張冰茹 鄔雨季 劉維明 邱宏偉 孫培龍 張安強(qiáng)

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灰樹花多糖的制備及藥理活性的研究進(jìn)展

張冰茹1鄔雨季1劉維明2邱宏偉2孫培龍1張安強(qiáng)1，*

（1.浙江工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)系，浙江 杭州 310014；2.浙江百山祖生物科技有限公司，浙江 麗水 323010）

通過查閱近十幾年的國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)得出，灰樹花的研究主要集中于灰樹花多糖。綜述灰樹花多糖的提取工藝、預(yù)處理方法、分離純化手段、結(jié)構(gòu)分析及抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂等多種藥理活性。

灰樹花多糖；提取工藝；分離純化；藥理活性

灰樹花（）又名蓮花菇、千佛菌等[1]，日本稱之為“舞茸”，是一種食藥兩用真菌，隸屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，樹花屬[2]。灰樹花性平味甘，中醫(yī)主要用于治療小便不暢、水腫、腳氣、肝硬化腹水、糖尿病、高血壓和肥胖癥等[3]。目前對(duì)灰樹花有效成分的研究主要集中于多糖。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，灰樹花多糖具有降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等多方面的活性[4-10]。

1 灰樹花多糖的提取

灰樹花多糖分為子實(shí)體多糖和菌絲體多糖，主要來源于子實(shí)體、發(fā)酵菌絲體及發(fā)酵液等[11]。目前較常見的提取方法有熱水提取法、堿提取法、微波提取法、超聲波提取法、酶解提取法。近年來，對(duì)其提取工藝探究仍在不斷深入，新的提取工藝不斷被開發(fā)，如低溫提取法、超臨界CO2提取法等。表1列舉了近年來灰樹花多糖的提取工藝。

表1 灰樹花多糖的提取工藝

此外，還可通過復(fù)合法提取多糖，如復(fù)合酶-微波輔助提取法[23]、超聲波-微波協(xié)同提取法[24]、熱水-超聲輔助法[25]等。采用輔助工藝可以有效地縮短提取時(shí)間，提高多糖提取率，降低生產(chǎn)成本。鐘敏等比較熱水浸提法、熱水-復(fù)合酶法、超聲波法、超聲波-復(fù)合酶法4種提取其菌絲體β-葡聚糖的工藝，并通過正交試驗(yàn)獲得最佳工藝，結(jié)果為超聲波-復(fù)合酶法在超聲功率300 W、超聲時(shí)間15 min、復(fù)合酶添加量1.5%、酶解溫度40 ℃條件下，β-葡聚糖的得率最高，達(dá)2.80 mg/g[26]。

為獲得更高的多糖提取率，提取工藝需不斷優(yōu)化，因此針對(duì)不同的提取工藝，通過比較不同的提取溫度、提取時(shí)間、水料比和提取次數(shù)等關(guān)鍵因素下多糖的提取率，來獲得最佳的提取工藝。表2列舉不同提取工藝的優(yōu)化結(jié)果。

表2 灰樹花多糖的最佳提取工藝

2 灰樹花多糖制備預(yù)處理

灰樹花多糖制備的預(yù)處理包括蛋白質(zhì)、色素和其他小分子的去除。

去除蛋白質(zhì)的方法主要有Sevag法、酶法和三氯乙酸法等[30, 31]，其中三氯乙酸法脫蛋白效率較好，Sevag法較差[32]。Sevag法和三氯乙酸法使用的試劑均為有機(jī)溶劑，Sevag法通常需要重復(fù)處理但在避免多糖被降解方面有較好的效果，而三氯乙酸法更容易造成某些多糖的分解[33]。酶法雖可避免有機(jī)溶劑的使用，但具有專一性，需要選擇合適的蛋白酶去除酶解產(chǎn)物。因此，目前灰樹花多糖大都采用Sevag法來去除蛋白。

提取得到的灰樹花粗多糖顏色常較深，是因其含有色素，因而需要進(jìn)行脫色處理。目前應(yīng)用于多糖的脫色方法包括過氧化氫法、活性炭法和大孔樹脂法[34]等。有研究表明，大孔樹脂法脫色率達(dá)到74.24%，多糖保留率為61.87%，比其他兩種脫色方法具有更佳的效果[35]。

