趙今哲 劉國彬 張鴻翎 曹 均 張玉萍 廖 婷 王 燁 郭麗琴

( 1. 內蒙古農業(yè)大學林學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2. 北京市林業(yè)果樹科學研究院，北京 100093)

灑金柏（Platycladus orientalis）為柏科（Cupressaceae）側柏屬（Platycladus）植物，屬于側柏的變種[1]，春夏葉表層淡黃綠色，秋漸變?yōu)榻瘘S色，入冬轉褐黃色，具有較高的觀賞價值。適宜孤植或叢植，可廣泛應用于園林綠地、道路綠化等方面，是園林綠化針葉樹種的優(yōu)異資源，目前針葉樹種主要繁殖方式有種子繁殖、嫁接和扦插。其中種子繁殖后代遺傳變異大，優(yōu)良性狀不易保持；嫁接繁殖愈合周期長，繁殖量??；扦插繁殖生產量大、成本低，是無性系培育的主要方法。20世紀80年代末，全國側柏協作組開始側柏種源調查及扦插繁殖研究，發(fā)現側柏扦插以春季（5—6月）和秋季（11月）為佳，高濃度粉劑生根促進劑速蘸比低濃度溶劑浸泡24 h效果好[2]。魏黔春[3]發(fā)現可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白等營養(yǎng)物質變化與插穗生根所需要的能力呈消長關系；內源激素含量變化與側柏插穗生根關系密切，吲哚乙酸/脫落酸（IAA/ABA）比值越大，吲哚乙酸/玉米素核苷（IAA/ZR）比值越小，越利于插穗生根。作為側柏的變種，灑金柏研究相對落后，關于灑金柏扦插生根過程中插穗內部組織結構變化情況未見研究。本研究在課題組針葉植物扦插繁殖技術體系建立的基礎上，從解剖學角度對灑金柏1年生半木質化插穗不定根發(fā)育過程中的外部形態(tài)和組織結構進行觀察，為揭示灑金柏不定根發(fā)生的細胞學機制提供形態(tài)解剖學依據。

1 材料及方法

1.1 試驗地點

試驗所用灑金柏半木質化插穗來自北京市林業(yè)果樹科學研究院針葉植物資源圃，品種為優(yōu)1031，16年生。扦插試驗和解剖學實驗分別在北京市林業(yè)果樹科學研究院針葉植物繁育智能溫室和林木資源育種實驗室進行，扦插試驗于2017年7月進行。

1.2 插穗采集與處理

取健康的1年生半木質枝條，剪成長約15 cm的插穗，頂部3～4組葉片，現采現插。使用m（IBA）∶m（NAA）=1∶1的溶液處理插穗，低濃度（40、60、80 mg/L）浸泡4 h，高濃度（200、600、1000 mg/L）速沾10 s，扦插于沙床。以清水浸泡為CK，共設7個處理，每處理重復3次，每重復30根插穗。LK-400自動噴霧設施（北京林科林業(yè)技術公司，中國）控制溫濕度。

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣方法

灑金柏扦插生根周期長約90 d。取扦插試驗中生根率最高的80 mg/L （m（IBA）∶m（NAA）=1∶1）溶液浸泡4 h處理的插穗，前20 d每10 d取樣1次，20 d后每5 d取樣1次，直至不定根形成，共取樣23次。每次隨機取5～8株插穗。

1.3.2 形態(tài)觀察

以灑金柏半木質化插穗扦插生根過程中插穗基部外部形態(tài)為觀察對象，記錄愈傷組織與根系的生長發(fā)育狀況，CANNON DS126171（佳能株式會社，日本）相機拍照。

1.3.3 組織結構觀察

以灑金柏半木質化插穗扦插生根過程中插穗內部組織結構為觀察對象。將插穗基部1 cm左右剪下，迅速置于FAA固定液，使用石蠟切片法[4-5]制片。灑金柏木質部較硬將制片方法優(yōu)化（20%鹽酸軟化10～24 h，不使用粘粘劑，38℃烘片9～10 h可節(jié)約制片時間提高切片質量。），使用KD-3358切片機（上海之信儀器有限公司，中國）切片，厚度為8～12 μm，番紅-固綠染色，在Motic SMZ-168顯微鏡（麥克奧迪（廈門）電氣股份有限公司，中國）下觀察、拍照。

2 結果與分析

2.1 不同處理對灑金柏扦插生根的影響

由表1可知，與CK相比，不同處理能極顯著提高灑金柏扦插生根率（P＜0.01），可將生根率提高19.00%～70.27%。其中80 mg/L浸泡4 h處理的插穗生根率為91.38%，極顯著高于其他處理（P＜0.01），1000 mg/L速沾10 s處理次之，生根率為80.00%顯著高于其他處理（P＜0.05）。不同處理對生根量的影響雖不顯著，但均高于CK。各處理的平均根長均大于CK，其中600 mg/L速沾10 s處理的插穗平均根長為6.55 cm，顯著高于其他處理（P＜0.05）。此外還發(fā)現，無論浸泡處理或速沾處理，生根率均隨濃度增加而升高。

