王艷麗 孫婷玉 沈李元 吳小芹 葉建仁 朱麗華

( 南京林業(yè)大學(xué)南方林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

松材線蟲病是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）引起的一種毀滅性森林病害，主要危害松屬植物，對(duì)森林資源和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重的威脅，大量研究表明，松材線蟲病抗性選育已成為防御松材線蟲病危害的重要途徑[1]。日本松材線蟲病抗性育種工作較為先進(jìn)，先后2次對(duì)感病黑松(Pinus thunbergii)和赤松(Pinus densiflora)開展了抗性選育工作，最終篩選出了多個(gè)黑松、赤松抗性家系并建立抗病種子園[2]。江蘇省有害生物預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于2004年從日本引進(jìn)一批抗性種子材料，并建立了抗松材線蟲病黑松、赤松優(yōu)良家系基因資源庫，但種質(zhì)資源有限，遠(yuǎn)不能滿足林業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。因此建立優(yōu)良無性系黑松的快繁體系具有重要意義。另外李清清等[3]已對(duì)抗松材線蟲病赤松組培苗進(jìn)行了抗病性測(cè)定，抗性家系表現(xiàn)出一定的抗病性，朱麗華等也報(bào)道了赤松的微繁殖及其對(duì)線蟲的抗性[4]。

目前，抗性黑松體細(xì)胞胚胎發(fā)生及植株再生體系雖已經(jīng)建立[5]，但抗性黑松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較低，最高僅為7.8%[6]，所以胚性愈傷彌足珍貴，胚性愈傷組織保持十分重要。植物組織培養(yǎng)過程中，繼代培養(yǎng)是其中重要的環(huán)節(jié)，而長(zhǎng)期繼代則是種質(zhì)資源離體保存的必要手段[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞在離體培養(yǎng)時(shí)，再生頻率和再生植株的質(zhì)量與培養(yǎng)時(shí)間密切相關(guān)[8]。隨著繼代次數(shù)的增加很多植物愈傷組織的分化率會(huì)呈下降趨勢(shì)[9]，如梨 S 系矮化砧 (Picea wilsonii）[10]、葉毛棗（Ziziphsu mauritiana）[11]、杉木（Cunninghamia lanceolata）[12]、球根海棠（Begonia tuberhybrida）[13]以及一些落葉松屬的樹種[14-15]。也有研究表明，胚性愈傷組織的體胚發(fā)生能力是可以長(zhǎng)期保持的，如白杄（Picea meyeri）的胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)3 a其增殖能力和分化潛力仍保持在原來的水平，無明顯降低趨勢(shì)[16]；青杄（Picea wilsonii）愈傷組織在適宜的繼代條件下，培養(yǎng)3 a繼代40次體細(xì)胞胚的分化率仍可達(dá)90%以上[17]；此外，棉花（Gossypiumspp.）、玉米（Zea mays）等的胚性愈傷組織體胚發(fā)生能力也是能夠長(zhǎng)期保持的[18-20]。在長(zhǎng)期繼代中愈傷組織是否會(huì)保持一定的體胚發(fā)生和植株再生能力，這關(guān)系到組培快繁技術(shù)的實(shí)用化問題。國內(nèi)外文獻(xiàn)雖見對(duì)黑松組培技術(shù)的相關(guān)研究，但有關(guān)黑松愈傷組織在長(zhǎng)期繼代中分化能力的研究卻很少。因此，通過對(duì)抗性黑松胚性愈傷組織體胚發(fā)生及植株再生能力進(jìn)行了研究，以培養(yǎng)0.5、1.5、3.5 a的胚性愈傷組織為材料，從細(xì)胞形態(tài)、愈傷組織增殖率、每克胚性愈傷形成的體胚數(shù)、以及獲得體胚的正常萌發(fā)率和植株成活率等方面，具體評(píng)估繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織再生分化的影響，以期為抗性黑松體胚發(fā)生快繁體系中篩選出最佳的培養(yǎng)材料，提高組培苗的生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料

