，蛋白質(zhì)占干重的50%以上，具有豐富的不飽和脂肪酸，特別富含淡水貝類缺乏的DHA、EPA等人體生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，已成為東南沿海的主要海水貝類養(yǎng)殖品種?？O蟶通常是在鮮活狀態(tài)下食用，經(jīng)蒸煮可產(chǎn)生麥芽酚、DMHF雜環(huán)類等物質(zhì)使之具有清甜、焦香味[3]。但在死亡狀態(tài)下，由于內(nèi)外源蛋白酶的分解、細(xì)菌繁殖以及生化反應(yīng)的發(fā)生，蟶肉組織會(huì)迅速發(fā)臭，以致不能食用[4]。其中三甲胺作為腐敗氣味關(guān)鍵性成分，在腐敗的海產(chǎn)品中極為常見(jiàn)，目前三甲胺已經(jīng)作為多種水產(chǎn)品新鮮度的判定參數(shù)[5-10]。因此，本文通過(guò)測(cè)定縊蟶在-20℃、4℃、26℃貯藏條件下的三甲胺(trimethylamine，TMA)含量變化，為縊蟶貯藏過(guò)程中的保鮮提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

在寧波寧海新捕撈的帶泥縊蟶加冰運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，從中挑選長(zhǎng)(7.11±0.18)cm，寬(2.37±0.05)cm的縊蟶，避光置于鹽度25 PSU(Practical salinity units，實(shí)用鹽標(biāo))的海水中暫養(yǎng)2 h后，隨機(jī)選取一部分縊蟶放入保鮮袋中于-20℃凍藏；剩余縊蟶分為兩部分，依然置于海水中，溫度分別為4℃和26℃。

1.2 儀器與試劑

7890B-7000C氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 (美國(guó)安捷倫儀器公司)；頂空進(jìn)樣系統(tǒng) (德國(guó)Gerstel公司)；VOCOL色譜柱(60 m×0.32 mm，0.18 μm, 美國(guó)Supelco公司)；分散機(jī)(T10基本型，不銹鋼材質(zhì)，鋸齒形分散刀具，德國(guó)IKA公司)。

標(biāo)準(zhǔn)三甲胺鹽酸鹽(純度≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；三氯乙酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：稱取三甲胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品0.0810 g，溶解在5%的三氯乙酸溶液中，定容至500 mL，相當(dāng)于濃度100 μg/mL的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，然后用5%的三氯乙酸溶液逐級(jí)稀釋成濃度分別為2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05和0.02 μg/mL的三甲胺標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

樣品制備：參照國(guó)標(biāo)GB5009.179—2016《食品中三甲胺的測(cè)定》，將3種貯藏溫度下的縊蟶分別取樣(-20℃的樣品先解凍)，去殼后在自然狀態(tài)下吸干多余水分，稱取約5 g(精確至0.001 g)樣品于50 mL的塑料離心管中，然后加入10 mL的5%三氯乙酸溶液，用分散機(jī)將其混合均勻后，以4000 r/min離心5 min，在玻璃漏斗上用三層濾紙將上清液濾入25 mL容量瓶，殘留物再分別用8 mL和5 mL 5%三氯乙酸溶液重復(fù)上述提取過(guò)程2次，合并濾液并用5%三氯乙酸溶液定容至25 mL進(jìn)行頂空氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，每組3個(gè)平行。

1.3.2 頂空進(jìn)樣條件

標(biāo)準(zhǔn)溶液頂空處理：分別取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL于20 mL頂空瓶中，擰緊瓶蓋，用醫(yī)用塑料注射器準(zhǔn)確注入5.0 mL 50%氫氧化鈉溶液，上機(jī)檢測(cè)。

三甲胺提取液頂空處理：準(zhǔn)確吸取2.0 mL提取液于20 mL頂空瓶中，擰緊瓶蓋，用醫(yī)用塑料注射器準(zhǔn)確注入5.0 mL 50%氫氧化鈉溶液，上機(jī)檢測(cè)。