表1 不同處理對灑金柏扦插生根的影響Table 1 Effects of different treatments on rooting of P. orientalis

2.2 灑金柏扦插生根過程的外部形態(tài)觀察

從扦插到形成不定根需要約90 d。由圖1a可知，灑金柏1年生半木質化插穗表皮黃褐色，韌皮部呈綠色，厚度占木質部的1/2左右。扦插后20 d后，插穗表皮顏色變深，基部出現乳白色愈傷組織。愈傷組織首先出現在基部邊緣，漸漸向周圍分化，最終將切口全部包住。愈傷組織在形成過程中出現不同的形態(tài)變化，新形成的愈傷組織呈乳白色瘤狀突起，有發(fā)育為不定根的可能；部分愈傷組織出現老化形態(tài)逐漸變?yōu)樽睾稚汕馉睿▓D1b、圖1c）。80 d后，發(fā)現少量乳白色不定根伸出（圖1d）。扦插后120 d部分插穗長出1～3條不定根（圖1e），部分插穗形成完整的根系（圖1f），部分插穗基部有老化愈傷組織未見不定根（圖1g、圖1h）。

圖1 灑金柏扦插生根過程形態(tài)觀察Fig. 1 Morphological features of rooting process of P. orientalis cutting

2.3 灑金柏扦插生根過程中組織結構變化

2.3.1 扦插前插穗的組織結構

由圖2a1可知，灑金柏插穗基部的橫切面由表皮、皮層、維管柱3個部分組成。最外層的表皮細胞為近似圓形，外側的細胞壁上有角質層。表皮以內是皮層，皮層細胞大小、形狀不一，分布較疏松，皮層內有分泌道，沒有連續(xù)的厚壁組織。皮層以內是維管束為木質部的基本結構。橫切面中心為髓，是一團排列疏松的薄壁細胞。木質部可見連接髓與皮層的髓射線。通過大量連續(xù)切片觀察，在插穗內未發(fā)現潛伏根原基。

2.3.2 不定根原基的起源

插穗基部髓射線向韌皮部方向加寬成多列細胞（圖2a2），并在髓射線與形成層交匯處形成一團細胞核較大、排列緊密的薄壁細胞團（圖2a3）。該細胞團向皮層方向不斷分化，發(fā)育形成根原始細胞，其周圍的韌皮細胞也參與了分化（圖2a4），根原始細胞經過不斷分裂分化，最終形成不定根原基（圖2a5）。此時，不定根內部的維管系統也開始形成。不定根原基隨后不斷向前分裂擠破皮層伸出形成不定根，不定根的維管系統與插穗維管形成層相連（圖2a6）。

圖2 灑金柏扦插不定根發(fā)生過程Fig. 2 Adventitious root process of P. orientalis cutting

大多數插穗扦插后，韌皮部的薄壁細胞體積變大（圖2a2），之后插穗切口處開始形成愈傷組織。愈傷組織形成后，呈橫向和徑向分裂，并逐漸包圍插穗基部（圖2b2）。觀察發(fā)現，束中形成層相接的髓射線細胞恢復分裂能力，轉變?yōu)槭g形成層，其中的薄壁細胞不斷分裂，將一部分外圍的維管組織向外推擠，這些薄壁細胞連同皮層的薄壁細胞共同分裂產生了愈傷組織（圖2a3、圖2b1）。愈傷組織內的薄壁細胞不斷分裂，分化形成不同的組織：一部分分化形成了輸導組織（圖2b2）（愈傷組織內的輸導組織部分是插穗基部維管組織的延續(xù)，圖2b3），一部分分化形成了近圓形（鳥巢狀）的結節(jié)逐漸轉化為木質部。在木質部周圍有細胞核明顯且排列緊湊的的根原始細胞（圖2b4），這些細胞群的體積不斷擴大并伸長，逐漸生長成一端較尖的根原基（圖2b5）。根原基繼續(xù)向外增殖、伸長，突破愈傷組織表皮形成不定根，不定根的維管系統形成（圖2b6）。

2.3.3 不定根的發(fā)生過程

根據形態(tài)解剖學觀察，灑金柏扦插不定根的形成經歷了4個連續(xù)時期，分別為愈傷組織形成期、不定根誘導期、不定根表達期和不定根伸長期。扦插后0～20 d為愈傷組織形成期，愈傷組織開始發(fā)育并逐漸將插穗基部包?。▓D1a）；扦插后21～40 d為誘導期，插穗切口處的髓射線與形成層相交處以及愈傷組織內的輸導組織附近的薄壁細胞分化成根原始細胞（圖2a4、圖2b4）；扦插后41～70 d為表達期，該階段根原始細胞開始分化形成根原基，根原基不斷伸長并發(fā)育出根的基本結構（圖2a5、圖2b5）；扦插后71～90 d為伸長期，不定根突破皮層或愈傷組織表層，形成肉眼可見的不定根（圖2a6、圖2b6）。扦插后120 d插穗根系基本完成（圖1d）。

