王婕，張妙，呂欣桐，喬俏

110001 沈陽，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射治療科

頭頸部腫瘤是全球第六大常見惡性腫瘤，也是發(fā)展中國家第三大常見腫瘤。其中口咽癌約占4.2%。放射治療是其主要的治療方法之一。盡管近幾年來放療治療技術(shù)取得了很大進(jìn)步，但近半個世紀(jì)來其5年生存率始終徘徊在50%[1]。因此，尋求有效途徑抑制口腔癌細(xì)胞增殖，提高其治愈率是目前亟待解決的問題。有文獻(xiàn)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路PERK-eIF2α可激活細(xì)胞中的自我保護(hù)機(jī)制從而抑制細(xì)胞凋亡[2]。而核因子κB(NF-κB)可以抑制細(xì)胞凋亡，并已在膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等其它惡性腫瘤中得到證實[3-4]。因此，我們認(rèn)為通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路PERK-eIF2α介導(dǎo)NF-κB或可誘導(dǎo)口咽癌細(xì)胞凋亡。本研究以口咽鱗癌細(xì)胞系(Fadu、Detroit 562)為細(xì)胞模型，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路PERK-eIF2α參與調(diào)控口咽癌細(xì)胞增殖具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MEM、RPMI 1640和胎牛血清購自于美國GIBCO公司。GSK2606414購自德國Calbiochem公司。Bay11-7082、DMSO、RIPA裂解液、FITC Annexin V 凋亡檢測試劑盒(APOAF)購自于美國Sigma公司。Negative siRNA、PERK siRNA、eIF2α siRNA和轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECT 1購自于美國Dharmacon公司。phospho-eIF2α、phospho-p65、p65、兔抗人β-actin購自于美國Cell Signaling公司。Thapsigargin、PERK購自于英國Abcam公司。MTT試劑盒、BCA濃度測定試劑盒、Western Blot實驗相關(guān)試劑購買于中國碧云天生物科技公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

本研究選用HPV(-)的口咽鱗癌Fadu細(xì)胞株和Detroit 562細(xì)胞株。Fadu細(xì)胞用含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)瓶、Detroit 562細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)瓶在37 ℃、5% CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞種植密度為70%～80%時，將Negative siRNA、PERK siRNA、eIF2α siRNA、轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECT 1和培養(yǎng)液按實驗要求混合后分別加入各組培養(yǎng)皿中，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，48～60 h收取細(xì)胞。

1.3 MTT實驗

檢測不同濃度PERK通路抑制劑GSK2606414對口咽鱗癌細(xì)胞增殖的影響：接種兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5×103個細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，給予不同濃度的GSK2606414處理兩種細(xì)胞，濃度從低到高依次為0 μmmol/L、1 μmmol/L、10 μmmol/L、50 μmmol/L，同時設(shè)計陰性對照組。每組設(shè)3個復(fù)孔，分別于培養(yǎng)24 h后加入20.00 μL MTT，在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入150 μL DMSO，于37 ℃孵育30 min，酶標(biāo)儀上振蕩10 min，以酶標(biāo)儀檢測波長570 nm處吸光度(A)值，計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=(實驗組A值-調(diào)零組A值)/(對照組A值-調(diào)零組A值)×100%。另給予兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)不同濃度的NF-κB抑制劑Bay11-7082處理，濃度從低到高依次為0 μmmol/L、1 μmmol/L、10 μmmol/L、50 μmmol/L，同時設(shè)計陰性對照組，以同樣的方法檢測。另給與兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)5 Gy X射線照射，分別設(shè)立Negative siRNA組、Negative siRNA+IR組、PERK siRNA+IR組和eIF2α siRNA+IR組，以同樣的方法檢測。

1.4 Western Blot實驗

檢測沉默PERK、eIF2α及Thapsigargin處理后對口咽癌細(xì)胞中PERK、phospho-eIF2α、phospho-p65、p65蛋白表達(dá)的影響：參照參考文獻(xiàn)[5]的實驗方法，兩組細(xì)胞分別設(shè)立Negative siRNA組、PERK siRNA組、eIF2α siRNA組、Thapsigargin(100 nmol/L，24 h)組。25 mL的培養(yǎng)瓶接種細(xì)胞，細(xì)胞種植密度為70%～80%時，將Negative siRNA、PERK siRNA、eIF2α siRNA、轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECT 1和培養(yǎng)液按實驗要求混合后分別加入各組培養(yǎng)皿中，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液，48～60 h收取細(xì)胞。RIPA裂解液提取細(xì)胞核蛋白及總蛋白，參照BCA蛋白檢測試劑盒說明書檢測蛋白濃度后，分別用6%、10%、12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5% BSA封閉，一抗PERK、phospho-eIF2α、phospho-p65、p65、β-actin 4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，應(yīng)用放射自顯影技術(shù)進(jìn)行蛋白條帶的顯影。Image J圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，獲得各條帶的吸光度(A)值，以相應(yīng)蛋白條帶的平均吸光度值與β-actin吸光度值的比值表示各組蛋白表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。另給予兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)5 Gy X射線照射，分別設(shè)立Negative siRNA組、Negative siRNA+IR組、PERK siRNA+IR組和eIF2α siRNA+IR組，以同樣的方法檢測。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