黑松未成熟球果采集于抗松材線蟲病黑松優(yōu)良家系基因資源庫（本課題組于2004年從日本良種繁育中心引進(jìn)抗性種子材料建立[21]），當(dāng)年從球果中剝離出未成熟合子胚并誘導(dǎo)出具有胚性的愈傷組織，愈傷組織的誘導(dǎo)方法見文獻(xiàn)[5-6]。誘導(dǎo)的抗性黑松37#家系胚性愈傷組織在DCR+2，4-D 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L和DCR+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L 2種增殖培養(yǎng)基交替培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間分別為0.5 a（繼代12次）、1.5 a（繼代36次）和3.5 a（繼代84次）。愈傷組織采用半固體增殖的培養(yǎng)方式，培養(yǎng)周期為15 d。

1.2 培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基采用DCR基本培養(yǎng)基[22]，添加麥芽糖15 g/L、肌醇1 g/L、谷氨酰胺0.5 g/L、酸水解干酪素0.5 g/L、維生素C 0.5 mg/L、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸0.25 g/L、瓊脂（Agar）5.4 g/L。

成熟培養(yǎng)基采用LP為基本培養(yǎng)基[23]，添加脫落酸（ABA）10 mg/L、赤霉素（GA3）0.5 mg/L、麥芽糖30 g/L、肌醇1 g/L、谷氨酰胺1.5 g/L、聚乙二醇（PEG 8000）130 g/L、活性炭（AC）1.5 g/L、植物凝膠（Phytagel）3.4 g/L。

萌發(fā)培養(yǎng)基采用1/2 LP，添加麥芽糖20 g/L、活性炭（AC）1 g/L、瓊脂（Agar）8 g/L。

誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基采用WPM基本培養(yǎng)基[24]，添加0.15 mg/L NAA、1 mg/L IBA、1 g/L活性炭和瓊脂5.4 g/L。

生長(zhǎng)培養(yǎng)基采用1/4 WPM基本培養(yǎng)基（大量元素減少），添加硝酸銨5 mg/L、硼酸0.15 mg/L、蔗糖17.5 g/L、肌醇0.1 g/L、卡拉膠9 g/L。

所有培養(yǎng)基在滅菌前pH調(diào)至5.8，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

取少量抗性黑松愈傷組織置于載玻片上，滴1滴清水，用鑷子打散，采用醋酸洋紅和伊文思藍(lán)雙染色法染色（先用1%醋酸洋紅染色，后滴加0.05%伊文思藍(lán)），加蓋玻片吸去多余染液，然后將臨時(shí)裝片置于蔡司體式顯微鏡下觀察愈傷組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

增殖率：稱取一定量抗性黑松胚性愈傷組織（M1），在DCR半固體增殖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)15 d，稱取愈傷組織質(zhì)量（M2），愈傷組織增殖率=（M2-M1）/M1×100%。

每克胚性愈傷組織發(fā)育形成成熟體細(xì)胞胚數(shù)量：將一定量的增殖愈傷轉(zhuǎn)入LP成熟培養(yǎng)基，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)形成的體胚數(shù)。以每克愈傷組織形成的成熟胚數(shù)量作為衡量細(xì)胞產(chǎn)胚能力的主要參數(shù)。每克愈傷組織形成成熟胚數(shù)量的測(cè)定：稱取一定量愈傷組織放入成熟培養(yǎng)基，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)每培養(yǎng)皿成熟培養(yǎng)基的體胚數(shù)。每培養(yǎng)皿3團(tuán)胚性愈傷組織，每團(tuán)1 g，3個(gè)重復(fù)。每克胚性愈傷組織形成的成熟體細(xì)胞胚數(shù)量=愈傷組織出胚數(shù)（個(gè)）/愈傷組織質(zhì)量（m）。在此期間，記錄愈傷組織形成成熟體細(xì)胞胚的時(shí)間。

體胚萌發(fā)率、畸形率、死亡率：將成熟培養(yǎng)基所得的成熟體細(xì)胞胚水平放置1/2 LP萌發(fā)培養(yǎng)基上，每皿15個(gè)胚，3個(gè)重復(fù)，非直射光照培養(yǎng)5 d，再轉(zhuǎn)直射光照培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)體胚的萌發(fā)情況。萌發(fā)率（%）=萌發(fā)正常體胚個(gè)數(shù)/接種體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)×100%；畸形率（%）=畸形體胚個(gè)數(shù)/接種體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)×100%；死亡率（%）=死亡體胚個(gè)數(shù)/接種體細(xì)胞胚個(gè)數(shù)×100%。

