李峰，由文華，劉沅龍

1. 西安建筑科技大學(xué)體育學(xué)院，西安 710055 2. Department of Human Performance and Health Education, Western Michigan University, Kalamazoo, Michigan 49008, USA

體育館內(nèi)PM2.5的來源主要包括外源性和內(nèi)源性2種，其中外源性主要包括場館門窗、圍護(hù)結(jié)構(gòu)縫隙進(jìn)入和人員出入時(shí)帶入等方式[1]；內(nèi)源性主要包括運(yùn)動(dòng)器械設(shè)備磨損后產(chǎn)生的顆粒物，館內(nèi)人員通過皮膚代謝物、呼吸和服裝攜帶的顆粒物，以及場館內(nèi)人員移動(dòng)蕩起的揚(yáng)塵等[2]。場館內(nèi)顆粒物的特征主要表現(xiàn)為來源成分復(fù)雜、積累時(shí)間長、不容易散發(fā)、濃度波動(dòng)范圍小和沉淀速度慢[3]，這種館內(nèi)外顆粒物的污染源共同構(gòu)成了館內(nèi)的污染物散發(fā)網(wǎng)絡(luò)。大氣細(xì)顆粒物的環(huán)境行為和健康效應(yīng)與其物理化學(xué)性質(zhì)有關(guān)，例如數(shù)濃度、質(zhì)量濃度、粒徑分布和化學(xué)組分等[4]。以往研究表明，作為復(fù)合型大氣污染環(huán)境中的主要污染物，PM2.5具有一定的免疫毒性，對運(yùn)動(dòng)時(shí)各系統(tǒng)組織器官具有較強(qiáng)的損害效應(yīng)[5]，能引起機(jī)體免疫系統(tǒng)疾病，其主要包括炎癥反應(yīng)損傷[6]、免疫損傷[7]、細(xì)胞自噬和凋亡等[8]。喬玉成和張琦[9]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)過程中的呼吸方式改變、呼吸頻率增加、肺擴(kuò)散能力增強(qiáng)和產(chǎn)熱量增加是人體運(yùn)動(dòng)狀態(tài)比安靜狀態(tài)更容易遭到損傷的原因。暴露于PM2.5污染環(huán)境下運(yùn)動(dòng)，呼吸系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)受到的污染效應(yīng)與其沉積的污染量有關(guān)[10]。樊西寧研究發(fā)現(xiàn)[11]，沉積率與呼吸頻率、呼吸量成正比，呼吸頻率、呼吸量值越大，沉積率的值就越高，污染效應(yīng)就越大。機(jī)體的免疫系統(tǒng)是防御外來有害物質(zhì)入侵的屏障，因此，研究PM2.5的環(huán)境行為、在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)化行為、生物代謝機(jī)制以及對運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下機(jī)體的炎性損傷及其機(jī)制，可以為今后在污染環(huán)境下運(yùn)動(dòng)的可行性評估和人群運(yùn)動(dòng)防護(hù)提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 PM2.5的采樣及懸液制備[12]

在某校綜合體育館內(nèi)用TH-150 C型(武漢天虹)顆粒物智能采樣器采集PM2.5，采樣時(shí)保證采樣點(diǎn)周圍無堆積物以防遮擋空氣流通，同時(shí)保證采集點(diǎn)為非污染源。為模仿人體呼吸帶的高度，采樣時(shí)使儀器放置高度為1.5 m，即人體呼吸帶高度，采用同心圓方式選取5個(gè)點(diǎn)，2點(diǎn)之間相距5 m左右，離墻>1 m、離門窗>3 m，空氣流量為1.13 m3·min-1。按照儀器操作規(guī)則，使采氣流量保持定值，每天24 h連續(xù)采樣，持續(xù)30 d，根據(jù)采樣前、后濾膜質(zhì)量差和采樣體積得出顆粒物的質(zhì)量濃度。采樣時(shí)將已稱重的濾膜用鑷子放入結(jié)晶采樣夾的濾網(wǎng)上，濾膜毛面朝進(jìn)氣方向，將濾膜壓緊至不漏氣。采樣完畢后將PM2.5收集在玻璃纖維濾膜上，然后將濾膜裁剪為小塊后浸入去離子水中，經(jīng)超聲振蕩30 min×4次后用去離子水洗脫顆粒物，然后將濾液在4 ℃離心20 min(速度1 000 r·min-1，離心半徑59 mm)，真空干燥后稱重，-20 ℃保存。為保證顆粒物實(shí)際毒性效果，實(shí)驗(yàn)并未對顆粒物進(jìn)行消毒滅菌處理，染毒前用0.9%生理鹽水配制成需要的濃度，使用前超聲振蕩15 min使染毒懸液均勻，并滅菌備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒劑量與染毒方式