參照參考文獻(xiàn)[6]的實驗方法，接種2種口咽癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞種植密度為70%～80%時，將口咽癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)分別設(shè)立Negative siRNA組、PERK siRNA組、eIF2α siRNA組。將Negative siRNA、PERK siRNA、eIF2α siRNA、轉(zhuǎn)染試劑DharmaFECT 1和培養(yǎng)液按實驗要求混合后分別加入各組培養(yǎng)皿中，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液。結(jié)束培養(yǎng)后，胰酶消化提取細(xì)胞，4 ℃預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次；參照試劑盒的說明書，用1X Banding Buffer重新懸浮細(xì)胞，加入5 μL PI、5 μL Annexin V，避光10 min。1 h內(nèi)上機(jī)進(jìn)行檢測。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞時，至少檢測5 000個細(xì)胞。另將兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)分別設(shè)立對照組、Bay11-7082組，以同樣的方法檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PERK-eIF2α信號通路特異性抑制劑GSK2606 414抑制口咽癌細(xì)胞增殖

如圖1所示，MTT實驗檢測GSK2606414對兩種細(xì)胞存活率的影響。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，隨著GSK2606414預(yù)處理濃度的增加，F(xiàn)adu細(xì)胞及Detroit 562細(xì)胞的存活率均逐漸降低(F=56.06，P=0.001；F=71.13，P=0.001)。這一結(jié)果提示，抑制PERK通路抑制口咽癌細(xì)胞增殖。

圖1.不同濃度GSK2606414處理后口咽癌細(xì)胞活力

Figure1.CellViabilityafterTreatmentofTwoOropharyngealCancerCellsinMTT

*P< 0.05,#P< 0.01

2.2 沉默PERK-eIF2α信號通路活化誘導(dǎo)口咽鱗癌細(xì)胞凋亡

采用流式細(xì)胞儀檢測Negative siRNA組、PERK siRNA組及eIF2α siRNA組細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，PERK siRNA組及eIF2α siRNA組兩種口咽癌細(xì)胞凋亡比例均較Negative siRNA組明顯增高，見圖2A。其中PERK siRNA組Fadu細(xì)胞、Detroit 562細(xì)胞凋亡比例分別為(5.61±1.19)%和(8.69±1.04)%，分別較各自的Negative siRNA組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.16,14.54，P<0.05)。而eIF2α siRNA組Fadu細(xì)胞、Detroit 562細(xì)胞凋亡比例分別為(9.67±1.01)%和(11.68±1.26)%，分別較各自的Negative siRNA組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=16.64,16.08，P=0.004,0.004)。實驗結(jié)果提示沉默PERK-eIF2α信號通路活化誘導(dǎo)口咽鱗癌細(xì)胞凋亡，見圖2 B。

2.3 抑制PERK-eIF2α信號通路下調(diào)NF-κB磷酸化

首先，在兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)中，通過轉(zhuǎn)染分別沉默PERK及eIF2a后，采用Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞PERK及phospho-eIF2a的表達(dá)均較對照組減少，見圖3 A、a、B、b。進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染同時沉默PERK與eIF2a后，采用Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞phospho-p65的表達(dá)均較對照組減少，見圖3 C、c。提示我們PERK-eIF2a激活NF-κB磷酸化。最后利用PERK激活劑Thapsigargin處理后，兩種細(xì)胞phospho-p65的表達(dá)均較對照組增加，見圖3 D、d。進(jìn)一步證實PERK-eIF2α信號通路異?；罨T導(dǎo)NF-κB磷酸化。

圖2.流式細(xì)胞儀檢測不同處理因素對細(xì)胞凋亡的影響

Figure2.ApoptosisafterTreatmentofTwoOropharyngealCancerCellsinFlowCytometry

*P< 0.05,#P< 0.01. A. Apoptosis rate of each group of Fadu and Detroit 562 cells;B. Statistical figure

