張佳珊 譚 韜

(昆明理工大學(xué)靈長(zhǎng)類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，昆明650500)

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一種特別的免疫系統(tǒng)，利用Cas9(CRISPR associated protein 9)蛋白酶進(jìn)行切割，達(dá)到自身免疫的效果[1]。它是絕大部分細(xì)菌，以及一些古生菌的天然免疫系統(tǒng)。這篇綜述分別從CRISPR-Cas9靶向敲除目的基因的原理，應(yīng)用CRISPR相關(guān)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行小鼠的基因編輯，CRISPR-Cas9與ZFN、TALEN、RNAi等幾種不同的基因編輯技術(shù)相比的優(yōu)缺點(diǎn)，以及如何改進(jìn)CRISPR-Cas9靶向敲除的效率等五個(gè)方面論述了CRISPR-Cas9的近期狀況。

1 CRISPR-Cas9靶向敲除目的基因原理

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是古生菌等微生物本身處理外部DNA(Deoxyribonucleic acid)的系統(tǒng)，基本原理是由RNA(Ribonucleic acid)指導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾。CRISPR是一種有趣的重復(fù)序列，存在于基因組中，CRISPR位點(diǎn)由一些較短的、高度保守的重復(fù)序列組成，重復(fù)序列之間會(huì)被長(zhǎng)度為26～72 bp的間隔序列隔開，而序列長(zhǎng)度通常為21～48 bp[2]。 CRISPR系統(tǒng)的基因識(shí)別功能，就是通過這些間隔序列實(shí)現(xiàn)的[3]。當(dāng)CRISPR-Cas9系統(tǒng)去降解同源序列時(shí)，它是通過將DNA片段整理合并到CRISPR系統(tǒng)中，也就是降解了靶向序列，以此來實(shí)現(xiàn)靶向敲除等技術(shù)[4]。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)的工作原理是Guide-RNA和Cas9蛋白結(jié)合形成復(fù)合體[5]，簡(jiǎn)單來說，復(fù)合體擔(dān)負(fù)著導(dǎo)向作用，引導(dǎo)蛋白酶在靶位點(diǎn)剪切目標(biāo)DNA。應(yīng)用特異性RNA將Cas9酶引導(dǎo)到基因組的靶位點(diǎn)上，該基因的靶位點(diǎn)即為需要敲除掉的基因位點(diǎn)，DNA的定點(diǎn)切割就是這樣通過CRISPR系統(tǒng)完成的見圖1。

2 CRISPR-Cas9編輯小鼠的免疫球蛋白基因

2016年，Cheong等[6]利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)來編輯小鼠免疫球蛋白基因。其原理是通過Guide-RNA和Cas9結(jié)合來誘導(dǎo)免疫球蛋白重鏈(IgH)的類別轉(zhuǎn)換重組(CSR)，來得到需要的Ig亞型。

Cheong等[6]首先構(gòu)建了一個(gè)以小鼠免疫球蛋白重鏈(IgH)為靶向目標(biāo)的系統(tǒng)，利用有缺陷的小鼠B細(xì)胞，使用逆轉(zhuǎn)錄酶病毒載體表達(dá)Cas9。其中有缺陷的B細(xì)胞需要選擇缺乏AID的B細(xì)胞[7]。AID，即活化誘導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶，它是一種抗體變異蛋白，在缺乏AID小鼠的B細(xì)胞中，不能形成S區(qū)的雙鏈DNA斷裂(DSB)[8]。而CSR是須要通過DNA的切除和非同源末端連接實(shí)現(xiàn)的，而不能形成雙鏈DNA斷裂的B細(xì)胞無法實(shí)現(xiàn)非同源末端連接，也就是說缺乏AID的小鼠B細(xì)胞在自然條件下是不能完成類別轉(zhuǎn)換重組的過程，所以選擇了AID缺陷的B細(xì)胞來做。當(dāng)Guide-RNA和Cas9結(jié)合之后，Cheong等[6]觀察到一小部分B細(xì)胞從IgM轉(zhuǎn)化成IgG1，生成了免疫球蛋白重鏈的亞型，說明CRISPR-Cas9在小鼠B細(xì)胞中進(jìn)行類別轉(zhuǎn)換重組成功了。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)同樣可以在小鼠雜交瘤細(xì)胞中重復(fù)，能夠檢測(cè)到IgM+，甚至水平比普通B細(xì)胞中檢測(cè)到的CSR還要高[9]。結(jié)果是小鼠雜交瘤中分泌抗體ab片段，而不是完整的免疫球蛋白，這意味著，小鼠的免疫球蛋白基因可以通過CRISPR-Cas9進(jìn)行基因編輯得到想要的IgH亞型或者片段[10]。

