易曉紅，李汶峰，鐘占瓊，賀玉萍，謝璐霜，陳繼蘭，李 敏，龔圓淵，楊 嵐

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指患者在無過量飲酒史的條件下，以肝細胞內脂肪過度沉積并超過5%～10%的肝重量為主要特征的臨床病理綜合征。如不及時治療，可演變?yōu)橹拘愿窝住⒏斡不?、肝纖維化、甚至發(fā)展成肝細胞癌[1]。全球流行病學調查表明，我國非酒精性脂肪肝的發(fā)病率約為15%[2]。而上海地區(qū)的患病率更是高達17.29%[3]。NAFLD不僅給患者帶來沉重的疾病痛苦和經(jīng)濟壓力，而且為國家?guī)沓林氐慕?jīng)濟負擔和人才損失。目前，尚無推薦用于NAFLD常規(guī)治療的藥物，只能通過改變不良生活方式[4]，或服用胰島素增敏劑、減肥藥、調脂藥、血管緊張素受體拮抗劑、抗氧化劑等防治糖代謝紊亂，間接改善NAFLD病情[5]。因而，針對NAFLD新靶點創(chuàng)新藥物的研究具有重要意義。研究[6-7]表明，ab-水解酶域包含蛋白6(alpha/beta-Hydrolase domain containing 6,ABHD6)在NAFLD的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，是脂肪代謝的關鍵酶之一。研究[8-9]顯示在NAFLD患者中，ABHD6的表達很高，ABHD6可以水解幾個脂質底物，在甘油磷脂代謝和脂質信號轉導的過程中起到重要作用。ABHD6抑制劑報道目前較少，2015年，Abide et al發(fā)現(xiàn)了吡咯類和唑酮類的小分子ABHD6抑制劑[9-12]。本課題前期研究工作中基于和這類化合物結構相似的38個活性已知的ABHD6小分子抑制劑(0.04 μmol/L

圖1 N67結構式(分子量：483.16)

1 材料與方法

1.1細胞與試劑Swiss小鼠3T3-L1前脂肪細胞來自美國ATCC細胞庫；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、胎牛血清(FBS)、十二烷基磺酸鈉 (SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)和MTT、多聚甲醛(成都科龍試劑公司)；DMEM培養(yǎng)基、輔酶I(NADH)碘化丙啶(PI)、四甲基偶氮唑藍(MTT)和丙酮酸鈉(美國Sigma 公司)；胰蛋白酶 - EDTA溶液(0.25%，EDTA 0.52 mmol/L)、青霉素-鏈霉素溶液、兔單抗 β-actin(sc-4778)、兔多抗 ABHD6 Polyclonal Antibody(美國Millipore 公司)；Annexin V-EGFP/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)；顯影化學發(fā)光劑ECL，BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)。

1.2儀器與設備BIO-RAD680 酶標儀、Powerpas Basic蛋白電泳儀器(美國伯樂公司)；流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)；；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3方法

1.3.1細胞培養(yǎng) Swiss小鼠3T3-L1前脂肪細胞在DMEM 培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 μg/ml鏈霉素)中(以下簡稱 DMEM10)，于37 ℃、5% CO2孵箱環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)。當細胞生長至大部分融合時，用胰蛋白酶-EDTA溶液進行細胞傳代。

1.3.2細胞毒性試驗 取96孔培養(yǎng)板，每孔加入濃度為5×104個細胞/ml的100 μl的3T3-L1前脂肪細胞懸液，然后放入 37 ℃、5% CO2孵箱中進行培養(yǎng)。24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μl含有不同濃度的N65溶液，用不含樣品的DMEM10作為空白對照，孵箱孵育72 h。棄去培養(yǎng)液,加入0.5 mg/ml MTT的 DMEM10孵育4 h，再加入100 μl的0.1 g/ml的SDS溶液過夜。酶標儀在 570 nm處測定吸光度值。重復3次。以藥物濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標進行直線回歸并求出IC50。