PM2.5采用氣管滴注法染毒，室內(nèi)溫度保持在20～26 ℃之間，濕度為44%～70%。滴注前受試物的溫度維持在37 ℃左右，將染毒懸液預(yù)溫至37 ℃，在乙醚麻醉后，3組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分別按低(7.5 mg·kg-1)、中(15 mg·kg-1)和高(30 mg·kg-1)劑量經(jīng)氣管注入PM2.5顆粒物染毒懸液，滴注體積為3 mL·kg-1(體重)，對照組滴注同等容量的生理鹽水，實(shí)驗(yàn)大鼠染毒后1 h進(jìn)行運(yùn)動(dòng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與運(yùn)動(dòng)方案

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用7周齡SPF級(jí)(specific pathogen free, SPF)健康成年雄性Wistar大鼠32只(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)飼養(yǎng)中心提供)，體重180～220 g。動(dòng)物購回后在常規(guī)飼養(yǎng)籠內(nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)室內(nèi)溫度20～26 ℃、濕度為44%～70%，自由進(jìn)食和飲水(飼料購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房)，照明隨同光照自然變化。所有動(dòng)物均依照《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)要求進(jìn)行處置[13]，染毒時(shí)間為訓(xùn)練前1 h。訓(xùn)練前將大鼠隨機(jī)分為4組，分別為運(yùn)動(dòng)對照組(EC)、低劑量(7.5 mg·kg-1)運(yùn)動(dòng)組(LPE)、中劑量(15 mg·kg-1)運(yùn)動(dòng)組(MPE)和高劑量(30 mg·kg-1)運(yùn)動(dòng)組(HPE)，每組8只，根據(jù)大鼠體重/攝氧量回歸方程建立遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)模型，正式訓(xùn)練前將所有實(shí)驗(yàn)大鼠先進(jìn)行2 d的適應(yīng)性訓(xùn)練，速度和時(shí)間分別以10 m·min-1、5 min·d-1進(jìn)行，訓(xùn)練方式為跑臺(tái)；然后所有動(dòng)物進(jìn)行1 d的訓(xùn)練前恢復(fù)，隨后按照15 m·min-1、15 min(相當(dāng)于45%最大攝氧能力)，18 m·min-1、20 min(相當(dāng)于50%最大攝氧能力)，21 m·min-1、30 min(相當(dāng)于65%最大攝氧能力)，24 m·min-1、40 min(相當(dāng)于70%最大攝氧能力)，27 m·min-1、50 min(相當(dāng)于76%最大攝氧能力)的遞增負(fù)荷形式進(jìn)行。

1.4 血清和肺泡灌洗液(BALF)制備與指標(biāo)測試

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻用20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉后處死大鼠，腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝，37 ℃恒溫水浴5 min后3 500 r·min-1離心15 min，分離血清并于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩？死?xì)胞蛋白(CC16)、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)、大鼠巨噬細(xì)胞炎癥蛋白1α(MIP-1α)和中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)的檢測均采用雙抗體夾心法(ABC-ELISA)，使用儀器為日本Olympus AU 400全自動(dòng)生化分析儀，ELISA試劑盒購自上海雅吉生化試劑六廠，所有操作均嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PM2.5對大鼠血清中免疫蛋白的影響

由表1可知，和EC組相比，LPE、MPE和HPE中MCP-1、MIP-1α和hs-CRP隨劑量增加而升高，NE和CC16則隨劑量增加而降低。

2.2 PM2.5對大鼠BALF中免疫蛋白的影響

表2數(shù)據(jù)顯示，和EC組相比，隨著PM2.5滴注劑量的增加，LPE、MPE和HPE組MCP-1、MIP-1α和hs-CRP表現(xiàn)出升高趨勢，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)，NE和CC16則隨著PM2.5劑量的升高而降低。

注：EC表示運(yùn)動(dòng)對照組，LPE表示低劑量運(yùn)動(dòng)組，MPE表示中劑量運(yùn)動(dòng)組，HPE表示高劑量運(yùn)動(dòng)組；MCP-1表示單核細(xì)胞趨化蛋白-1，MIP-1α表示巨噬細(xì)胞炎癥蛋白，hs-CRP表示超敏C反應(yīng)蛋白，NE表示中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶，CC16表示克拉拉細(xì)胞蛋白；與EC比較，*P<0.05、**P<0.01。
Note: EC represents exercise control group; LPE represents low-dose exercise group; MPE represents middle-dose exercise group; HPE represents high-dose exercise group; MCP-1 represents monocyte chemoattractant protein-1; MIP-1α represents macrophage inflammatory protein-1α; hs-CRP represents hypersensitive C-reactive protein; NE represents neutrophil elastase; CC16 represents Clara cell protein 16; compared with EC,*P<0.05,**P<0.01.