植株成活率：將正常萌發(fā)的植株轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)1個(gè)月后形成根、莖、葉完整的再生植株。再將植株轉(zhuǎn)入加WPM營養(yǎng)液，V（蛭石）∶V（珍珠巖）為2∶1的基質(zhì)中。2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)植株成活率。每個(gè)處理15棵植株，3個(gè)重復(fù)。植株成活率=成活株數(shù)/接種株數(shù)×100%。

1.3.3 培養(yǎng)條件及數(shù)據(jù)處理

培養(yǎng)溫度設(shè)定為（23±1）℃，光照強(qiáng)度為3000 lx，愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和成熟階段均為暗培養(yǎng)方式，萌發(fā)及生根壯苗階段采用光培養(yǎng)方式（光照16 h，黑暗8 h）。數(shù)據(jù)采用Excel處理，用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織形態(tài)的影響

在繼代培養(yǎng)過程中，肉眼可見細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)逐漸疏松。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)0.5、1.5 a和3.5 a的細(xì)胞團(tuán)均具有胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)（ESM）結(jié)構(gòu)（圖1）。繼代培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織形態(tài)一致性較好，胚柄纖長(zhǎng)，染成紅色的胚頭部分（染色體或染色質(zhì)）在整個(gè)結(jié)構(gòu)中所占面積較大，細(xì)胞核物質(zhì)豐富，細(xì)胞排列緊密（圖1a）。繼代培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)型的胚柄細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯增長(zhǎng)，胚頭部分減少，細(xì)胞排列緊密（圖1b）。培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織細(xì)胞胚頭結(jié)構(gòu)比培養(yǎng)0.5 a和1.5 a的細(xì)胞胚頭結(jié)構(gòu)松散，胚頭結(jié)構(gòu)明顯減少，胚柄細(xì)胞縮短變粗，細(xì)胞結(jié)構(gòu)一致性差，出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)紊亂的現(xiàn)象。另外在培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織中，我們還發(fā)現(xiàn)不少無胚頭結(jié)構(gòu)的空泡細(xì)胞（圖1c）。

2.2 繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織增殖的影響

由圖2可知，繼代培養(yǎng)0.5 a和1.5 a的胚性愈傷組織的增殖率分別為200.37%和182.47%，增值率下降不顯著（P＞0.05）。而繼代3.5 a的胚性愈傷組織雖然仍有一定的增殖能力，但是胚性愈傷組織增殖率（111.63%）較培養(yǎng)0.5 a和1.5 a的胚性愈傷組織顯著下降（P＜0.05）。由此可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，胚性愈傷組織的增殖能力呈下降趨勢(shì)。培養(yǎng)1.5 a以內(nèi)的胚性愈傷組織較適于繼代增殖培養(yǎng)。

2.3 繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)愈傷組織體細(xì)胞胚成熟的影響

2.3.1 愈傷組織體胚分化至各階段的時(shí)間差異

將繼代培養(yǎng)0.5、1.5、3.5 a的愈傷組織在DCR增殖培養(yǎng)基上繼代1個(gè)周期（15 d）后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好的愈傷（圖3a）轉(zhuǎn)至成熟培養(yǎng)基中，于蔡司體式顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，愈傷慢慢開始聚攏，逐漸干燥，愈傷表面抽出的絲狀結(jié)構(gòu)慢慢增粗（圖3b）。一段時(shí)間后，愈傷組織表面出現(xiàn)肉眼可見的柱狀胚伸出，至柱狀胚早期階段（圖3c）。之后，柱狀胚逐漸伸長(zhǎng)、增粗、顏色白或黃，至柱狀胚階段（圖3d）。柱狀胚頂端清晰可見子葉形狀至子葉胚前期階段（圖3e）。子葉胚顏色（顏色白或黃）加深，子葉伸長(zhǎng)，收攏或張開，形狀基本保持不變，形成成熟子葉胚（子葉胚階段）（圖3f）。

圖1 抗性黑松不同培養(yǎng)時(shí)間胚性愈傷組織的形態(tài)觀察Fig. 1 Morphology of embryogenic callus with subculture times of nematode-resistant P. thunbergii

圖2 不同繼代培養(yǎng)時(shí)間愈傷組織的增值率Fig. 2 Proliferation rate of callus vary with subculture time