1.3.3細胞形態(tài)觀察 用 90 mm 直徑培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞。貼壁培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，向皿中加入5 ml含有相應IC50的N67營養(yǎng)液，用不含有樣品的DMEM10為空白對照。孵育72 h后棄去培養(yǎng)液，用5 ml PBS溶液輕柔清洗細胞層，重復1次。于超凈臺上放置至干燥，于顯微鏡下放大200倍觀察凋亡的細胞形態(tài)。實驗重復3次。

1.3.4Annexin-FITC/PI雙染法流式細胞術測細胞凋亡 取24孔培養(yǎng)板，每孔加入濃度為5×104個細胞/ml的3T3-L1細胞懸液1 ml，于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。24 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入1 ml不同濃度的N65的培養(yǎng)液孵育，以不含樣品的DMEM 為空白對照，于48 h棄去培養(yǎng)液，PBS溶液清洗細胞層，洗液收集至離心管中。每孔加入500 μl胰蛋白酶-EDTA消化液，將細胞消化后其懸液打勻后加入離心管中。用4 ℃預冷的70%冷乙醇固定，4 ℃保存。調整細胞濃度為106細胞/ml，取1 ml細胞懸液，用PBS洗3次，細胞重懸于1 ml染液中，37 ℃孵育30 min即可進行流式分析。實驗重復3次。 于貝特曼庫爾特流式細胞儀檢測細胞凋亡，用貝特曼庫爾特軟件處理數(shù)據(jù)。

1.3.5Western blot實驗 預冷RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑。細胞計數(shù)，以細胞數(shù)量1×107加入1 ml裂解液，用槍頭吹打充分懸起細胞，完成后在冰上孵育20 min，4 ℃離心，離心完成后取上清，分裝保存，待測。BCA試劑測定蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白的分子量，配制12%分離膠，5%分離膠。待檢測蛋白樣品上樣15 μg。濃縮膠恒壓90V，約20 min，溴酚藍進行分離膠界面；分離膠恒壓160V，電泳至溴酚藍到凝膠底部。濕轉法轉膜，將膠完全浸沒封閉液中室溫輕搖60 min。用TBST稀釋一抗，室溫孵育10 min，放4 ℃過夜。第2天從冰箱拿出膜，在室溫孵育30 min。洗膜：TBST洗膜3次，每次10 min。二抗孵育，顯影，曝光。實驗重復3次。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較選用χ2或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1N67作用于3T3-L1細胞的細胞形態(tài)觀察分別將0.625、1.25、2.5、5 mg/ml N67處理的 3T3-L1 前脂肪細胞固定，并設對照組，24 h后利用顯微鏡觀察細胞形態(tài)。如圖 2 所示，第一行的圖片示顯微鏡下各組細胞的圖像,為方便觀察和計數(shù),第二行在第一行的圖片上用綠色標記活細胞，列入計數(shù)范圍，紅色標記為非活細胞。對照組的細胞生長狀況良好，結構完整，形態(tài)正常，細胞核居中。而處理組的細胞相對分散，細胞數(shù)量隨著N67濃度升高而減少，細胞失去纖維狀形態(tài)，細胞具有典型的凋亡形態(tài)特征:體積縮小、細胞核固縮、核染色質邊集聚，甚至核碎裂。計數(shù)每個實驗組5個視野的細胞數(shù)進行統(tǒng)計分析，實驗組與control組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.2N67對3T3-L1前脂肪細胞生長抑制作用由圖4可知，N67對 3T3-L1 前脂肪細胞有明顯生長抑制作用。隨著N67濃度的升高(0.6～5)mg/ml，細胞的存活率下降，劑量效應關系明顯。從圖4可以看出，N67的濃度從0.6 mg/ml到5 mg/ml,細胞存活率從約75% 降至 10%。以細胞存活率與N67的濃度進行直線回歸并求出 IC50。經(jīng)計算，N67對 3T3-L1 前脂肪細胞的 IC50為 (0.66±10)mg/ml。