另外，灰樹花粗多糖中還有一些殘留的小分子物質(zhì)，如低聚糖、多酚等，常采用透析法[36]。

3 灰樹花多糖的分離純化和結(jié)構(gòu)分析

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，灰樹花多糖的純化主要采用離子交換色譜法，凝膠柱色譜法和膜分離法。Li Q等將干燥的灰樹花子實(shí)體經(jīng)沸水提取、乙醇沉淀、三氯乙酸法脫蛋白、透析得粗多糖，再用DEAE-52柱對(duì)其進(jìn)行分離，后用SephacrylTMS-400 Superfine柱進(jìn)一步純化得到均勻多糖組分GFP-22[37]。劉紅梅等采用復(fù)合酶–微波輔助提取灰樹花多糖，活性炭脫色、乙醇沉淀得粗多糖，再經(jīng)微濾和超濾，得超濾截留液GFP-I和超濾透過液GFP-II[38]。Yuqing C等經(jīng)過乙醇脫脂、熱水–超聲輔助法提取、乙醇沉淀、Svega法除蛋白得到粗多糖，再經(jīng)過透析純化，DEAE Sephadex A-52柱進(jìn)一步分離，得到一種具有抗糖尿病活性的新型雜多糖GFP-W[39]。

近幾十年來，分析灰樹花中分離出來的多糖，主要關(guān)注在分子量、單糖組成、糖苷鍵類型和結(jié)構(gòu)特征等，分析手段主要有高效液相色譜法、核磁共振波譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、紅外光譜法、光散射法、甲基化分析和Smith降解分析等。表3列舉7種灰樹花多糖的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，包括分離純化手段、分析手段和分析結(jié)果。

4 灰樹花多糖的藥理活性

4.1 抗腫瘤、抗癌和免疫調(diào)節(jié)

大量文獻(xiàn)報(bào)道，灰樹花多糖具有抗腫瘤、抗癌及免疫調(diào)節(jié)作用[45-47]。Mao G H等通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)，結(jié)果顯示灰樹花多糖GFP11對(duì)HepG-2細(xì)胞沒有直接的抑制作用，但能夠顯著抑制小鼠體內(nèi) Heps細(xì)胞的生長，且無毒、無副作用；同時(shí)，GFP11還增加了相對(duì)胸腺和脾臟重量以及血清TNF-α和IL-2水平；經(jīng)過GFP11預(yù)處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基能顯著抑制HepG-2細(xì)胞的增殖；進(jìn)一步的研究顯示，GFP11通過上調(diào)iNOS蛋白，iNOS mRNA和TNF-αmRNA的表達(dá)水平來增加巨噬細(xì)胞中NO、TNF-α和IL-1β的釋放，由此產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤的間接作用[48]。韓麗榮的研究顯示，灰樹花胞外多糖A組分可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌NO，并通過多種途徑激活細(xì)胞，增強(qiáng)其增殖活性，起到免疫調(diào)節(jié)作用[49]。另有研究顯示，灰樹花多糖的衍生物如硫酸化多糖可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡從而抑制癌細(xì)胞的生長[50]。Wang C L等研究從灰樹花中提取的硫酸化多糖S-GFB誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制，結(jié)果表明S-GFB抑制缺口1表達(dá)，導(dǎo)致NF-κB/ p65無法通過缺口1進(jìn)入細(xì)胞核，使細(xì)胞阻滯在s期，引起HepG2細(xì)胞的凋亡[51]。

表3 灰樹花多糖的結(jié)構(gòu)分析

4.2 抗病毒

研究表明，灰樹花多糖對(duì)Ⅰ型單純性皰疹病毒有直接滅活作用[52]。Zhao C等從灰樹花菌絲體中分離出的中性多糖GFP1，可抑制病毒VP1蛋白質(zhì)表達(dá)和RNA合成，同時(shí)還抑制由EV71引起的caspase-3活化和NFκB信號(hào)傳導(dǎo)，從而表現(xiàn)出對(duì)感染EV71細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）和細(xì)胞凋亡的抑制作用[41]。趙霏等研究灰樹花多糖MP抗乙型肝炎病毒的活性，及其在不同濃度下對(duì)Hep G2.2.15細(xì)胞的生長抑制作用，發(fā)現(xiàn)了MP對(duì)Hep G2.2.15細(xì)胞HBe Ag分泌和HVB DNA合成有顯著抑制作用[53]。Gu C Q等的研究表明，灰樹花多糖D組分能夠抑制HVB聚合酶的活性，且與干擾素聯(lián)用能夠產(chǎn)生協(xié)同作用[54]。

4.3 抗氧化

吳林秀等證實(shí)，灰樹花液體發(fā)酵的菌絲體在體外具有良好的抗氧化能力[55]。顧華杰等通過測(cè)定灰樹花粗多糖對(duì)超氧陰離子自由基 (O2-·)和羥基自由基 (·OH) 的清除能力來評(píng)價(jià)其抗氧化性，結(jié)果表明，灰樹花粗多糖對(duì)·OH的清除率遠(yuǎn)高于O2-·的[56]。Chen G T等采用超聲波提取灰樹花多糖，分離提純得到3種多糖GFP-1、GFP-2和GFP-3，在抗氧化能力測(cè)定試驗(yàn)中，GFP-2表現(xiàn)的抗氧化活性最強(qiáng)；同時(shí)將3種多糖作用于小鼠肝勻漿，發(fā)現(xiàn)能夠有效延緩小鼠肝勻漿中不飽和脂質(zhì)的氧化反應(yīng)[18]。