3 應(yīng)用CRISPR-Cas9進(jìn)行基因編輯治療杜氏肌營養(yǎng)不良

2016年，Young等[11]應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)成功的在小鼠身上找到了治療人類杜氏肌營養(yǎng)不良的可能性。

杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)發(fā)病是由一個(gè)在人體

圖1 CRISPR-Cas9靶向敲除目的基因的基本操作步驟Fig.1 Basic operation procedure of CRISPR-Cas9 target knockout gene

內(nèi)調(diào)控肌纖維的基因突變引起的[12]。這個(gè)名為dystrophin基因的作用是幫助加強(qiáng)和連接肌肉纖維和細(xì)胞。

Young等[11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除突變基因后，母體小鼠能夠生成人類dystrophin蛋白。也就是說，可以通過CRISPR技術(shù)進(jìn)行基因編輯來逆轉(zhuǎn)蛋白的表達(dá)，而后治療杜氏肌營養(yǎng)不良患者。這個(gè)實(shí)驗(yàn)的成功進(jìn)行，表明未來人類在治療杜氏肌營養(yǎng)不良方面有所希望，可以說是應(yīng)用CRISPR技術(shù)的一個(gè)最新成果，同時(shí)也是一個(gè)很大的突破。

4 經(jīng)CRISPR-Cas9技術(shù)在母體小鼠體內(nèi)形成嵌合體

將Cas9/sgRNA作用于受精卵的標(biāo)記基因，體外發(fā)育為囊胚，注入大鼠的iPSCs，于小鼠體內(nèi)培養(yǎng)，能夠在母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)嵌合體[13]?；谶@項(xiàng)技術(shù)的實(shí)驗(yàn)，分別敲除了小鼠的Pdx1、基因、Nkx2基因、Pax6基因(控制小鼠胰腺、心臟、眼的合成)，囊胚內(nèi)注入iPSCs后，母體小鼠體內(nèi)形成的嵌合體分別檢測(cè)到有胰腺、心臟和眼的形成[14，15]。見圖2。

這項(xiàng)技術(shù)的成功應(yīng)用，表明有基因缺陷的小鼠可以通過注射iPSCs 在母體內(nèi)形成無基因缺陷的嵌合體，對(duì)于未來治療人類由基因缺失引起的失明或者心臟病提供了一個(gè)新的思路[16]。

5 CRISPR-Cas9與不同的基因編輯方法相比的優(yōu)勢(shì)和不足以及發(fā)展前景

傳統(tǒng)的基因編輯辦法包括轉(zhuǎn)錄激活因子核效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclea-ses，TALEN)、鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases，IFN)以及RNAi等[17]。

5.1RNAi的作用機(jī)制 RNAi，即RNA干擾，是指雙鏈RNA 被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生小干擾RNA(siRNA)，siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，能夠特異性降解靶RNA，以此達(dá)到抑制或下調(diào)基因的表達(dá)目的。但這種基因編輯方法的缺點(diǎn)是存在不可預(yù)知的脫靶情況[18]。

圖2 經(jīng)過體外培育的基因缺失囊胚，通過注射大鼠iPSCs，在母體內(nèi)形成無基因缺失的嵌合體Fig.2 Gene-deficient blastocyst was cultured in vitro,by injecting iPSCs of rats,forming normal chimera in mother