頂空進(jìn)樣：將制備好的試樣在40℃平衡40 min，然后用Gerstel 2.5 mL自動(dòng)進(jìn)樣針抽取頂空瓶?jī)?nèi)液面上方的氣體250 μL，注入氣相色譜(GC)-質(zhì)譜(MS)聯(lián)用分析系統(tǒng)中進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 GC-MS檢測(cè)條件

GC條件：VOCOL色譜柱(60 m×0.32 mm×0.18 μm)；載氣為高純氦氣，流量1.6 mL/min。升溫程序：柱起始溫度40℃，保持3 min，以30℃/min升至200℃，保持1 min；采用分流進(jìn)樣模式，分流比為25∶1。

MS條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃。掃描方式為選擇離子掃描(SIM)，所選離子質(zhì)荷比分別為42、58和59。

1.3.4 數(shù)據(jù)的處理與分析

定性測(cè)定：以樣品溶液中三甲胺的保留時(shí)間(RT)、定量離子(m/z 58)、輔助定性離子(m/z 59和m/z 42)定性，并以試樣溶液中三甲胺的輔助定性離子和定量離子峰度比(Q樣品)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中三甲胺的輔助定性離子和定量離子峰度比(Q標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行比較(相對(duì)偏差控制在±15%以內(nèi))輔助定性。

定量測(cè)定：用外標(biāo)法定量。縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液中三甲胺的峰面積，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液中三甲胺的濃度，以此繪制校準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣溶液中三甲胺的濃度。

2 結(jié)果與分析

新起捕的帶泥縊蟶兩片貝殼閉合緊密，足部和水管伸縮靈活，肌肉白嫩堅(jiān)實(shí)，手感爽滑、極富彈性。常溫26℃下在海水中靜養(yǎng)1 d之后，縊蟶活躍度有所下降，2 d后則已死亡，貝殼關(guān)閉不緊甚至有的已經(jīng)張開(kāi)，足和水管失去伸縮能力，肉質(zhì)灰暗比較松散，手感黏滯、彈性很差并散發(fā)出腥臭味。4℃下縊蟶在海水中靜養(yǎng)，從第1天到第4天，除了活動(dòng)能力減弱，其他未見(jiàn)明顯變化；但到第8天時(shí)，已徹底失去活動(dòng)能力，肌肉仍有彈性，無(wú)異味，對(duì)外界刺激無(wú)任何反應(yīng)。-20℃凍藏縊蟶，從第1天到第30天，未發(fā)生明顯感官變化。從上述縊蟶的感官變化可以發(fā)現(xiàn)，在常溫26℃和4℃冷藏條件下，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，縊蟶的生命力在逐漸下降，為了更客觀、靈敏地表述這種變化，本研究采用檢測(cè)三甲胺含量來(lái)表征縊蟶貯藏過(guò)程中的新鮮度。

三甲胺有魚(yú)腥惡臭，是一種污染物質(zhì)，對(duì)人的眼、鼻、咽喉和呼吸道有刺激作用，常用作評(píng)價(jià)魚(yú)類新鮮度的一個(gè)指標(biāo)，最早發(fā)現(xiàn)是由微生物分解甜菜堿、膽堿和氧化三甲胺而來(lái)[11]。有研究認(rèn)為：新鮮活體中三甲胺以氧化物的形式存在，用于維持肌肉細(xì)胞正常生理功能，當(dāng)生物體死亡后，體內(nèi)的還原酶將三甲胺氧化物分解為三甲胺，從而釋放出刺鼻氣味；另外，生物體內(nèi)的卵磷脂在微生物作用下也會(huì)分解產(chǎn)生三甲胺[12]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了常溫26℃、4℃冷藏以及-20℃凍藏條件下三甲胺含量隨貯藏時(shí)間的變化(表1)。