2.3N67誘導3T3-L1細胞的凋亡3T3-L1前脂肪細胞經(jīng)不同濃度的N67處理，24 h后分別在流式細胞儀上測定細胞凋亡的變化。用貝特曼庫爾特軟件進行細胞周期分析。圖5中四個象限Q1區(qū)域的細胞為壞死細胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細胞在其中。Q2區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞。Q3區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞。Q4區(qū)域的細胞為活細胞。從圖5可看出 3T3-L1前脂肪細胞隨N67濃度早期凋亡細胞明顯增多，0.625 mg/ml濃度到2.5 mg/ml濃度凋亡細胞比例從1.17%上升至38.2%，說明N67對 3T3-L1前脂肪細胞有誘導凋亡的作用。

圖2 不同濃度N67對3T3-L1細胞形態(tài)的影響

圖3 不同濃度 N67對3T3-L1細胞作用后的形態(tài)計數(shù)

圖4 N67對3T3-L1細胞生長抑制作用的劑量效應關系

圖5 N67誘導3T3-L1細胞凋亡

2.4Westernblot實驗結果分析如圖6所示，已知ABHD6的分子量為38.3 ku,結果顯示在此范圍出現(xiàn)目的條帶，并且隨著濃度的升高，蛋白表達降低，實驗組與control組差異均有意義(P<0.05，P<0.01)。說明藥物對3T3-L1前脂肪細胞有抑制作用，并且靶點為ABHD6。

圖6 N67抑制ABHD6的表達并具備濃度依賴性

3 討論

Swiss小鼠前脂肪細胞3T3-L1是來源于小鼠的前脂肪細胞的細胞株，具有接觸性抑制生長特征且可向脂肪樣細胞分化特性，是國際上公認的研究脂肪細胞分化的細胞模型。ABHD6是由337個氨基酸組成的蛋白質，相對分子量為38.3 ku。ABHD6基因屬于α/β水解酶超家族，這一家族也是目前所知最大的蛋白超家族之一，它們具有相似的高級結構,即共有一個α/β水解酶折疊結構[6]。此前的一些研究[13-15]表明，ABHD6可以水解單酰甘油，從而調節(jié)脂類代謝和胰島素的分泌，因此在治療非酒精性脂肪肝以及糖尿病的過程中，它們起著重要的作用。

Discovery Studio是一個面向生命科學領域的新一代分子建模和模擬環(huán)境的軟件，它的Catalyst Hypothesis模塊可對一組化合物進行基于特性結構的比對，并且自動生成藥效團模型。若能提供具體的活性數(shù)據(jù)，則可產(chǎn)生3D-QSAR藥效團并預測新化合物的活性，節(jié)約大量的實驗時間和成本。所以此款軟件在藥物篩選和模擬有效活性團模型構件上被廣泛應用，在疾病治療的創(chuàng)新藥物研發(fā)上取得了很好的效果。結構和N67類似的化合物已經(jīng)有相應的報道，筆者在之前的研究基礎上進一步用該藥效團模型對10 000個化合物的數(shù)據(jù)庫進行虛擬篩選,得到一個活性較好的化合物，命名為N67。

本實驗證明新型小分子化合物N67對Swiss小鼠前脂肪細胞3T3-L1具有明顯的生長抑制作用，且呈劑量依賴效應，IC50為(0.66±10)mg/ml。對其生長抑制機制進行研究發(fā)現(xiàn)，N67可通過調節(jié)其表達來發(fā)揮作用，誘導3T3-L1前脂肪細胞凋亡。其機制可能是通過作用于ABHD6靶點。由于細胞凋亡過程中多條通路在發(fā)揮作用而且交叉。相同的藥物作用不同的細胞系所啟動的信號通路可能不同，不同的藥物作用于同一個細胞系啟動的也不同，本實驗只是初步發(fā)掘N67對ABHD6的作用機制，具體的凋亡機制研究具有進一步研究的潛在價值。同時實驗亦說明ABHD6是治療非酒精性脂肪肝的潛在靶點之一，對非酒精性脂肪肝的治療研究有一定臨床意義，值得進一步研究。此外值得肯定的是，實驗選擇的化合物研究表明，利用Discovery Studio軟件的Catalyst Hypothesis 模塊來構建藥效團模型具有可操作性和臨床應用的可能性。