5.2TALEN的作用機(jī)制 TALEN的工作原理相比RNA干擾來說更加簡(jiǎn)便可行，具體來說，是結(jié)合特定的一段DNA序列，通過切割這一序列的特定位點(diǎn)來造成DNA雙鏈斷裂(DSB)。在DNA的雙鏈斷裂后，通過DNA自我修復(fù)，來完成多種基因編輯功能[19]。這種技術(shù)能夠廣泛應(yīng)用于植物、哺乳動(dòng)物、人類、大鼠等多種研究對(duì)象，甚至于在CRISPR問世前，它是最主要的編輯技術(shù)。

5.3ZFN的工作原理 ZFN與TALEN類似，仍然先對(duì)DNA雙鏈分子進(jìn)行切割，形成DSB，通過應(yīng)用細(xì)胞的自我修復(fù)機(jī)制來完成DNA的基因修復(fù)。

5.4CRISPR-Cas9的作用機(jī)制和原理 CRISPR-Cas9則是Guide-RNA和Cas蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，復(fù)合體起導(dǎo)向作用，引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在靶位點(diǎn)上剪切雙鏈脫氧核糖核酸，從而完成通過CRISPR技術(shù)對(duì) DNA 的定點(diǎn)切割。CRISPR作為一種新興的基因組編輯技術(shù)，具有效率高、性價(jià)比高、敲除效果好等優(yōu)點(diǎn)[20]。

5.5TALEN和CRISPR-Cas9的效率比較 Ding等[21]人分別利用TALEN和CRISPR-Cas9兩種方法對(duì)同一基因進(jìn)行了修飾，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明效率分別是0%～34%和51%～79%，通過這個(gè)結(jié)果，Ding等[21]人充分驗(yàn)證了CRISPR的高效性。此外從實(shí)驗(yàn)角度看來，CRISPR比TALEN更容易操作，因?yàn)槊恳粚?duì)TALEN都需要重新合成，但是CRISPR技術(shù)應(yīng)用中的Guide-RNA的設(shè)計(jì)則簡(jiǎn)便許多。

在另一個(gè)關(guān)于TALEN和CRISPR的效率比較的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果相差不多。Li等[22]人分別使用CRISPR和TALEN來修復(fù)DMD患者的肌營養(yǎng)不良基因。結(jié)果二者敲除的效率都差不多，使用T7EI酶檢測(cè)脫靶，其中CRISPR包含5個(gè)脫靶位點(diǎn)，最高包含三對(duì)錯(cuò)配。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，脫靶的效率是在可接受的范圍之內(nèi)的。

6 如何實(shí)現(xiàn)高效率的靶向敲除

CRISPR技術(shù)問世不久，就顯示出其各方面的優(yōu)點(diǎn)，比如敲除效率高、操作簡(jiǎn)便等，但同時(shí)脫靶效率很高也是CRISPR不可忽視的缺點(diǎn)，其中最為明顯的就是Cas9會(huì)在基因組的一些脫靶位點(diǎn)進(jìn)行剪切，脫靶的影響不容忽視[23]。Kuscu等[24]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，CRISPR技術(shù)脫靶位點(diǎn)的多少主要取決于gRNA，假如Cas酶失活，那么脫靶率將大大增加。Wiles等[25]則認(rèn)為CRISPR-Cas9靶向特異性是由5′端的序列以及PAM序列綜合決定的。由此推斷，sgRNA應(yīng)當(dāng)選用與基因組位點(diǎn)不同或不相似的序列。由此，Wiles等[25]人指出了一些可以與某些軟件聯(lián)合使用，來減少脫靶效應(yīng)的方法：①全基因組同源性檢索。但很多時(shí)候由于條件所限，全基因組測(cè)序存在一定的不可行性，此方法的實(shí)際操作性還有待考證。②在導(dǎo)向序列的長(zhǎng)短上進(jìn)行改進(jìn)，試著將序列長(zhǎng)度變短。③對(duì)Cas9進(jìn)行基因工程改造。

