潘以紅, 范雪萌, 朱 平

(江南大學(xué) 理學(xué)院， 無錫 214122)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，已成為城市人口惡性腫瘤死亡原因的第一位[1]。肺癌是一種異質(zhì)性疾病，基因突變、細(xì)胞環(huán)境和生活環(huán)境的變化都可能影響腫瘤的形成、生長和轉(zhuǎn)移[2]。在過去的幾十年里，人們應(yīng)用了手術(shù)切除、化療和放射治療在內(nèi)的多模式治療策略，但肺癌患者的預(yù)后仍然不令人滿意[3]。由于人們對(duì)肺癌潛在發(fā)展的分子機(jī)制缺乏精確了解，不能夠?qū)ν砥诜伟┻M(jìn)行有效治療。因此，迫切需要新的生物標(biāo)志物來用于診斷、預(yù)后和藥物反應(yīng)，以開發(fā)有效的治療方法來改善肺癌的臨床結(jié)果。

近年來，許多研究表明有多個(gè)基因和多種細(xì)胞通路參與了肺癌的發(fā)生和發(fā)展。例如，HMGN5(High mobility group nucleosome 5)在肺癌組織中過表達(dá)，其表達(dá)程度與肺癌組織的分化程度和TNM分期有關(guān)[4]。ROR2(Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor2)或Wnt5a的過表達(dá)和肺癌預(yù)后不良顯著相關(guān)，對(duì)ROR2和Wnt5a表達(dá)水平的檢測有助于肺癌的預(yù)后[5]。肺癌組織中HMGA2(High-mobility group AT-hook 2)、Tiam1(T-lymphoma invasion and metastasis1)、Notch1(Notch homolog 1)的表達(dá)量顯著升高，高表達(dá)的HMGA2能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、Tiam1能夠促進(jìn)細(xì)胞侵襲、Notch1能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。在肺癌的不同TNM分期(IA、IB、IIA、IIB、IIIA、IIIB、IV)中，細(xì)胞周期通路(Cell cycle)、孕酮介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟通路(Progesterone-mediated oocyte maturation)和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路(Oocyte meiosis)都同時(shí)被激活，這些通路可能是肺癌診斷和治療的潛在標(biāo)記[7]，等等。盡管這些研究已經(jīng)確定了肺癌的一些預(yù)測基因和通路，但還不足以為肺癌的治療提供更有針對(duì)性的方案，因此需要更多的預(yù)測生物標(biāo)志物。

某些基因表達(dá)水平的改變會(huì)導(dǎo)致含有這些基因的通路功能異常，同時(shí)也會(huì)對(duì)其他通路功能產(chǎn)生影響，促使癌癥的發(fā)生和發(fā)展。串話基因是指同時(shí)出現(xiàn)在兩條或多條通路中的基因，這些基因?qū)⒉煌耐逢P(guān)聯(lián)起來，可以將某條通路的異常傳遞給其他通路。研究發(fā)現(xiàn)EPAS-1 / HIF-2α與PXR信號(hào)通路之間的串話基因是胃癌細(xì)胞多藥耐藥的調(diào)節(jié)因子[8]。SKP2被證實(shí)可以作為串話基因，通過影響不同的信號(hào)通路，參與癌癥的發(fā)展[9-10]。

微陣列是用于分析基因表達(dá)的高通量平臺(tái)，是醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)領(lǐng)域中很有前景的技術(shù)。微陣列具有較廣的臨床應(yīng)用，在從癌癥的分子診斷到分子分類、從患者分層到預(yù)后預(yù)測、從新的藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)到腫瘤反應(yīng)的預(yù)測等方面都有較好的表現(xiàn)[11-13]。微陣列技術(shù)與生物信息學(xué)分析工具相結(jié)合能夠全面分析肺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中基因的表達(dá)變化情況。

GEO(Gene expression omnibus)是一個(gè)包含微陣列數(shù)據(jù)和下一代測序數(shù)據(jù)的公共數(shù)據(jù)儲(chǔ)存庫。為探討肺癌潛在預(yù)測和治療的新生物標(biāo)志物，從GEO數(shù)據(jù)庫篩選和下載了肺癌的微陣列數(shù)據(jù)，將肺癌細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)與正常細(xì)胞的基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，使用logistic回歸和倍數(shù)法相結(jié)合篩選出差異表達(dá)基因。通過對(duì)差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)交互(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因篩選以及關(guān)鍵基因的通路富集分析進(jìn)一步了解肺癌在分子水平上的發(fā)展情況。最后利用失調(diào)的通路中串話基因建立肺癌的預(yù)測模型，對(duì)潛在的候選生物標(biāo)志物進(jìn)行探索，以用于肺癌的診斷、預(yù)后以及作為藥物靶點(diǎn)。