圖3.蛋白印跡法檢測不同處理后兩種細(xì)胞中蛋白表達(dá)情況

Figure3.ProteinExpressioninTwoCellsafterDifferentTreatments

*P< 0.05. A. PERK protein images of Western Blotting assay; B. Phospho-eIF2a protein images of Western Blotting assay; C. Phospho-p65 protein images of Western Blotting assay; D. Phospho-p65 protein images of Western Blotting assay; a. Relative level of PERK; b. Relative level of phospho-eIF2a; c. Relative level of phospho-p65; d. Relative level of phospho-p65;

2.4 抑制NF-κB誘導(dǎo)口咽鱗癌細(xì)胞凋亡抑制其增殖

如圖4 A所示，MTT實驗檢測NF-κB抑制劑Bay11-7082對兩種細(xì)胞存活率的影響。實驗中我們發(fā)現(xiàn)，隨著Bay11-7082預(yù)處理濃度的增加，F(xiàn)adu細(xì)胞和Detroit 562細(xì)胞的存活率均逐漸降低(F=57.48，P=0.001；F=116.76，P=0.001)。這一結(jié)果提示，阻斷NF-κB通路抑制口咽癌細(xì)胞增殖。采用流式細(xì)胞儀檢測對照組及Bay11-7082組細(xì)胞凋亡情況發(fā)現(xiàn)，Bay11-7082組兩種口咽癌細(xì)胞凋亡比例均較對照組明顯增高，見圖4 B。其中Bay11-7082組Fadu細(xì)胞、Detroit 562細(xì)胞凋亡比例分別為(12.65±1.77)%和(11.84±0.98)%，分別較各自的對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.38,20.88，P=0.007,0.002)。實驗結(jié)果提示抑制NF-κB誘導(dǎo)口咽鱗癌細(xì)胞凋亡抑制其增殖，見圖4 C。

圖4.Bay11-7082處理后口咽癌細(xì)胞的情況

Figure4.OropharyngealCancerCellafterTreatmentwithBay11-7082

*P<0.05,#P<0.01. A. The viability of oropharyngeal cancer cells after treatment with different concentrations of Bay11-7082; B. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of Fadu and Detroit 562 cells after Bay11-7082 treatment; C. Statistical figure

2.5 抑制PERK-eIF2α信號通路下調(diào)NF-κB磷酸化抑制照射后口咽鱗癌細(xì)胞增殖

如圖5 A、B示，在兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)中，通過轉(zhuǎn)染分別沉默PERK及eIF2a后照射，采用Western Blot法檢測發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞phospho-p65的表達(dá)均較對照組減少。進(jìn)一步MTT法顯示，在兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)中，PERK siRNA+IR組和eIF2α siRNA+IR組細(xì)胞存活率均較對照組降低，見圖5 C。其中，F(xiàn)adu細(xì)胞中PERK siRNA+IR組和eIF2α siRNA+IR組細(xì)胞存活率分別為(0.8±0.08)和(0.61±0.06)，較Negative siRNA+IR組(0.95±0.04)均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.04,0.001)。Detroit 562細(xì)胞中PERK siRNA+IR組和eIF2α siRNA+IR組細(xì)胞存活率分別為(0.72±0.04)和(0.77±0.06)，分別較Negative siRNA+IR組(0.89±0.03)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003,0.025)。該結(jié)果提示抑制PERK-eIF2α信號通路下調(diào)NF-κB磷酸化抑制照射后口咽鱗癌細(xì)胞增殖。

圖5.Phospho-p65在口咽癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

Figure5.ExpressionofPhospho-p65inOropharyngealCancerCells

*P< 0.05,#P< 0.01. A. Phospho-p65 protein images of Western Blotting assay;B. Relative level of phospho-p65; C. The viability of oropharyngeal cancer cells after different treatment