7 討論

CRISPR-Cas9能夠高效發(fā)揮識(shí)別和降解入侵的外源DNA功能[26]，同時(shí)，CRISPR-Cas9具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①構(gòu)建方便，簡(jiǎn)單快捷。②高效的介導(dǎo)基因定點(diǎn)敲入，能同時(shí)沉默任意數(shù)量基因。③前景廣闊，能應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。④價(jià)格便宜，性價(jià)比高。

眾所周知，CRISPR-Cas9目前最大的缺點(diǎn)就是嚴(yán)重的脫靶性。除此之外，Cas9酶導(dǎo)入目的基因后的殘留也是個(gè)大問題。目前并沒有有效的手段在Cas9-sgRNA奏效后去除Cas9[27]。就像人會(huì)有免疫反應(yīng)，如果在實(shí)驗(yàn)對(duì)象體內(nèi)存留時(shí)間過久，可能會(huì)出現(xiàn)不可預(yù)知的結(jié)果。另外，CRISPR敲除的效率雖然比較高，但傳代后的穩(wěn)定性卻不是很確定。CRISPR的修飾同時(shí)還受到PAM位點(diǎn)+sgRNA的限制[28]。

2017年5月，發(fā)表在Nature Methods的一篇文章，提出了CRISPR基因編輯方法的一個(gè)致命缺點(diǎn)：引起基因突變[29]，該研究成果顯示應(yīng)用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)可以對(duì)基因組引進(jìn)很多意想不到的錯(cuò)誤，數(shù)量上甚至可以達(dá)到數(shù)百個(gè)，其中包括基因組單核苷酸突變和基因組的非編碼區(qū)域突變。正如上文提及的cas9導(dǎo)入后的殘留可能是影響基因突變的一個(gè)重要原因，而在其他實(shí)驗(yàn)中沒有出現(xiàn)如此嚴(yán)重的突變情況，可能的原因之一是gRNA的設(shè)計(jì)略有偏差，造成細(xì)胞分泌過量的Cas9，以至于造成了重大脫靶效應(yīng)。此外，另一個(gè)可能的原因則是小鼠體內(nèi)的DNA本身發(fā)生的變異，并不能完全歸結(jié)到CRISPR-Cas9應(yīng)用的后果上。

這項(xiàng)研究同時(shí)也表明，一直以來所使用的普通測(cè)序可能沒有辦法發(fā)現(xiàn)一些潛在的、重要的突變。但同時(shí)，全基因組的測(cè)序過于耗時(shí)耗力，在普通的研究和實(shí)驗(yàn)中是難以實(shí)現(xiàn)的。

總的來說，CRISPR-Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用范圍是十分廣泛的，包括基因敲除、修飾、治療等。還可以在臨床上對(duì)疾病修飾和病毒修飾做出貢獻(xiàn)[30]。雖然伴隨著一些脫靶效應(yīng)的出現(xiàn)，但目前研究成果尚不完善，也許是由于小鼠體內(nèi)細(xì)胞的一些未知變化導(dǎo)致的，而這些變化或許日后可以通過修改gRNA或是使用其他品系的小鼠進(jìn)行改變。此外，這種大范圍大規(guī)模的突變也許存在很多潛在的風(fēng)險(xiǎn)，然而在沒有進(jìn)行全基因組的測(cè)序發(fā)現(xiàn)這個(gè)問題之前，我們可以大膽假設(shè)在應(yīng)用CRISPR/Cas9編輯基因后，某些點(diǎn)突變(Single-nucleotide variant)已經(jīng)存在，更加重要的是這些突變是否影響了生物體的機(jī)能。每一種新技術(shù)的產(chǎn)生和應(yīng)用都是一把雙刃劍，必然伴隨著或多或少的副作用，所以可以預(yù)測(cè)未來CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)仍然會(huì)對(duì)基因治療、人類遺傳病、腫瘤、癌癥等的治療做出非常大的貢獻(xiàn)，但在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的過程中，具體的測(cè)序方法還值得進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn)。