邵海玲，徐長(zhǎng)山，張海嬌，喬金，鄭博文，何慧敏

東北師范大學(xué)紫外光發(fā)射材料與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130024

離子選擇性微電極是一種電化學(xué)傳感器，其工作原理是利用能斯特(Nernst)方程將測(cè)得的電位值與離子活度進(jìn)行轉(zhuǎn)換，從而得到細(xì)胞內(nèi)外的離子活度(濃度)值[1]。同時(shí)，也可以通過測(cè)量胞外空間離子的濃度梯度，間接得到離子流信息[2-5]。離子選擇性微電極具有非損傷性、測(cè)量迅速、靈敏度高、測(cè)量范圍廣并且可以進(jìn)行連續(xù)動(dòng)態(tài)測(cè)量等優(yōu)點(diǎn)[6-7]，目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)和環(huán)境科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域[8-10]。

離子選擇性微電極技術(shù)的應(yīng)用中也存在一定的局限性。一方面，在測(cè)量細(xì)胞外離子濃度梯度時(shí)，由于胞外離子濃度差別微小，與之對(duì)應(yīng)電位信號(hào)的差別通常小于1 μV[12]，因此，在測(cè)量的過程中，必須進(jìn)行嚴(yán)格的電磁屏蔽。另一方面，在測(cè)量胞外空間離子濃度梯度時(shí)，需要精確控制電極尖端反復(fù)移動(dòng)的距離。操作起來難度較大，對(duì)電極微操作系統(tǒng)要求較高。如果要測(cè)量細(xì)胞內(nèi)特定位置的離子濃度，則要將電極扎進(jìn)細(xì)胞內(nèi)并在細(xì)胞內(nèi)精確定位。因?yàn)榧?xì)胞膜具有一定的彈性，所以操作具有很大的難度。尤其對(duì)于體積較小的細(xì)胞來說，電極很難扎進(jìn)細(xì)胞內(nèi)。因此，尚未見到利用離子選擇性微電極測(cè)量細(xì)胞內(nèi)離子濃度分布的研究報(bào)道。

筆者在用鈣離子選擇性微電極研究納米粒子對(duì)蘆薈原生質(zhì)體的毒性時(shí)，偶然發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體破裂時(shí)，由于胞內(nèi)離子的突然釋放，會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的離子濃度脈沖信號(hào)。通過將蘆薈原生質(zhì)體置于低滲液中，有意使其吸水脹破，確認(rèn)了這一脈沖信號(hào)的存在。以往的研究者應(yīng)當(dāng)也觀察到過這種脈沖信號(hào)，不過可能只是把它當(dāng)成實(shí)驗(yàn)中的偶發(fā)現(xiàn)象忽略了，沒有給予足夠的重視。通過分析發(fā)現(xiàn)，該信號(hào)可以定性地反映細(xì)胞液內(nèi)離子的分布情況(定量的反演分析尚在進(jìn)行中)。在此基礎(chǔ)上，筆者又對(duì)低溫、CuO NPs、鋱、鎘和乙醇脅迫下，蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)形成的Ca2+濃度脈沖信號(hào)進(jìn)行了檢測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)了一些新現(xiàn)象，初步揭示了低溫脅迫、CuO NPs、鋱、鎘和乙醇處理對(duì)細(xì)胞液內(nèi)Ca2+分布的不同影響。

相對(duì)于以往的離子選擇性微電極應(yīng)用模式而言，本文的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：其一是抗干擾能力強(qiáng)。原生質(zhì)體破裂時(shí)，其外部Ca2+濃度變化可以達(dá)到2個(gè)數(shù)量級(jí)，脈沖信號(hào)明顯，受外界干擾影響小。其二是操作簡(jiǎn)單、不需要精確控制電極的移動(dòng)。因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)過程中，只需要將微電極的尖端靠近原生質(zhì)體，而不需要在微米量級(jí)上往復(fù)移動(dòng)電極，也不用擔(dān)心在操作微電極控制器時(shí)產(chǎn)生的回程差問題，操作較簡(jiǎn)單。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 蘆薈原生質(zhì)體