注：與EC比較，*P<0.05、**P<0.01。
Note: Compared with EC,*P<0.05,**P<0.01.

3 討論(Discussion)

3.1 PM2.5的環(huán)境行為對血清和BALF中MCP-1、MIP-1α和hs-CRP的影響

袁鵬和安蕾[14]研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5可以富集包含有機(jī)物、酸性氧化物、重金屬、細(xì)菌和病毒等有害物質(zhì)進(jìn)入呼吸道，甚至通過血液循環(huán)進(jìn)入全身各系統(tǒng)，對機(jī)體造成傷害。尤其是在運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下，人的呼吸以及各種帶香味的護(hù)理用品會(huì)散發(fā)檸檬烯等萜烯類化合物，萜烯類化合物也能與O3反應(yīng)產(chǎn)生顆粒物，從而導(dǎo)致顆粒物濃度增加[15]。同時(shí)，運(yùn)動(dòng)人群裸露的皮膚、毛發(fā)和皮膚油的某些成分作為場館內(nèi)顆粒物的內(nèi)源性來源可以與O3快速反應(yīng)生成超細(xì)顆粒物(ultra-fine particules, UFPs)，而UPFs是一類以惰性碳為中心的顆粒物，具有極大的比表面積且有著很強(qiáng)的核吸附能力，可以損壞肺泡巨噬細(xì)胞清除有害物質(zhì)的能力，并能通過上皮屏障，釋放大量的炎性介質(zhì)從而引起更強(qiáng)炎性反應(yīng)[16]。

在運(yùn)動(dòng)過程中隨著呼吸的加深加快導(dǎo)致機(jī)體的肺活量和肺通氣效率都增加，以滿足機(jī)體運(yùn)動(dòng)的需要，但同時(shí)也必然會(huì)吸入更多的PM2.5。MCP-1趨化因子是一類參與機(jī)體多種機(jī)能活動(dòng)的重要免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)因子，在急性組織損傷中也發(fā)揮著重要的作用，具有誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化和激活單核細(xì)胞的雙重功效[17]。除了細(xì)胞免疫反應(yīng)之外，MCP-1還可以構(gòu)成早期抵御微生物侵入的防線[18]，誘導(dǎo)單核細(xì)胞表面粘附分子及細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1 (IL-1)和白細(xì)胞介素6(IL-6)的表達(dá)，調(diào)節(jié)單核細(xì)胞的多種功能[19]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，急性PM2.5暴露對運(yùn)動(dòng)大鼠部分血清免疫蛋白產(chǎn)生不利影響，且不同劑量的PM2.5所引起的機(jī)體免疫反應(yīng)是不相同的，具體表現(xiàn)在隨著PM2.5暴露劑量的增加，血清和BALF中MCP-1表現(xiàn)出劑量相關(guān)性升高趨勢；相應(yīng)機(jī)制可能是由于PM2.5進(jìn)入機(jī)體后具有一定的生物蓄積行為，其所含的各種有害物質(zhì)會(huì)對組織細(xì)胞的抗氧化酶及內(nèi)穩(wěn)態(tài)造成破壞，通過氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子刺激前炎性細(xì)胞素的釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)失衡[20]。PM2.5中的有機(jī)污染物由于具有較強(qiáng)的疏水性，進(jìn)入機(jī)體后可以與機(jī)體內(nèi)各種免疫因子、免疫蛋白結(jié)合[21]，使得PM2.5的遷移、分配和生物反應(yīng)等出現(xiàn)不穩(wěn)定性的生物-化學(xué)危害效應(yīng)。

由于MIP-1α在炎癥、創(chuàng)傷等刺激下出現(xiàn)炎癥性表達(dá)，參與機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)[22]。因此，在運(yùn)動(dòng)大鼠接受PM2.5暴露和短時(shí)間大強(qiáng)度應(yīng)激2種刺激后，血清和BALF中MIP-1α表達(dá)增加，可能是PM2.5作用機(jī)體后產(chǎn)生的一系列因素綜合作用的結(jié)果，比如氧化應(yīng)激、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化等[23]。