1 數(shù)據(jù)來源

本文從GEO數(shù)據(jù)庫下載了基因芯片GSE19188、GSE40791。GSE19188數(shù)據(jù)集中包含91個(gè)肺癌患者樣本和65個(gè)正常樣本[14]。GSE40791數(shù)據(jù)集中包含100個(gè)肺癌患者樣本和94個(gè)正常樣本[15]。

2 方法

2.1 Logistic回歸篩選差異表達(dá)基因

本文使用的是GEO數(shù)據(jù)庫中經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化后的基因表達(dá)的矩陣序列數(shù)據(jù)。首先進(jìn)行數(shù)據(jù)整合，剔除沒有相對(duì)應(yīng)基因名的數(shù)據(jù)；如果多個(gè)探針號(hào)對(duì)應(yīng)一個(gè)基因名，則取多個(gè)基因表達(dá)值的均值。

本文將數(shù)據(jù)集中樣本性狀信息設(shè)為0-1的M矩陣，0代表正常人樣本，1代表肺癌患者樣本。將樣本性狀信息矩陣M與樣本中基因表達(dá)值矩陣N進(jìn)行逐列分析，來篩選出肺癌樣本和正常樣本中差異表達(dá)的基因。因變量為是否患癌，自變量為基因。由于樣本性狀信息矩陣M為0-1型因變量矩陣，因此采用針對(duì) 0-1 型因變量的 Logistic回歸模型[16]。

考慮具有n個(gè)獨(dú)立變量的向量X=(X1,X2,…,Xn)，設(shè)條件概率P(Y=1|X)=p為根據(jù)觀測量相對(duì)于某事件X發(fā)生的概率。Logistic回歸模型可以表示為

(1)

事件發(fā)生與不發(fā)生的概率之比為

(2)

(3)

(4)

可對(duì)Y進(jìn)行線性回歸。

本文是逐列比較，概率方程為：

(5)

式(5)中Xi為第i個(gè)基因的表達(dá)值，設(shè)p為患癌概率，取分界點(diǎn)0.5為是否患癌的分界值。但不知道患癌與否的概率p的準(zhǔn)確值，為了方便做回歸運(yùn)算取區(qū)間中值，即p=0.75對(duì)應(yīng)Y=1，p=0.25對(duì)應(yīng)Y=2。

本文使用matlab R2012b實(shí)現(xiàn)回歸分析，計(jì)算出p值?；貧w分析過程中，當(dāng)進(jìn)行一次假設(shè)時(shí)，得到的結(jié)果的可靠性較高，但當(dāng)連續(xù)進(jìn)行檢驗(yàn)的時(shí)候，其結(jié)果的可靠性就會(huì)大大降低，從而出現(xiàn)假顯著性問題，因此本文采用FDR錯(cuò)誤控制法對(duì)p值進(jìn)行校正。

本文以校正p值小于0.05及|logFC|>1.5為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因。

2.2 肺癌特異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

STRING數(shù)據(jù)庫是一個(gè)搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測蛋白質(zhì)之間相互作用的系統(tǒng)。這種相互作用既包括蛋白質(zhì)之間直接的物理相互作用，也包括蛋白質(zhì)之間間接的功能相關(guān)性[17]。Cytoscape是一個(gè)用于圖形化顯示蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析和編輯的軟件平臺(tái)。它能夠?yàn)榫W(wǎng)絡(luò)添加豐富的注釋信息，并且可以利用自身以及第三方開發(fā)的大量功能插件，針對(duì)網(wǎng)絡(luò)問題進(jìn)行深入分析[18]。本文使用STRING在線工具，以得分>0.4為標(biāo)準(zhǔn)，選取差異表達(dá)基因的互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)。利用Cytoscape軟件繪制肺癌的特異PPI網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)特異PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治?，包括?jié)點(diǎn)的度分布、接近中心性、聚類系數(shù)以及平均最短路徑等。最后使用MCODE插件獲得網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)大于10的重要子模塊，通過DAVID在線工具[19]對(duì)最大的子網(wǎng)絡(luò)中的差異基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)功能富集分析。Gene Ontology可分為分子功能、生物過程和細(xì)胞組成3個(gè)部分。蛋白質(zhì)或者基因可以通過ID對(duì)應(yīng)或者序列注釋的方法找到與之對(duì)應(yīng)的GO號(hào)，即功能類別或者細(xì)胞定位。