本文研究對(duì)象是蘆薈(Aloevera)細(xì)胞的原生質(zhì)體，它不但保留了完整細(xì)胞的一切活性特征，而且可以方便地通過低滲液使其脹破產(chǎn)生離子濃度脈沖信號(hào)。

原生質(zhì)體用酶解法從蘆薈的葉肉中提取，過程如下：將0.400 g纖維素酶(>15 000 U·g-1，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、0.280 g果膠酶(1.18 U·g-1, Sigma Aldrich)、2.186 g甘露醇(≥80.5%，中國(guó)惠世生化試劑有限公司)、0.040 g磷酸二氫鉀(KH2PO4) (≥99.5%，北京化工廠)、0.222 g二水合氯化鈣(CaCl2·2H2O)(≥98%，西隴化工有限公司)加入20 mL去離子水混合，放入磁力攪拌器(CL-2，鞏義市予華儀器有限公司)攪拌20 min，再將混合液放入低速離心機(jī)(DT5-6，北京現(xiàn)代北利離心機(jī)有限公司)，2 000 r·min-1離心8 min，取上清液即為酶解液，備用；選取健康蘆薈葉片肥厚部分，用酒精和去離子水反復(fù)沖洗消毒去除表皮和膠質(zhì)部分并再次用去離子水清洗。將3 g剝好的葉片放入盛有20 mL酶解液的燒杯中，用保鮮膜封口后，用黑色塑料袋包裹，放入溫度20 ℃、轉(zhuǎn)速60 r·min-1的恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWYR-240，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)中震蕩酶解約4～5 h后取出燒杯，用200目細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，得到蘆薈原生質(zhì)體。

將制備好的原生質(zhì)體移入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基的配比為2.186 g甘露醇、0.040 g KH2PO4、0.222 g CaCl2·2H2O和20 mL去離子水。

為了降低培養(yǎng)基中Ca2+對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，在進(jìn)行Ca2+濃度脈沖檢測(cè)之前，將蘆薈原生質(zhì)體用無鈣培養(yǎng)基(在原培養(yǎng)基配方中去掉CaCl2·2H2O)清洗3～5遍。

1.2 納米氧化銅懸浮液的配制

用分析天平(XS205DU，瑞士)稱取5.000 mg的CuO NPs(粒徑為40 nm，Macklin，上海)加入100 mL的去離子水中，水浴超聲(KQ-250DB，350 W,昆山市超聲儀器有限公司)30 min得到100 mL濃度為50 mg·L-1的納米氧化銅懸浮液。

1.3 硝酸鋱溶液的配制

稱取12.000 mg的硝酸鋱(Tb(NO3)3)(99.9%, Strem Chemicals)加入500 mL的去離子水中，配制成濃度為24 μg·mL-1的硝酸鋱溶液。

1.4 氯化鎘溶液的配制

將500 mL的去離子水加入到盛有5.000 mg的氯化鎘(CdCl2)(99%，山東西亞化學(xué)股份有限公司)的燒杯中，配制成10 mg·L-1的氯化鎘溶液。

1.5 鈣離子選擇性微電極

1.5.1 鈣離子選擇性微電極制備

鈣離子選擇性微電極由玻璃電極、Ag/AgCl絲、電解液(10-1mol·L-1的CaCl2溶液)和離子交換劑(LIX)組成[16]。其制備過程包括玻璃管(B150-110-10，外徑1.5 mm，內(nèi)徑1.10 mm，長(zhǎng)度10 cm，Sutter Instrument)拉制、硅烷化、LIX吸入和電解液灌充等幾個(gè)步驟。詳細(xì)制備過程可見參考文獻(xiàn)[17-18]，此處不再贅述。