觀察愈傷組織體胚分化成熟過程發(fā)現(xiàn)，不同繼代培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織分化至體胚各階段的時(shí)間存在差異（表1）。培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織在18 d觀察到肉眼可見的柱狀胚前期階段，而培養(yǎng)1.5 a和3.5 a的胚性愈傷組織分別在21 d 和25 d觀察到該現(xiàn)象。在隨后的發(fā)育過程中，培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織達(dá)到柱狀胚階段、子葉胚前期階段和子葉胚階段分別用了26、32、46 d；而1.5 a的胚性愈傷組織分別用了30、40、63 d；3.5 a的胚性愈傷組織發(fā)育更為緩慢，達(dá)到柱狀胚階段、子葉胚前期階段和子葉胚階段分別用了38、55、74 d，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)體胚成熟所需時(shí)間越長(zhǎng)，體胚發(fā)育能力越弱。因此認(rèn)為，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，胚性愈傷組織細(xì)胞在逐漸老化，以致于不同培養(yǎng)時(shí)間的愈傷組織形成體胚的時(shí)間不一致。

圖3 抗性黑松體細(xì)胞胚成熟觀察Fig. 3 Developmental stages of somatic embryo of nematode-resistant P. thunbergii

2.3.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胚性愈傷組織產(chǎn)胚數(shù)量的影響

每克愈傷形成的體胚數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4。

圖4 每克愈傷形成的體胚數(shù)量Fig. 4 Somatic embryos yiels of per gram callus

由圖4可知，不同培養(yǎng)時(shí)間的胚性愈傷組織體胚分化能力差異顯著，培養(yǎng)0.5 a胚性愈傷組織每克可生產(chǎn)77個(gè)體細(xì)胞胚；而培養(yǎng)1.5 a每克可生產(chǎn)31個(gè)體細(xì)胞胚；培養(yǎng)3.5 a每克可生產(chǎn)5個(gè)體細(xì)胞胚。培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織產(chǎn)胚能力較培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織顯著（P＜0.05）下降；培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織產(chǎn)胚能力較培養(yǎng)0.5 a和1.5 a的胚性愈傷組織均顯著（P＜0.05）下降。因此，認(rèn)為短期（0.5 a）培養(yǎng)的胚性愈傷組織較1.5 a和3.5 a培養(yǎng)時(shí)間的胚性愈傷組織更容易誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，胚性細(xì)胞的分化能力會(huì)降低。

2.4 繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體胚萌發(fā)與再生植株成活的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體胚萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響結(jié)果見圖5，體胚萌發(fā)及植株生長(zhǎng)發(fā)育情況見圖6。培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織的體胚萌發(fā)率為84.5%，再生植株的成活率為73.3%；而培養(yǎng)1.5 a和3.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率分別為51.1%和11.1%，再生植株的成活率分別為50.0%和6.7%。培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率和植株成活率較培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織顯著（P＜0.05）下降；并且培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率和植株成活率較培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織也呈顯著（P＜0.05）下降趨勢(shì)。但是，研究發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，畸形率和死亡率呈上升趨勢(shì)。培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織的畸形率為8.9%，死亡率為6.9%；而培養(yǎng)1.5 a和3.5 a的胚性愈傷組織的畸形率分別為26.7%和37.8%，死亡率分別為22.3%和40.0%。研究顯示體細(xì)胞胚的萌發(fā)和再生植株成活率隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)呈顯著下降，而萌發(fā)的畸形率與死亡率隨培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)則呈顯著上升趨勢(shì)。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體胚萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響Fig. 5 The effects of sub-culture time on germination and growth of regenerated plant

圖6 抗性黑松體胚萌發(fā)及植株的生長(zhǎng)發(fā)育Fig. 6 Somatic embryo germination and plant growth of somatic embryos of nematode-resistant P. thunbergii

3 結(jié)論與討論

目前，許多學(xué)者對(duì)松樹的組織培養(yǎng)進(jìn)行了相關(guān)研究，也取得了一定進(jìn)展。2015—2017年，本實(shí)驗(yàn)室先后報(bào)道了抗性黑松[5-6]、抗性赤松的體胚發(fā)生[21，25]，但至今抗性黑松的體胚發(fā)生仍存在一些問題，如胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率較低，獲得胚性愈傷組織材料極為有限，所以胚性愈傷組織的保持與維持就顯得極為重要。