2.3 特異PPI網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因的篩選

根據(jù)特異PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)(基因)的度和基因表達(dá)的差異得分篩選出差異表達(dá)基因中的關(guān)鍵基因。首先定義每個(gè)基因的表達(dá)區(qū)間I:(AVG-AD,AVG+AD)，其中AVG為基因在正常樣本中的表達(dá)值均值，AD為基因在正常樣本中表達(dá)值的平均差。平均差含義明確，能夠較全面、客觀地反映變量數(shù)列標(biāo)志值平均變動(dòng)程度[20]。在癌癥樣本中如果某個(gè)基因的表達(dá)值超出了區(qū)間I，我們就把這個(gè)超出的數(shù)值用于計(jì)算差異得分。差異得分計(jì)算公式如下:

(6)

W=degree×score

(7)

其中，di表示癌癥樣本i中某基因表達(dá)值，若di大于AVG+AD，則d值為AVG+AD;若di小于AVG-AD，那么d值就為AVG-AD。我們用log2函數(shù)將節(jié)點(diǎn)的度值標(biāo)準(zhǔn)化。最后，計(jì)算得出W值，并將差異表達(dá)基因排序。

在PPI網(wǎng)絡(luò)中，差異得分和度較大的基因和肺癌關(guān)系較為密切，即為我們挑選出的關(guān)鍵基因。本文中，我們分別挑選了兩個(gè)數(shù)據(jù)集中W值排名前100和后150的基因，并進(jìn)行重疊之后選出共同的基因作為關(guān)鍵基因。

2.4 關(guān)鍵通路的富集分析及串話基因的選取

使用DAVID在線工具對(duì)篩選出的關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG通路分析。KEGG通路數(shù)據(jù)庫是一個(gè)手工畫的代謝通路的集合，包含以下幾方面的分子間相互作用和反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)：新陳代謝、遺傳信息加工、環(huán)境信息加工、細(xì)胞過程、生物體系統(tǒng)、人類疾病和藥物開發(fā)。本文選取P<0.05的通路作為最后結(jié)果，根據(jù)通路得分對(duì)樣本進(jìn)行分層聚類分析。每個(gè)樣本中的通路得分計(jì)算公式如下：

(8)

通過斯皮爾曼等級(jí)相關(guān)系數(shù)，得到通路間相關(guān)程度，公式如下：

(9)

相關(guān)系數(shù)在(0，1)之間，則通路正相關(guān);相關(guān)系數(shù)在(-1, 0)之間，則通路負(fù)相關(guān)。最后在顯著相關(guān)的通路中，挑選出差異表達(dá)基因中的串話基因。

2.5 預(yù)測模型的建立及驗(yàn)證

將2.4中得到的串話基因作為預(yù)測基因，采用支持向量機(jī)(support vector machine,SVM)建立肺癌預(yù)測模型。將所得串話基因在數(shù)據(jù)集GSE19188的156個(gè)樣本中表達(dá)值作為訓(xùn)練集，采取五折交叉驗(yàn)證確定核函數(shù)和最優(yōu)參數(shù)C和g，用數(shù)據(jù)集GSE40791進(jìn)行測試。最后使用生物信息學(xué)中預(yù)測(分類)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：總體準(zhǔn)確率(accuracy, ACC)、敏感性(sensitivity, SN)、特異性(specificity, SP)和馬修斯相關(guān)系數(shù)(Matthew’s correlation coefficient, MCC)來衡量模型的分類結(jié)果。ACC、SN、SP、MCC的定義如下：

(10)

(11)

(12)

(13)

其中，TP表示正確預(yù)測到的正例個(gè)數(shù)；TN表示正確預(yù)測到的反例個(gè)數(shù)；FP表示把反例預(yù)測成為正例的個(gè)數(shù)；FN表示把正例預(yù)測為反例的個(gè)數(shù)。