1.5.2 離子選擇性微電極性能檢測(cè)

分別配制10-7、10-6、10-5、10-4、10-3、10-2和10-1mol·L-1的CaCl2標(biāo)定液。用制備好的鈣離子選擇性微電極依次對(duì)不同濃度的標(biāo)定液進(jìn)行測(cè)量(甘汞電極做參比電極)，并記錄標(biāo)定液濃度及其對(duì)應(yīng)的電位值。繪制電極的工作曲線，確定電極的能斯特斜率和檢測(cè)下限。此外還對(duì)電極的響應(yīng)時(shí)間以及穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測(cè)。

圖1表明電極的R值為0.99965，Nernst斜率是26.9，由此可計(jì)算出電極的轉(zhuǎn)換效率為93.7%>90%；電極的檢測(cè)下限優(yōu)于10-5mol·L-1；在24 h內(nèi)的電位值基本保持穩(wěn)定；電極響應(yīng)時(shí)間均小于1 s。

1.6 低溫處理蘆薈原生質(zhì)體

將清洗過的原生質(zhì)體分為4份，其中一份放在室溫下正常培養(yǎng)作為對(duì)照組。另外3份原生質(zhì)體放入培養(yǎng)管中，放入冰箱內(nèi)分別冷凍15、30和90 min后取出。其中冷凍15 min的原生質(zhì)體懸浮液處于冰水混合狀態(tài)，懸浮液的溫度為0 ℃。冷凍30和90 min的蘆薈原生質(zhì)體懸浮液此時(shí)已經(jīng)是完全結(jié)冰狀態(tài)，懸浮液溫度分別為-1 ℃和-6 ℃。將取出的裝有冷凍原生質(zhì)體的培養(yǎng)管置于室溫下解凍作為實(shí)驗(yàn)組。

1.7 CuO NPs處理蘆薈原生質(zhì)體

從對(duì)照組吸取0.1 mL的蘆薈原生質(zhì)體加入裝有10 mL濃度為50 mg·L-1的CuO NPs懸浮液的培養(yǎng)管中，輕輕搖勻。靜置10、30和60 min后測(cè)量。

1.8 硝酸鋱?zhí)幚硖J薈原生質(zhì)體

采取相同的方法，將0.1 mL對(duì)照組的蘆薈原生質(zhì)體加入裝有10 mL濃度為24 μg·mL-1的硝酸鋱溶液的培養(yǎng)管中，輕輕搖勻。靜置10、30和60 min后測(cè)量。

1.9 氯化鎘處理蘆薈原生質(zhì)體

同樣，從對(duì)照組吸取0.1 mL的蘆薈原生質(zhì)體加入裝有10 mL濃度為10 mg·L-1的CdCl2溶液的培養(yǎng)管中，輕輕搖勻。靜置10、30和60 min后測(cè)量。

1.10 乙醇處理蘆薈原生質(zhì)體

將3 mL的蘆薈原生質(zhì)體加入到裝有5 mL 95%乙醇溶液的培養(yǎng)管中，搖勻后靜置40 min待測(cè)。

1.11 蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+脈沖信號(hào)的測(cè)量

鈣離子選擇性微電極和甘汞電極(232型，上海羅素科技有限公司)均固定在三維操縱儀(PTW-4，成都儀器廠)上。微電極尖端的位置可通過倒置顯微鏡(CPX 41, Olympus)觀察。離子選擇性微電極的輸出信號(hào)經(jīng)高阻微電極放大器(SWF-1D,成都儀器廠)放大后，由多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)(RM6240B,成都儀器廠)采集，最后由電腦記錄并顯示。

圖1 鈣離子選擇性微電極性能檢測(cè)注：(a)能斯特斜率檢測(cè)結(jié)果圖，(b)電極檢測(cè)下限，(c)24 h內(nèi)電極電位的變化，(d)電極響應(yīng)時(shí)間曲線圖。Fig. 1 Detection of the performance of the calcium ion selective microelectrodeNote: (a) The test result of the Nernst slope, (b) Lower limit of detection, (c) Changes of electrode potential within 24 h, (d) Response time of the electrode.