表1 不同貯藏條件下縊蟶中三甲胺含量變化

結(jié)果表明，新采捕的帶泥縊蟶，在自然凈化2 h后第一次取樣檢測(cè)三甲胺濃度最低(0.322 mg/kg)。隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，3組置于不同溫度下的縊蟶三甲胺含量都呈上升趨勢(shì)：常溫26℃條件下從2 h到24 h，三甲胺含量增加較慢，而從24 h到48 h則急劇增多，48 h時(shí)死亡腥臭的縊蟶檢測(cè)到的三甲胺含量已高達(dá)13.954 mg/kg；4℃下養(yǎng)在海水中的縊蟶到第4天時(shí)仍然存活，三甲胺含量雖有所上升但增速較緩，第8天時(shí)縊蟶已失去生命活力，此時(shí)測(cè)得的三甲胺含量已經(jīng)上升到1.369 mg/kg；而在-20℃下貯藏的縊蟶，三甲胺含量上升趨勢(shì)比較緩慢，貯藏30 d時(shí)濃度僅為0.564 mg/kg。

可用于評(píng)價(jià)水產(chǎn)品貯藏過(guò)程中鮮度的指標(biāo)有揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)、三甲胺(TMA)、菌落總數(shù)(TVC)、產(chǎn)硫化氫細(xì)菌及假單胞菌數(shù)等，在用三甲胺表征水產(chǎn)品新鮮度或腐敗情況時(shí)，有研究提出100 mg/kg為魚(yú)類三甲胺含量的上限[13]，當(dāng)然有些生物品種的限量會(huì)低于此標(biāo)準(zhǔn)，比如小黃魚(yú)三甲胺含量超過(guò)35 mg/kg時(shí)，魚(yú)肉就開(kāi)始腐敗變質(zhì)[14]，這可能與生物體生長(zhǎng)環(huán)境及菌群差異有關(guān)[15-17]。但這些數(shù)值顯然不適用于縊蟶。由表1可見(jiàn)，4℃下縊蟶完全失去活動(dòng)能力時(shí)三甲胺的濃度也只有(1.369±0.008) mg/kg，所以對(duì)于縊蟶而言，用三甲胺表征新鮮度時(shí)其濃度值以小于1.3 mg/kg為宜。縊蟶三甲胺上限遠(yuǎn)低于魚(yú)類的原因，可能跟貝類蛋白質(zhì)組成跟魚(yú)類有著明顯的差異[18-19]以及共生菌群存在差異有關(guān)[20-21]。

隨著貯藏時(shí)間的加長(zhǎng)，縊蟶在微生物的作用下，蛋白質(zhì)、氨基酸和體內(nèi)其他含氮物質(zhì)被逐漸分解，產(chǎn)生三甲胺、氨、組胺、硫化氫和吲哚等產(chǎn)物，這是造成縊蟶腐敗變質(zhì)繼而散發(fā)出腥臭味的主要原因。這些微生物多為腐敗細(xì)菌，主要來(lái)自水中，有假單胞菌屬、小球菌屬、產(chǎn)硫化氫菌屬等[22]。而低溫條件不利于此類細(xì)菌的生長(zhǎng)，表1也表明縊蟶中三甲胺的增長(zhǎng)明顯受到低溫的抑制，可見(jiàn)低溫有利于維持縊蟶的新鮮度。

3 結(jié)論

本研究為縊蟶貯藏過(guò)程中新鮮度的變化提供了理論參考。三甲胺的總量隨貯藏時(shí)間加長(zhǎng)而不斷增加，常溫26℃條件下增長(zhǎng)較快，隨著縊蟶死亡而急劇增加，帶有刺鼻的腥臭味，細(xì)菌腐敗是造成縊蟶變質(zhì)發(fā)臭的主要原因；4℃低溫冷藏情況下三甲胺含量增加緩慢，低溫抑制了腐敗微生物的生長(zhǎng)繁殖；-20℃低溫凍藏在30 d時(shí)，三甲胺含量依然很低，相對(duì)來(lái)說(shuō)縊蟶依然處于比較新鮮的狀態(tài)。