圖1 兩個(gè)數(shù)據(jù)集的重疊分析結(jié)果Figure 1 Overlap analysis of two data sets

3 結(jié)果及分析

3.1 差異表達(dá)基因

從數(shù)據(jù)集GSE19188和GSE40791中分別篩選出差異基因1020個(gè)和1770個(gè)。對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因做重疊分析篩選出808個(gè)相同基因(圖1)，其中，有805個(gè)基因在兩個(gè)數(shù)據(jù)集中都呈現(xiàn)了相同的表達(dá)趨勢，分別為214個(gè)上調(diào)基因和591個(gè)下調(diào)基因。

3.2 肺癌特異PPI網(wǎng)絡(luò)分析

本文從STRING 數(shù)據(jù)庫中得到了805個(gè)差異表達(dá)基因中的632個(gè)基因之間6312對(duì)互作關(guān)系，利用Cytoscape軟件構(gòu)建出差異表達(dá)基因的特異PPI網(wǎng)絡(luò)，即此網(wǎng)絡(luò)包含632個(gè)節(jié)點(diǎn)，6312條邊(圖2)。

特異PPI網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)拓?fù)涮卣鲄?shù)如圖3所示，基因數(shù)目以1-632的數(shù)字編碼表示。網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)度分布遵循了冪律分布(圖3-A)，大多數(shù)節(jié)點(diǎn)的度較小，少數(shù)節(jié)點(diǎn)的度較大，節(jié)點(diǎn)度分布集中在0-20及80-100的區(qū)域，這種差異可能是由于網(wǎng)絡(luò)中存在高密度連接的模塊造成的。節(jié)點(diǎn)連接的接近中心性分布在0.2～0.4之間(圖3-B)，表明了特異PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)良好的連通性，差異表達(dá)基因之間的功能關(guān)系較為密切。網(wǎng)絡(luò)高連通蛋白的聚集系數(shù)大于0.7(圖3-C)，表明聚集程度較高。平均最短路徑的峰值集中在2.5～4區(qū)域(圖3-D)，因此，特異PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)均呈現(xiàn)出一定的聚集區(qū)域，表明在網(wǎng)絡(luò)中存在多個(gè)功能模塊。

圖2 特異蛋白交互網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Protein-protein interaction network

A：度分布；B：接近中心性；C：聚類系數(shù)；D：平均最短路徑

圖3特異PPI網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)拓?fù)涮卣鲄?shù)
Figure 3 Topological properties of protein-protein interaction network

3.3 特異PPI網(wǎng)絡(luò)中重要模塊的功能性分析

通過MCODE插件得到了特異PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)大于10的4個(gè)重要子模塊，如表1所示。

表1 4個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)大于10的子模塊Table 1 Four modules with more than 10 nodes

圖4特異蛋白網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)絡(luò)
Figure 4 The largest subnetwork of protein-protein interaction network

第一個(gè)模塊中包含85個(gè)差異表達(dá)基因，是特異網(wǎng)絡(luò)中最大的子網(wǎng)絡(luò)(圖4)。其他模塊分別包含31、31和34個(gè)差異表達(dá)基因。本文對(duì)最大的子網(wǎng)絡(luò)做GO富集分析，結(jié)果如表2所示?？梢钥闯?，子網(wǎng)絡(luò)中所含的差異基因，參與多個(gè)生物學(xué)過程包括細(xì)胞分裂、胚胎形成，蛋白結(jié)合等，與細(xì)胞周期有密切的相關(guān)性。

表2 最大子網(wǎng)絡(luò)的GO富集分析Table 2 GO enrichment analysis of the largest subnetwork

3.4 關(guān)鍵基因的通路分析

對(duì)差異表達(dá)基因的差異得分和進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后的度值做乘積運(yùn)算，得到W值，并根據(jù)W值從兩個(gè)數(shù)據(jù)集挑選出209個(gè)關(guān)鍵基因。這些基因的表達(dá)值與正常樣本相比存在顯著偏差，并且處于特異PPI網(wǎng)絡(luò)中的中心位置，與肺癌的發(fā)生和發(fā)展都有重要關(guān)系。

對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集中W絕對(duì)值排名前150個(gè)關(guān)鍵基因中的123個(gè)相同關(guān)鍵基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，一共得到P<0.05的11條通路(表3)。其中，上調(diào)通路7條，下調(diào)通路4條。關(guān)鍵基因主要在細(xì)胞周期、癌癥、信號(hào)以及代謝等通路上富集，這表明了肺癌的發(fā)生和發(fā)展的潛在機(jī)制。細(xì)胞周期的紊亂可能導(dǎo)致癌癥的發(fā)生，而信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝的異?？赡芘c癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、疾病的復(fù)發(fā)和凋亡有關(guān)。