將一只10 mL空白培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡的操作臺(tái)上，調(diào)節(jié)三維操縱儀的同時(shí)在倒置顯微鏡下觀察，使離子選擇性微電極的尖端盡可能接近培養(yǎng)皿底部。甘汞電極尖端置于距離微電極尖端約1.5 cm處。

吸取50 μL待測(cè)原生質(zhì)體懸液滴入裝有10 mL低滲液(濃度為55 mg·L-1的甘露醇溶液)的培養(yǎng)管中，輕輕搖勻后倒入顯微鏡操作臺(tái)上的培養(yǎng)皿中。調(diào)節(jié)顯微鏡操作臺(tái)，使視野中僅出現(xiàn)一個(gè)清晰、外形圓潤(rùn)飽滿的蘆薈原生質(zhì)體。此時(shí)再次微調(diào)三維微操縱儀，使微電極的尖端靠近原生質(zhì)體，直至電極尖端與細(xì)胞膜的距離約為5 μm時(shí)停止(各次測(cè)量均在這一距離上進(jìn)行，以保證測(cè)量條件的一致性)。關(guān)閉屏蔽網(wǎng)拉門，系統(tǒng)開始連續(xù)記錄電極尖端處的Ca2+濃度。

為了降低外界環(huán)境震動(dòng)和電磁干擾對(duì)測(cè)量的影響，需將倒置顯微鏡、三維微操縱儀以及微電極放大器的前級(jí)置于防震臺(tái)上的屏蔽網(wǎng)中。

2 結(jié)果(Results)

2.1 對(duì)照組的Ca2+濃度脈沖信號(hào)

圖2是對(duì)照組蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)所產(chǎn)生的Ca2+濃度脈沖信號(hào)(以電極電位表示，下同)。從圖中可以看出，原生質(zhì)體未破裂前，其附近的Ca2+濃度一直穩(wěn)定在背景濃度上，沒有什么變化。但在原生質(zhì)體破裂時(shí)，其周圍的Ca2+濃度在很短的時(shí)間內(nèi)(不到10 s)急劇上升，達(dá)到一個(gè)峰值后，又緩慢下降至背景濃度，形成一個(gè)脈沖信號(hào)。

2.2 低溫冷凍對(duì)Ca2+濃度脈沖信號(hào)的影響

吸取前述經(jīng)冷凍處理15 min并解凍至室溫的蘆薈原生質(zhì)體懸液50 μL，滴入低滲液中進(jìn)行測(cè)量。圖3是其破裂時(shí)Ca2+釋放所產(chǎn)生的脈沖信號(hào)。從圖中可以看出，此時(shí)的Ca2+濃度雖然也有快速上升，但是上升到峰值所用的時(shí)間大約為17 s，明顯長(zhǎng)于對(duì)照組。

圖2 對(duì)照組蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+濃度脈沖Fig. 2 Ca2+ pulse signal of a breaking control-group Aloe vera protoplast

圖3 冷凍處理15 min的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+的脈沖信號(hào)Fig. 3 Ca2+ pulse signals of a breaking Aloe vera protoplast cooled for 15 min