3 討 論

近年來，人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染已成為口咽癌的重要發(fā)病原因之一。HPV(+)口咽癌患者比HPV(-)口咽癌患者的預(yù)后更好[7-8]。但是在亞洲人群中，HPV(-)口咽癌患者比例更高[9-10]。因此，提高HPV(-)口咽癌放療敏感性對我國口咽癌患者是更急于解決的問題。有鑒于此，我們選擇HPV(-)口咽癌細(xì)胞系為研究對象。越來越多的證據(jù)表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及對放化療敏感性的調(diào)控中起著重要作用。輻射導(dǎo)致DNA損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯誤折疊蛋白質(zhì)的積累以誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激常導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白質(zhì)或錯誤折疊蛋白的蓄積，引起未折疊蛋白反應(yīng)。因此，干擾未折疊蛋白反應(yīng)可能是治療腫瘤的機(jī)制之一。未折疊蛋白反應(yīng)通過3個定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白作為感受器，即PERK，IRE1α和ATF6。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積聚后PERK自身磷酸化胞質(zhì)激酶域，活化eIF2α，激活細(xì)胞中的自我保護(hù)機(jī)制并主動調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)蛋白[2]。另外，在鼻咽癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號通路可以通過增加其放射敏感性從而增加凋亡抑制其增殖[11-12]。但在人結(jié)直腸癌細(xì)胞和食管癌細(xì)胞中，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號通路可以增加其放射敏感性從而增加凋亡，抑制其增殖[13-14]。本實驗研究結(jié)果顯示，隨著PERK通路抑制劑GSK2606414預(yù)處理濃度的增加，兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)的存活率均逐漸降低。這一結(jié)果提示，通過抑制PERK通路可以抑制口咽癌細(xì)胞增殖。

凋亡是調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要途徑。本實驗研究結(jié)果顯示，在兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)中，通過轉(zhuǎn)染沉默PERK及eIF2a后，細(xì)胞凋亡比例明顯增高。實驗結(jié)果提示沉默PERK-eIF2α信號通路活化誘導(dǎo)口咽鱗癌細(xì)胞凋亡，這進(jìn)一步說明PERK抑制劑抑制細(xì)胞增殖通過誘導(dǎo)口咽癌細(xì)胞凋亡實現(xiàn)。

核因子-κB(NF-κB)是具有特異性DNA結(jié)合序列的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其中以NF-κB p65最為常見。NF-κB在與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的疾病中已被認(rèn)為是一種可行的治療靶點，如神經(jīng)退行性疾病和糖尿病[15-16]。前期研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑PERK-eIF2a通過激活NF-κB使在口咽癌細(xì)胞產(chǎn)生輻射抗拒性[17]。另外，Jiang[18]和Wek[19]以前的研究表明，eIF2α磷酸化可以激活人胚腎細(xì)胞中的NF-κB以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，Deng等[20]進(jìn)一步闡明了PERK的下游信號eIF2α通過降低IκBα水平激活NF-κB。有爭議的是，雖然Fan和Tyagi[21]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路PERK通過激活NF-κB以介導(dǎo)雌激素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但是與Cullinan等[22]的研究類似，其認(rèn)為PERK激活NF-κB不需要eIF2α磷酸化。我們在本實驗研究結(jié)果顯示，在兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)中，通過轉(zhuǎn)染沉默PERK及eIF2a后，PERK、phospho-eIF2a、phospho-p65的表達(dá)均較對照組減少。這一結(jié)果提示，PERK-eIF2a激活NF-κB磷酸化。為了進(jìn)一步證明上述實驗結(jié)果，我們利用PERK激活劑Thapsigargin處理兩種細(xì)胞后，其phospho-p65的表達(dá)均較對照組增加。進(jìn)一步證實PERK-eIF2α信號通路異常活化誘導(dǎo)NF-κB磷酸化。

核因子-κB(NF-κB)廣泛存在于各種類型的細(xì)胞中，參與協(xié)調(diào)許多生物學(xué)功能，包括細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡及腫瘤生長等[23-24]。其具有的抑制細(xì)胞凋亡的作用在膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等其它惡性腫瘤中得到證實[3-4]。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，隨著NF-κB抑制劑Bay11-7082預(yù)處理濃度的增加，兩種口咽鱗癌細(xì)胞(Fadu、Detroit 562)的存活率均逐漸降低。這一結(jié)果提示，阻斷NF-κB通路抑制口咽癌細(xì)胞增殖。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Bay11-7082處理后兩種口咽癌細(xì)胞凋亡比例明顯增高。實驗結(jié)果提示抑制NF-κB誘導(dǎo)口咽鱗癌細(xì)胞凋亡抑制其增殖。分別沉默PERK及eIF2a后照射發(fā)現(xiàn)，兩種細(xì)胞存活率及其phospho-p65的表達(dá)均較對照組減少，提示我們抑制PERK-eIF2α信號通路下調(diào)NF-κB磷酸化抑制照射后口咽鱗癌細(xì)胞增殖，故抑制該通路或可增加口咽鱗癌細(xì)胞對放射的敏感性。

綜上，本研究結(jié)果示抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路PERK-eIF2α調(diào)控NF-κB誘導(dǎo)口咽癌細(xì)胞增殖，為尋求有效途徑抑制口咽癌細(xì)胞增殖提供了新的靶點和理論依據(jù)。

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