表3 關(guān)鍵基因的KEGG通路富集分析Table 3 Pathway enrichment of the key genes

隨機(jī)選取數(shù)據(jù)集GSE19188中61個(gè)癌癥(Cancer)樣本和50個(gè)正常(Normal)樣本，分別計(jì)算每個(gè)樣本的通路得分得到層次聚類結(jié)果(圖5)，表明11條通路的得分可以清楚地對(duì)正常樣本和癌癥樣本進(jìn)行區(qū)分。上調(diào)通路的變化趨勢顯著，下調(diào)通路在某些癌癥樣本中下調(diào)趨勢不顯著，可能是由于在癌癥樣本中，這些通路對(duì)癌癥的發(fā)展還存在一定的抑制作用。

通路間相關(guān)系數(shù)如表4所示。標(biāo)注*表明兩條通路相關(guān)性不顯著。在相關(guān)性顯著的通路中同時(shí)存在的基因，我們選取其作為串話基因，這些基因的差異表達(dá)暗示其所在通路出現(xiàn)異常。一共得到了18個(gè)串話基因，其中，CCNE2在5條通路中出現(xiàn)；MAD2L1、CDK1在4條通路中出現(xiàn)；CHEK1、CDC20、PTTG1、CCNB1、CCNA2、FOS及IL6在3條通路中出現(xiàn)；BUB1B、MCM2、PPARG、MMP1、MMP9、BIRC5、CD36和POLE2在2條通路中出現(xiàn)。

圖5 11條通路的層次聚類分析Figure 5 Hierarchical clustering analysis of 11 pathways

3.5 預(yù)測模型建立及評(píng)價(jià)

輸入數(shù)據(jù)集GSE19188中18個(gè)串話基因的表達(dá)值，分別試用不同的核函數(shù)來訓(xùn)練模型，利用數(shù)據(jù)集GSE40791進(jìn)行測試，分別統(tǒng)計(jì)其ACC、SN、SP與MCC的值(表5)。

表5 不同核函數(shù)的預(yù)測性能Table 5 Prediction performance of different kernel functions

從表5可以看出，高斯核函數(shù)的特異性達(dá)到98.94%，說明其能夠很好地分辨出正常樣本；線性核函數(shù)和sigmoid核函數(shù)的特異性達(dá)到99%，說明其對(duì)癌癥樣本的識(shí)別率高。總體來看，高斯核函數(shù)的分類效果最優(yōu)，準(zhǔn)確率達(dá)到97%。表明18個(gè)串話基因?qū)φ颖竞桶┌Y樣本具有很高的區(qū)分能力，可作為肺癌的預(yù)測標(biāo)記物和化療的靶點(diǎn)。

4討論

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快、對(duì)人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。本文從肺癌樣本中得到了805個(gè)呈現(xiàn)相同表達(dá)趨勢的差異表達(dá)基因，其中有214個(gè)上調(diào)基因和591個(gè)下調(diào)基因。最終經(jīng)篩選得到209個(gè)與肺癌相關(guān)的關(guān)鍵基因，其中部分基因已被研究證明與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。比如：KIAA0101是本文特異PPI網(wǎng)絡(luò)中一個(gè)樞紐基因，度為98。研究發(fā)現(xiàn)在肺癌等多種人類惡性腫瘤中都出現(xiàn)了KIAA0101基因過表達(dá)的情況，表明KIAA0101表達(dá)水平會(huì)影響腫瘤的發(fā)展[22-23]。TOP2A(DNA Topoisomerase II Alpha)的W值較大，它的表達(dá)水平在一定程度上反映了腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)，TOP2A在腫瘤組織中過表達(dá)預(yù)示著一些腫瘤患者預(yù)后不良，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[24]。TTK(TTK Protein Kinase)被發(fā)現(xiàn)是癌癥治療的新靶點(diǎn)，可以作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后生物標(biāo)志物[25]。這些研究結(jié)果表明本文得到的還未被證實(shí)與肺癌關(guān)鍵基因有一定的后續(xù)研究價(jià)值。