當(dāng)溫度降至0 ℃以下時(shí)，低溫處理對(duì)Ca2+脈沖信號(hào)的影響開始變得非常顯著。圖4、圖5是將蘆薈原生質(zhì)體冷凍30 min和90 min至完全結(jié)冰狀態(tài)后取出,在室溫下解凍并繼續(xù)保存5 min、45 min、23 h和25 h后，所測(cè)得的Ca2+濃度脈沖信號(hào)。從圖4(a)和圖5(a)可以看出，與在對(duì)照組中觀察到的單純的脈沖信號(hào)不同，冷凍30 min和90 min后的蘆薈原生質(zhì)體，其Ca2+濃度脈沖信號(hào)的前沿處出現(xiàn)了一個(gè)明顯的凹陷。這表明，原生質(zhì)體周圍的Ca2+濃度先急劇下降，然后才在較短時(shí)間內(nèi)上升到峰值，最后又緩慢下降趨于背景濃度。經(jīng)30 min和90 min冷凍的樣品，在解凍后23 h(圖4(c))和25 h(圖5(d))后，脈沖前沿處的凹陷消失。

圖4 冷凍30 min，解凍不同時(shí)間的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+的脈沖信號(hào)注：(a)～(d)中解凍時(shí)間分別為5 min、45 min、23 h和25 h。Fig. 4 Ca2+ pulse signals of a breaking Aloe vera protoplast of different thawing time after 30 min freezingNote: (a)～(d), thawing time is 5 min, 45 min, 23 h and 25 h.

2.3 CuO NPs處理對(duì)Ca2+濃度脈沖信號(hào)的影響

圖6是將0.1 mL的蘆薈原生質(zhì)體加入10 mL濃度為50 mg·L-1的CuO NPs懸浮液中分別處理10、30和60 min后測(cè)得的原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+濃度脈沖信號(hào)的波形圖。與對(duì)照組圖2比較可以看出，經(jīng)過CuO NPs處理后，原生質(zhì)體破裂過程中，在脈沖前沿處都出現(xiàn)了Ca2+濃度下降的現(xiàn)象，并且在60 min內(nèi)，隨著處理時(shí)間的增加，該下降現(xiàn)象就越明顯。

2.4 硝酸鋱?zhí)幚韺?duì)Ca2+濃度脈沖信號(hào)的影響

為探究重稀土元素鋱對(duì)原生質(zhì)體破裂時(shí)的Ca2+濃度脈沖信號(hào)是否有影響，將0.1 mL的蘆薈原生質(zhì)體加入10 mL濃度為24 μg·mL-1的硝酸鋱溶液中，圖7是分別處理10、30和60 min后測(cè)量得到的Ca2+濃度脈沖信號(hào)。可以看出，經(jīng)硝酸鋱?zhí)幚淼奶J薈原生質(zhì)體在破裂時(shí)，其Ca2+脈沖信號(hào)的前沿處均出現(xiàn)了凹陷現(xiàn)象，并且當(dāng)處理時(shí)間為30 min時(shí)，凹陷程度最大。

圖5 冷凍90 min，解凍不同時(shí)間的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+的脈沖信號(hào)注：(a)～(d)中解凍時(shí)間分別為5 min、45 min、23 h和25 h。Fig. 5 Ca2+ pulse signals of a breaking Aloe vera protoplast of different thawing time after 30 min freezingNote: (a)～(d), thawing time is 5 min, 45 min, 23 h and 25 h.

2.5 氯化鎘處理對(duì)Ca2+濃度脈沖信號(hào)的影響

筆者還利用該方法研究了重金屬元素鎘對(duì)細(xì)胞液中Ca2+濃度分布的影響。圖8是蘆薈原生質(zhì)體用10 mg·L-1的CdCl2溶液分別處理10、30和60 min后測(cè)量得到的Ca2+濃度脈沖信號(hào)?？梢钥闯觯朔N情況下，Ca2+脈沖信號(hào)的前沿處同樣都出現(xiàn)了小幅度的凹陷現(xiàn)象。