3 結論與討論

大量研究表明，選擇最優(yōu)的外源激素種類、濃度、處理時間等因素組合可以有效的提高植物扦插的生根率、生根條數等[6-7]。IBA、NAA處理可提高插穗內多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）活性，促進插穗內部營養(yǎng)物質的重新分配和內源激素的表達從而促進插穗生根，IBA促進效果略優(yōu)于NAA[8-10]。本研究中經80 mg/L的m（IBA）∶m（NAA）=1∶1處理的插穗生根率最佳為91.38%，比CK提高了3倍。此外，適宜的育苗基質可提高插穗的生根率及移栽成活率[11]，灑金柏扦插育苗外源激素種類、濃度、處理時間、育苗基質等最優(yōu)組合有待進一步系統研究。

一般將植物不定根發(fā)育的過程劃分為3個時期，即誘導期、啟動期和表達期[12-13]，根據不定根原基形成時間分為潛伏根原基和誘生根原基[14-15]。本研究根據灑金柏插穗外部形態(tài)及其內部組織結構變化，將灑金柏扦插不定根發(fā)生發(fā)育過程劃分為4個連續(xù)時期，即愈傷形成期（持續(xù)20 d左右）、不定根誘導期（持續(xù)20 d左右）、不定根表達期（持續(xù)30 d左右）、不定根伸長期（持續(xù)20 d左右），因在扦插前灑金柏插穗內未觀察到潛伏根源基，所以灑金柏扦插不定根原基屬于誘生根原基。

根據插穗不定根的發(fā)生部位可將插穗的生根類型分為皮部生根型、愈傷生根型和混合生根型。其中皮部生根型的根原始細胞通常產生于髓射線、形成層以及兩者相交處，愈傷生根型的根原始細胞產生于愈傷組織內，混合型生根型則具備以上2種類型的特點[16]。本研究發(fā)現，灑金柏插穗不定根原基起源于髓射線與形成層交叉處、愈傷組織2個位點，由愈傷組織伸出形成不定根，僅個別插穗不定根由皮層伸出。因此，灑金柏生根類型為典型的愈傷生根類型。

植物體受到損傷后，內源生長素的合成和移動受到影響，同時激活多個發(fā)育調節(jié)因子，進而形成愈傷組織[17]。愈傷組織在一定程度上可防止水分散失和細菌入侵，張鋼民等[18]研究認為愈傷組織是不定根形成的前提，但白樺（Betula platyphylla）不定根原基先于愈傷組織形成且愈傷組織內未見根原基形成，愈傷組織抑制其不定根形成[19]。在灑金柏扦插生根的過程中，愈傷組織的形成是不定根生長發(fā)育的物質基礎，多數不定根由愈傷組織形成并伸出體外，但研究同時發(fā)現，過度發(fā)達的愈傷組織消耗了插穗內大量的營養(yǎng)物質并不斷分化增殖，形成了惡性循環(huán)，在愈傷組織外層形成褐色硬化表層，進而抑制不定根的發(fā)生。植物不定根再生需要經過2次“細胞命運轉變”即：形成層細胞轉變?yōu)橛鷤M織細胞再轉變?yōu)楦毎鸞20]，這與灑金柏不定根的發(fā)育模式相似。

植物自身的生根能力和遺傳性狀在很大程度上決定了扦插的成活率，插穗生根能力與其木質化程度成反比，插穗橫切面結構對不定根發(fā)育有一定影響[21-22]，在桉樹（Eucalyptus robusta）、紅愷木（Alnus rubra）等不定根研究中，認為皮層內環(huán)狀厚壁組織對不定根發(fā)育有抑制作用[23-24]，王戈戎等[25]通過對喜樹（Camptotheca acuminata）研究認為，插穗橫切面內不連續(xù)的厚壁組織對不定根發(fā)育沒有影響。本研究通過連續(xù)切片觀察在灑金柏插穗橫切面未發(fā)現厚壁細胞及環(huán)狀厚壁組織，說明沒有阻礙其不定根發(fā)育的組織結構。通過對比發(fā)現，灑金柏不定根發(fā)育的關鍵因素為激素等生理生化因素。此外，紅榿木[24]、雜種鵝掌楸（Liriodehdroh chinense）[26]、合歡（Albizia julibrissin）[27]等樹種扦插過程中，部分不定根從插穗皮孔中伸出，此現象未在灑金柏不定根發(fā)育過程中出現，與其生根類型有關。

通過對灑金柏扦插不定根形成過程中插穗形態(tài)及解剖學觀察，初步將灑金柏扦插不定根形成劃分為：愈傷形成期、誘導期、表達期、伸長期。不定根形成是一個復雜的動態(tài)過程，組織結構的變化只是其中的一部分，今后結合其生根過程的激素調控、基因表達等方面研究，可將其生根機理研究更系統深入，建立完整的不定根形成機制，為灑金柏及其他難生根樹種提高生根效果作參考。