4.4 降血糖、降血脂

從灰樹花子實(shí)體中提取的α-葡聚糖可以有效降低2型糖尿病小鼠的血糖和血清脂質(zhì)水平，促進(jìn)胰島素的分泌和改善，保護(hù)胰腺β細(xì)胞不受破壞[57]。研究表明，灰樹花菌絲體多糖能夠降低STZ致糖尿病小鼠的血糖水平、TC、TG以及LDL-C，且其降低程度與使用劑量有一定關(guān)系[58]。雷紅等研究灰樹花子實(shí)體多糖MT-α-glucan的降血糖活性，對(duì)自發(fā)性2型糖尿病小鼠進(jìn)行單次、多次和連續(xù)給藥，結(jié)果表明MT-α-glucan能夠有效降低患病小鼠的血糖水平，同時(shí)增強(qiáng)小鼠對(duì)葡萄糖的耐受性；經(jīng)初步探究MT-α-glucan的降血糖機(jī)理，認(rèn)為MT-α-glucan對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有抑制作用，從而延緩葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收[59]。楊慶偉等從灰樹花菌絲體中提取出水不溶性多糖并進(jìn)行硫酸化，得到硫酸化多糖S-GF，對(duì)高血脂實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行14天的S-GF喂養(yǎng)，觀察到經(jīng)喂養(yǎng)的高血脂實(shí)驗(yàn)小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平比對(duì)照組要低[60]。

4.5 其他作用

除上述作用外，灰樹花多糖還有抗輻射、抗菌、保護(hù)胃粘膜、保護(hù)肝臟等功能。用60Co-γ射線照射小鼠，未食用灰樹花多糖的小鼠表現(xiàn)出明顯的輻射損傷如外周血WBC計(jì)數(shù)嚴(yán)重降低及骨髓細(xì)胞DNA含量下降，而給予高劑量灰樹花多糖小鼠的輻射損傷程度則明顯減輕[61]。KLAUS A等用紙片擴(kuò)散法、微量肉湯稀釋法和肉湯稀釋法測(cè)定灰樹花堿提多糖和水提多糖的抗菌活性，結(jié)果顯示堿提多糖具有更好的抗菌潛力[62]。黃家福等研究發(fā)現(xiàn)，灰樹花多糖GFP可能通過上調(diào)GES–1表達(dá) TFF2 mRNA、TFF2、EGF，下調(diào)TGF–β1 mRNA、TGF–β1表達(dá)來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)GES–1細(xì)胞增殖，加速GES–1創(chuàng)傷胃粘膜愈合[63]。

5 結(jié) 語

迄今，對(duì)灰樹花多糖的研究主要集中于多糖的提取及分離純化、結(jié)構(gòu)分析和藥理活性等方面。大量的文獻(xiàn)報(bào)道已證實(shí)灰樹花多糖具有抗腫瘤、抗癌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂和抗氧化活性。這些研究結(jié)果為探索灰樹花多糖的構(gòu)效關(guān)系，以及灰樹花多糖的精深加工和產(chǎn)品開發(fā)提供了重要的科學(xué)理論依據(jù)。

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Research progress on preparation and pharmacological activities of polysaccharide from

Zhang Bingru1Wu Yuji1Liu Weiming2Qiu Hongwei2Sun Peilong1Zhang Anqiang1

(1.Department of Food and Technology, Zhejiang University of Technology, Hangzhou, Zhejiang, 310014, China； 2. Zhejiang Baishanzu Biotechnology Co., Ltd., Lishui, Zhejiang, 323010, China）

Grifola frondosa is an edible and medicinalmushroom with a variety of bioactive ingredients in its fruiting bodies, mycelium and deep fermentation broth. In recent years, research onhas focused on its polysaccharides. Through reviewing relevant literatures in domestic and abroad for more than a decade, it is known that the polysaccharide ofhas anti-tumor, anti-viral, anti-oxidation, immune regulation and other functions. This paper reviews the extraction process, pretreatment method, separation and purification methods, structural analysis and pharmacological activities and provides a scientific theoretical basis for further deep processing and product development research onpolysaccharides.

polysaccharide; extraction process;separation and purification;pharmacological activity

S646

A

2095-0934（2019）02-099-07

浙江省自然基金（LY17C200017）；浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018C02045）

張冰茹，女，碩士研究生，從事食用菌精深加工研究。

，E-mail：zhanganqiang@zjut.edu.cn。