2.6 乙醇處理對(duì)Ca2+濃度脈沖信號(hào)的影響

用測(cè)量Ca2+濃度脈沖的方法研究了乙醇處理對(duì)蘆薈原生質(zhì)體的影響。將3 mL的蘆薈原生質(zhì)體加入到5 mL 95%乙醇溶液中處理40 min后測(cè)量Ca2+濃度脈沖信號(hào)，結(jié)果如圖9所示?？梢钥闯觯?jīng)乙醇處理的蘆薈原生質(zhì)體在破裂時(shí)，其Ca2+濃度脈沖信號(hào)的前沿處沒有發(fā)生凹陷現(xiàn)象。

3 討論(Discussion)

從圖2可以看到，未經(jīng)任何處理的對(duì)照組原生質(zhì)體在破裂時(shí)產(chǎn)生的Ca2+濃度信號(hào)，是一個(gè)先急劇上升后緩慢下降的脈沖型信號(hào)。這與原生質(zhì)體破裂時(shí)突然釋放出其細(xì)胞液中的Ca2+，并且釋放的Ca2+隨時(shí)間的推移逐漸向周圍擴(kuò)散的過程相一致。同時(shí)可看到，這是一個(gè)單純的脈沖信號(hào)，沒有疊加其他的細(xì)節(jié)。這表明，正常蘆薈原生質(zhì)體內(nèi)細(xì)胞液中的Ca2+濃度分布較為均勻，沒有大的起伏。

當(dāng)將原生質(zhì)體冷凍至不同溫度時(shí)，其Ca2+濃度脈沖信號(hào)的波形會(huì)發(fā)生不同程度的變化。當(dāng)冷凍至0 ℃時(shí)，基本波形未變，只是Ca2+濃度脈沖信號(hào)的前沿變緩，如圖3所示。這表明，細(xì)胞液中Ca2+的分布仍然均勻，但Ca2+的流動(dòng)性略有降低。

圖6 CuO NPs處理不同時(shí)間后的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+的脈沖信號(hào)注：(a)～(c)中處理時(shí)間分別為10、30和60 min。Fig. 6 Ca2+ pulse signal of a breaking Aloe vera protoplast after treatment with CuO NPs at different timesNote: (a)～(c), the treatment time is 10, 30 and 60 min.

圖7 硝酸鋱?zhí)幚聿煌瑫r(shí)間后的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+的脈沖信號(hào)注：(a)～(c)中處理時(shí)間分別為10、30和60 min。Fig. 7 Ca2+ pulse signal of a breaking Aloe vera protoplast after treatment with Tb(NO3)3 at different timesNote: (a)～(c), the treatment time is 10, 30 and 60 min.

圖8 氯化鎘處理不同時(shí)間后的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+的脈沖信號(hào)注：(a)～(c)中處理時(shí)間分別為10、30和60 min。Fig. 8 Ca2+ pulse signal of a breaking Aloe vera protoplast after treatment with CdCl2 at different timesNote: (a)～(c), the treatment time is 10, 30 and 60 min.

圖9 乙醇處理后的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+的脈沖信號(hào)Fig. 9 Ca2+ pulse signal of a breaking Aloe vera protoplasts after ethanol treatment

當(dāng)冷凍至-1 ℃和-6 ℃時(shí)，Ca2+濃度脈沖的波形發(fā)生了很大的變化，其前沿處出現(xiàn)了一個(gè)明顯的凹陷(圖4和圖5)。

在整個(gè)測(cè)量過程中，原生質(zhì)體是處在低滲液中的，水會(huì)通過細(xì)胞膜滲透進(jìn)原生質(zhì)體中。如果原生質(zhì)體內(nèi)的Ca2+不能很快擴(kuò)散進(jìn)這些新滲入的水中，則在原生質(zhì)體中靠近細(xì)胞膜處便會(huì)形成一個(gè)Ca2+的低濃度區(qū)。當(dāng)原生質(zhì)體破裂時(shí)，就會(huì)在脈沖的前沿處出現(xiàn)一個(gè)與低濃度區(qū)相對(duì)應(yīng)的凹陷。