根據(jù)關(guān)鍵基因所富集的11條細(xì)胞通路的差異得分，可以清楚地分辨出癌癥樣本和正常樣本。11條通路中一共有18個(gè)串話基因，其中卵母細(xì)胞減數(shù)分裂通路(Oocyte meiosis)和細(xì)胞周期通路(Cell cycle)共同含有5個(gè)相同基因：CCNE2、MAD2L1、CDK1、CDC20和PTTG1；HTLV-I感染通路(HTLV-I infection)和細(xì)胞周期通路(Cell cycle)共同含有5個(gè)相同基因：MAD2L1、CDC20、CHEK1、PTTG1和BUB1B。這3條通路與其他通路相關(guān)性都相對(duì)顯著，因此可能參與了肺癌發(fā)生發(fā)展過程，這與文獻(xiàn)[7]中Cell cycle和Oocyte meiosis這兩條通路在肺癌發(fā)展的所有時(shí)期都被激活的結(jié)論是一致的。CCNE2、MAD2L1、CDK1、CDC20、PTTG1和CHEK1這6個(gè)串話基因的W值都較大，其中CCNE2、MAD2L1、CDK1和CDC20已被研究證實(shí)與肺癌相關(guān)。

CCNE2(cyclin E2)在5條通路中出現(xiàn)，它屬于高度保守的細(xì)胞周期家族。CCNE1(Cyclins E1)是CCNE2的重要副產(chǎn)物，兩者統(tǒng)稱為統(tǒng)稱為cyclin E。cyclin E被視為S期標(biāo)志物，在G1/S期決定和限速中起中心調(diào)控作用。Cyclin E過表達(dá)主要由基因擴(kuò)增所引起，基因擴(kuò)增形成大量突變的中心體，從而促進(jìn)腫瘤的惡性增殖。在許多惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌及胃癌等腫瘤中，cyclin E常過度表達(dá)并被認(rèn)為是一種疾病進(jìn)展和預(yù)后的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)miR-30d-5p能夠通過下調(diào)CCNE2的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1/S期阻滯，顯著抑制胞肺癌細(xì)胞增殖和運(yùn)動(dòng)能力[26]。MAD2L1(Mitotic Arrest Deficient 2 Like 1)在4條通路中出現(xiàn)，它是紡錘體組裝檢查點(diǎn)的關(guān)鍵部分。紡錘體組裝檢查點(diǎn)能夠在有絲分裂過程中調(diào)控紡錘體微管附著染色體的著絲粒，MAD2L1表達(dá)與卵巢漿液性腫瘤的化療抵抗相關(guān)；MAD2L1能通過P53直接或間接調(diào)控TOP2A和BIRC5的生物學(xué)功能，與肺癌的化療效果有很大相關(guān)性[27]。CDK1(Cyclin Dependent Kinase 1)也在4條通路中出現(xiàn)，它是周期蛋白依賴性蛋白激酶家族中的一員。CDK1起重要作用的 G2/M 檢驗(yàn)點(diǎn)主要檢測 DNA 的紡錘體中微管組裝及著絲點(diǎn)位置的正確連接，若 CDK1調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生差錯(cuò)，將直接導(dǎo)致細(xì)胞分化障礙、細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生紊亂，誘導(dǎo)細(xì)胞惡性增殖和異常轉(zhuǎn)化，最終形成惡性腫瘤[28]。CDC20(Cell Division Cycle 20)在3條通路中出現(xiàn)，它是一種調(diào)節(jié)蛋白，能調(diào)節(jié)蛋白-蛋白的相互作用。CDC20作為一個(gè)促癌因子, 參與了很多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程；它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡過程，因此CDC20 抑制劑是腫瘤治療的一種新策略[29]。

其他串話基因，如IL6(Interleukin 6)，在4條通路中出現(xiàn)。它是一種多功能細(xì)胞因子，參與多種細(xì)胞的生長、分化和功能調(diào)節(jié)，在免疫和炎癥反應(yīng)中具有重要作用，是機(jī)體重要的免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因子[30]。一項(xiàng)有關(guān)吸煙的正常人與吸煙的肺癌患者的基因?qū)Ρ妊芯恐兄赋鯥L6是一個(gè)重要的差異表達(dá)基因[31]。IL6能夠促進(jìn)肺癌CD133 +細(xì)胞的生長和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[32]。因此IL6可能是與肺癌相關(guān)的關(guān)鍵基因。

以上討論表明本文從失調(diào)的通路間挑選出的18個(gè)串話基因具有一定的可信度，可作為肺癌治療的預(yù)測因子和潛在靶點(diǎn)。