hs-CRP作為機(jī)體對外界環(huán)境污染、運(yùn)動(dòng)應(yīng)激時(shí)分泌的急性應(yīng)激免疫細(xì)胞因子，是免疫網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，它的表達(dá)與分泌不僅與免疫細(xì)胞的分化增殖和功能發(fā)揮密切相關(guān)，也是評價(jià)呼吸道上皮屏障功能的早期敏感指標(biāo)，可以反映呼吸道的損傷程度及肺-血屏障的完整程度[24]。PM2.5暴露后運(yùn)動(dòng)大鼠血清和BALF中hs-CRP升高，且低劑量組和高劑量組中hs-CRP與對照相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是由于PM2.5的毒性作用增加了運(yùn)動(dòng)過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞表面可溶性細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)。由于hs-CRP是一種的急性應(yīng)激蛋白，其水平的高低反映了應(yīng)激反應(yīng)的強(qiáng)弱[25]，組織間通過直接(浸潤、聚集)或間接(產(chǎn)生細(xì)胞因子)作用，引起一定部位的組織損傷和炎癥反應(yīng)[26]。

3.2 不同劑量PM2.5對血清和BALF中NE和CC16的影響

場館內(nèi)外PM2.5在呼吸系統(tǒng)的沉積濃度會(huì)有差別，但是在不同器官的沉積效率卻較為相似[27]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，顆粒物在鼻腔咽喉部的沉積部分最大，但是真正對機(jī)體造成損害的沉積部位卻是肺泡部位[28]。因?yàn)榧?xì)顆粒物可以通過肺部的血液循環(huán)到達(dá)全身各處。因此，本實(shí)驗(yàn)中BALF和血液中免疫指標(biāo)的變化可以很大程度上代表PM2.5對機(jī)體其他器官的免疫損害。

CC16作為肺上皮細(xì)胞的特異性蛋白，可以保護(hù)呼吸道、抵御氧化應(yīng)激和免疫調(diào)節(jié)等，同時(shí)也是評價(jià)呼吸道上皮屏障功能的早期敏感指標(biāo)，具有抗炎、抗纖維化及活躍的增殖分化能力[29]。本研究結(jié)果顯示，與EC組相比，CC16隨著PM2.5劑量的增加而降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，在此運(yùn)動(dòng)模型中PM2.5暴露可以破壞機(jī)體的肺-血屏障的完整程度[30]，造成肺上皮細(xì)胞膜的通透性增加，從而使蛋白從血管外滲透到血管內(nèi)，對呼吸系統(tǒng)造成損傷。

NE在體外循環(huán)引起的組織器官損害中起著重要作用，其作為判斷組織免疫損傷強(qiáng)度的一個(gè)指標(biāo)，NE指標(biāo)的變化反映了機(jī)體免疫系統(tǒng)對外界刺激反應(yīng)能力的敏感程度[31]。機(jī)體免疫系統(tǒng)受到外源性刺激的大小、炎性介質(zhì)釋放量的多少以及組織損傷的程度都與NE的釋放量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠在PM2.5暴露的刺激下NE的含量降低，表明機(jī)體PM2.5可破壞細(xì)胞間的緊密連接和基底膜的完整性，使血管通透性增加，加重氣道炎癥，導(dǎo)致一過性氣道狹窄及阻塞，引起通氣功能下降[32]，同時(shí)機(jī)體的中性粒細(xì)胞在PM2.5的刺激下會(huì)釋放較少的炎性介質(zhì)，這在免疫學(xué)上稱為初始啟動(dòng)[33]，當(dāng)作為免疫應(yīng)激反應(yīng)的免疫蛋白過多時(shí)，會(huì)使免疫系統(tǒng)受到疊加效應(yīng)，如果這種疊加效應(yīng)超過了神經(jīng)-內(nèi)分泌-內(nèi)穩(wěn)態(tài)的控制水平，則分解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致炎癥發(fā)生遷移。

綜上，機(jī)體的免疫反應(yīng)與PM2.5環(huán)境行為和代謝毒理之間存在著直接的耦合關(guān)系，且受到多種因素的影響。PM2.5在組織細(xì)胞內(nèi)的粘附、遷移和毒性作用導(dǎo)致的細(xì)胞形變會(huì)驅(qū)動(dòng)細(xì)胞膜脂質(zhì)重組，改變細(xì)胞膜間隙的通過能力。BALF和血清分別作為肺組織和血液循環(huán)系統(tǒng)的代表，其機(jī)械屏障會(huì)受到PM2.5的攻擊入侵。而免疫蛋白作為免疫應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志性蛋白，不同劑量的PM2.5暴露對大鼠免疫指標(biāo)的影響可以有效指示運(yùn)動(dòng)大鼠暴露于環(huán)境污染物的健康風(fēng)險(xiǎn)。MCP-1、MIP-1α、hs-CRP、NE和CC16的變化也進(jìn)一步解釋了PM2.5對生物體致炎作用的機(jī)制與免疫蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。