在對(duì)照組中未觀察到這種凹陷。這說明，對(duì)于正常的蘆薈細(xì)胞原生質(zhì)體，細(xì)胞液中的Ca2+具有很好的流動(dòng)性，能夠很快地?cái)U(kuò)散到新滲入原生質(zhì)體內(nèi)的水中，使細(xì)胞液中Ca2+的濃度分布保持均勻，或者說正常的原生質(zhì)體對(duì)其細(xì)胞液中的Ca2+具有很好的調(diào)控能力。

當(dāng)原生質(zhì)體的溫度降至0 ℃時(shí)，雖然脈沖前沿變緩，但Ca2+在細(xì)胞液中的分布仍然是均勻的。這說明，此時(shí)細(xì)胞液中的Ca2+仍然具有比較好的流動(dòng)性，或者說原生質(zhì)體對(duì)于Ca2+分布的調(diào)控能力并沒有受到明顯的影響。只是當(dāng)原生質(zhì)體破裂時(shí)，Ca2+在低滲液中的擴(kuò)散速度變慢了。

當(dāng)溫度降到-1 ℃和-6 ℃時(shí)，如圖4(a)和圖5(a)所示，Ca2+濃度脈沖的前沿處才出現(xiàn)了明顯的凹陷。這說明，此時(shí)原生質(zhì)體對(duì)細(xì)胞液中Ca2+的分布失去了調(diào)控能力，Ca2+的流動(dòng)性明顯變差，已經(jīng)無法快速擴(kuò)散進(jìn)新滲入的水中，也無法使Ca2+的濃度保持均勻。此時(shí)細(xì)胞液中的Ca2+濃度分布出現(xiàn)了分層現(xiàn)象?？拷|(zhì)體中心的Ca2+濃度較高，而向外靠近細(xì)胞膜附近的Ca2+濃度較低。

在研究低溫對(duì)植物的影響時(shí)，人們比較關(guān)注植物形態(tài)和生理指標(biāo)的變化[19]。在有關(guān)細(xì)胞冷凍保存和復(fù)蘇的研究中，注意力往往集中在低溫導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的水結(jié)冰時(shí)，冰晶對(duì)細(xì)胞造成的機(jī)械損傷，而較少注意到冷凍對(duì)細(xì)胞液內(nèi)Ca2+濃度分布的影響。本文的結(jié)果則表明，冷凍會(huì)對(duì)細(xì)胞調(diào)控細(xì)胞液中Ca2+濃度分布的能力造成損害，使得細(xì)胞液內(nèi)Ca2+的流動(dòng)性變差，進(jìn)而造成細(xì)胞液內(nèi)的Ca2+濃度分布出現(xiàn)分層。這一點(diǎn)是今后研究細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇時(shí)應(yīng)當(dāng)注意的。

為了研究冷凍造成的細(xì)胞液中Ca2+濃度分布的分層現(xiàn)象是否能夠恢復(fù)，對(duì)解凍后保存不同時(shí)間的蘆薈原生質(zhì)體進(jìn)行了測(cè)量。從圖4和圖5可以看出，在經(jīng)過較長(zhǎng)時(shí)間的室溫保存后，原生質(zhì)體中的Ca2+濃度分布可以得到恢復(fù)。并且冷凍處理的時(shí)間越長(zhǎng)，溫度越低，恢復(fù)所需的時(shí)間也越長(zhǎng)。冷凍90 min的原生質(zhì)體，Ca2+濃度分層現(xiàn)象得到恢復(fù)所需要的時(shí)間比冷凍30 min的原生質(zhì)體要長(zhǎng)約2 h。