先前的研究發(fā)現(xiàn)：在胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)（ESM）結(jié)構(gòu)中，胚柄是由胚頭基部的分生組織細(xì)胞分裂、分化而成的，它對(duì)胚頭可提供結(jié)構(gòu)上的支持和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的作用，也是合成生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和儲(chǔ)存一些產(chǎn)物的場(chǎng)所[26]。然而在長(zhǎng)期的繼代培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)愈傷組織的胚頭結(jié)構(gòu)會(huì)減少，胚柄細(xì)胞也出現(xiàn)縮短增粗的現(xiàn)象。胚性愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化很可能會(huì)導(dǎo)致愈傷胚性能力的退化。這與都小龍等對(duì)吉粳88愈傷組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的研究中報(bào)道相似[27]。

胚性愈傷組織是由胚柄和大量胚性細(xì)胞團(tuán)以及原胚組成的，所以本身就具有一定的分裂能力，可以保持一定的增殖能力。但是研究中發(fā)現(xiàn)抗性黑松胚性愈傷組織增殖率隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而降低，這可能與顯微觀察發(fā)現(xiàn)胚頭減少，胚性細(xì)胞與原胚團(tuán)降低有關(guān)。在對(duì)白云杉（Picea glauca）、黑云杉（Picea mariana）[28-29]、青杄[17]及思茅松（Pinus kesiyavar.langbianensis）[30]的研究中，也觀察到了相似的現(xiàn)象。因此認(rèn)為在胚性細(xì)胞的增殖培養(yǎng)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，最好不要超過1.5 a。且在增殖過程中，要及時(shí)將細(xì)胞形態(tài)一致性較好的胚性愈傷組織保存。

在培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體胚產(chǎn)量的研究中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)0.5 a的愈傷組織產(chǎn)胚能力較強(qiáng)，每克可生產(chǎn)77個(gè)體細(xì)胞胚，而培養(yǎng)3.5 a的愈傷僅為5個(gè)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，每克愈傷產(chǎn)胚數(shù)量呈顯著（P＜0.05）下降趨勢(shì)。另外，培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織形成子葉胚的時(shí)間為46 d，培養(yǎng)1.5 a胚性愈傷組織需要63 d，而培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織需要74 d，培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織形成子葉胚的時(shí)間要比培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織縮短28 d，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)體胚成熟過程越慢。這可能與胚性愈傷組織形態(tài)紊亂，胚頭比例下降，胚性逐漸喪失有關(guān)。在對(duì)杉木（Cunninghamia lanceolata）、海棠（Malusspp.）以及毛葉棗（Ziziphsu mauritiana）的研究中也有發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織在長(zhǎng)期繼代過程中會(huì)出現(xiàn)形態(tài)發(fā)生能力喪失的現(xiàn)象[9-15]。研究證實(shí)了在松屬樹種中這個(gè)現(xiàn)象仍然存在。另外，研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體胚萌發(fā)和再生植株的成活也具有非常大的影響。培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率（51.1%）和植株成活率（50.0%）較培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率（84.5%）和植株成活率（73.3%）顯著下降；培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率（11.1%）和植株成活率（6.7%）較培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織也呈顯著下降趨勢(shì)。而隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，萌發(fā)的畸形率和死亡率則由8.9%和6.9%上升到37.8%和40.0%（圖5）。體胚的萌發(fā)和再生植株成活率都隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)顯著下降，而萌發(fā)的畸形率與死亡率與培養(yǎng)時(shí)間則呈顯著上升趨勢(shì)。這與薛美鳳等對(duì)棉花胚性愈傷組織長(zhǎng)期繼代的結(jié)果相一致[8]。

因此，隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，胚性愈傷組織的增殖能力、產(chǎn)胚能力以及體胚萌發(fā)和再生植株成活能力均下降，而萌發(fā)的畸形率和死亡率在逐漸增加。因此，在抗性黑松體胚發(fā)生過程中要及時(shí)對(duì)培養(yǎng)的胚性愈傷組織進(jìn)行更新?lián)Q代，以保持體胚發(fā)生良好的原始材料；在胚性愈傷組織培養(yǎng)過程中要對(duì)胚性細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行及時(shí)的跟蹤觀察，確保細(xì)胞的形態(tài)維持良好；短期培養(yǎng)的胚性愈傷組織（0.5 a）為抗性黑松體胚發(fā)生較為理想的初始材料，且愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間不宜超過1.5 a。