筆者還嘗試用測(cè)量Ca2+濃度脈沖的方法研究了CuO NPs對(duì)蘆薈原生質(zhì)體中Ca2+濃度分布的影響。用CuO NPs分別處理蘆薈原生質(zhì)體10、30和60 min，結(jié)果表明，Ca2+濃度脈沖信號(hào)的前沿處均發(fā)生了凹陷現(xiàn)象，并且隨著處理時(shí)間的增加，該凹陷程度變大(圖6)。這說明CuO NPs也會(huì)在一定程度上損害原生質(zhì)體對(duì)內(nèi)部Ca2+濃度分布的調(diào)控能力，降低原生質(zhì)體內(nèi)Ca2+的流動(dòng)性，進(jìn)而引起細(xì)胞液中原生質(zhì)體內(nèi)Ca2+的濃度分布產(chǎn)生分層現(xiàn)象。并且在60 min內(nèi)，隨著處理時(shí)間的增加，分層現(xiàn)象越明顯。

有研究表明，CuO NPs會(huì)破壞細(xì)胞膜的通透性[20]，影響酶的活性等[21]。筆者在研究中也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CuO NPs處理后的蘆薈原生質(zhì)體變得比較脆弱，容易發(fā)生破裂。所以本文只對(duì)經(jīng)CuO NPs處理60 min后的原生質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè)。

鋱作為重稀土元素，有關(guān)其毒理效應(yīng)的報(bào)道較少，筆者用同樣的方法測(cè)量經(jīng)硝酸鋱?zhí)幚磉^的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+濃度脈沖信號(hào)，發(fā)現(xiàn)其脈沖前沿處同樣出現(xiàn)了凹陷(圖7)，并且當(dāng)處理時(shí)間為30 min時(shí)，此凹陷程度尤為明顯。這表明，硝酸鋱也會(huì)對(duì)細(xì)胞液調(diào)控其內(nèi)部Ca2+濃度分布的能力造成損傷。繼續(xù)測(cè)量發(fā)現(xiàn)經(jīng)硝酸鋱?zhí)幚淼臅r(shí)間大于60 min后，蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+濃度脈沖信號(hào)與處理60 min時(shí)的波形幾乎一致。

重金屬鎘會(huì)破壞鈣穩(wěn)態(tài)，并引發(fā)細(xì)胞損傷或死亡[22]。而研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氯化鎘處理的蘆薈原生質(zhì)體破裂時(shí)Ca2+濃度脈沖信號(hào)的前沿處也出現(xiàn)了小幅度的凹陷現(xiàn)象(圖8)，并且此波形凹陷程度與處理時(shí)間長(zhǎng)短無關(guān)。這表明，氯化鎘會(huì)影響原生質(zhì)體對(duì)內(nèi)部Ca2+濃度分布的調(diào)控能力，從而引起細(xì)胞液內(nèi)Ca2+的濃度分布發(fā)生輕微的分層。

與上述處理結(jié)果不同，經(jīng)乙醇處理的蘆薈細(xì)胞原生質(zhì)體在破裂時(shí)，其Ca2+濃度脈沖信號(hào)的前沿處沒有發(fā)生凹陷現(xiàn)象(圖9)，這說明，乙醇處理并不會(huì)影響細(xì)胞液中Ca2+的流動(dòng)性，也不會(huì)出現(xiàn)Ca2+濃度分層現(xiàn)象。

綜上，本文提出了一種離子選擇性微電極用于單細(xì)胞檢測(cè)的新模式，即利用離子選擇性微電極對(duì)原生質(zhì)體破裂時(shí)產(chǎn)生的離子濃度脈沖信號(hào)進(jìn)行測(cè)量，進(jìn)而分析細(xì)胞液內(nèi)的離子濃度分布情況。用這一方法對(duì)經(jīng)過低溫冷凍、CuO NPs、硝酸鋱、氯化鎘和乙醇處理的蘆薈細(xì)胞原生質(zhì)體進(jìn)行了測(cè)量和分析，得到了一些新的有意義的結(jié)果。這一新的模式為研究細(xì)胞液中的離子濃度分布提供了新的方法，也可為各種環(huán)境和生態(tài)毒理學(xué)評(píng)價(jià)提供新的途徑。