武璐璐 王翔鵬 張全書 朱 健 袁 林 向 陽

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，恩施445000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是以滑膜組織的過度增生、血管翳形成和骨侵蝕為病理特點的慢性自身免疫性疾病[1]。雖然RA的病因病機尚不明確，但關(guān)節(jié)滑膜是其公認(rèn)的治療靶器官，成纖維樣滑膜細(xì)胞(Fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)的異常增殖和凋亡不足在RA發(fā)病中起關(guān)鍵作用[2,3]。當(dāng)今世界新藥已從化合物合成轉(zhuǎn)向天然藥物開發(fā)，以雷公藤、白芍總苷為代表的抗風(fēng)濕中草藥研究已取得了較好的成果[4-6]。我國幅員遼闊、資源豐富，不同地區(qū)、不同民族在與風(fēng)濕病做斗爭的過程中，在中草藥應(yīng)用上積累了豐富的經(jīng)驗。湖北楓楊(Pterocarya Hupehensis Skan)作為土家藥在恩施地區(qū)常用于治療風(fēng)濕筋骨疼痛[7]。在本實驗中，我們選取湖北楓楊作為研究對象，用不同濃度的湖北楓楊各提取物作用于體外培養(yǎng)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞MH7A，觀察其對MH7A細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并對其誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞凋亡的可能機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞株MH7A，購自Biovector NTCC公司。

1.1.2藥品與主要試劑 湖北楓楊由我院中草藥標(biāo)本中心集中采購，經(jīng)袁林副教授鑒定為胡桃科(Juglandaceae)湖北楓楊屬(Pterocarya Kunth)植物的干燥莖皮；無水乙醇、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇(上海滬試國藥集團股份有限公司)；二甲基亞砜(美國Sigma公司)；胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗(美國 Gibco 公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；CCK-8試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；Annexin V/FITC 細(xì)胞凋亡試劑盒(美國BD公司)；Caspase-3、Caspase-9的酶活性檢測試劑盒(美國Biovision公司)；Trizol提取試劑盒(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Scientific公司)；實時熒光定量PCR相關(guān)試劑盒(日本TaKaRa公司)；擴增引物(上海生物工程股份有限公司)；Cyt-C、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、Bcl-2、BAX抗體(美國 Abcam 公司)；β-Actin抗體、HRP羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司)等。

1.2方法

1.2.1湖北楓楊各提取物的制備 取湖北楓楊干燥莖皮1 kg，粉碎，加75% 的乙醇10 L，置于超聲儀中萃取3次。將3次的萃取液合并、過濾、離心去渣、濃縮，得乙醇提取液。取100 ml備用，將剩余的乙醇提取液依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，分別合并得各提取液，濃縮。將上述5類提取液分別真空冷凍干燥，最終得到湖北楓楊各提取物的干燥固體。取乙醇、乙酸乙酯、正丁醇提取物各1 g，加適量的PBS水溶解，取石油醚、氯仿提取物各1 g，加適量的DMSO溶解；然后用 0.22 μm 的無菌濾器過濾，密封后置于4℃冰箱。用時取出，加適量DMEM培養(yǎng)基(不含血清和雙抗)，配成所需濃度，其中終濃度的DMSO含量低于1‰。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 將MH7A細(xì)胞接種于含10% 胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于5%CO2、100% 濕度、37℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞融合到70%～80%時用PBS洗2次，用含0.25% 胰蛋白酶和0.02% EDTA 的消化液消化，含血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化后按1∶2 傳代，進行實驗。

1.2.3CCK-8檢測細(xì)胞增殖率 取對數(shù)生長期的MH7A細(xì)胞制成5×104個/ml的單細(xì)胞懸液，每孔100 μl接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁生長12 h后，將原有培養(yǎng)基更換為含湖北楓楊不同提取物的培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為5組，分別為湖北楓楊乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物組，每組的終濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50、100、250、500、1 000、2 500和5 000 μg/ml。同時設(shè)置陰性對照組(有細(xì)胞、培養(yǎng)基，無湖北楓楊提取物)和空白對照組(僅有培養(yǎng)基)。分別培養(yǎng)6、12、24 h后，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm時的吸光度值，計算細(xì)胞增殖率。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期的MH7A細(xì)胞制成5×105個/ml的細(xì)胞懸液，每孔2 ml 接種于6孔板。待細(xì)胞貼壁生長12 h后，將原有培養(yǎng)基更換為含湖北楓楊乙醇提取物的培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為陰性對照組(無湖北楓楊乙醇提取物)、不同劑量藥物組(湖北楓楊乙醇提取物終濃度分別為25、50和100 μg/ml)，培養(yǎng)24 h后，消化、離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個/ml，用4℃ 的PBS洗2次，1×Buffer重懸細(xì)胞，取100 μl細(xì)胞懸液于流式管中，依次加入FITC標(biāo)記的 Annexin-V和PI各5 μl混勻后避光孵育15 min，再加入400 μl的1×Buffer終止孵育，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，F(xiàn)lowjo 軟件分析數(shù)據(jù)。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.5Caspase-3、Caspase-9酶活性檢測 分別用終濃度為25、50和100 μg/ml的湖北楓楊乙醇提取物作用于生長融合到80% 的MH7A細(xì)胞24 h，同時設(shè)置陰性對照組(無湖北楓楊乙醇提取物)，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌后加入相應(yīng)體積4℃ Lysis buffer于冰上裂解10 min，離心收集上清即得含裂解液的蛋白質(zhì)。Bradford法測定蛋白濃度。各組取150 μg蛋白，用相應(yīng)Lysis buffer稀釋至50 μg，分別加入對應(yīng)的2×reaction buffer 50 μl(內(nèi)含0.5 μl DTT)和5 μl 的Caspase-3或Caspase-9反應(yīng)底物，37℃ 恒溫箱避光孵育2 h。酶標(biāo)儀測量405 nm時的吸光度值，計算Caspase-3和Caspase-9酶活性。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.6Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 分別用終濃度為25、50和100 μg/ml的湖北楓楊乙醇提取物作用于生長融合到80%的MH7A細(xì)胞24 h，同時設(shè)置陰性對照組(無湖北楓楊乙醇提取物)，提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測蛋白濃度后平衡各組蛋白濃度，加入相應(yīng)體積SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)，100℃ 煮沸10 min。各組取15 μl混勻液進行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂牛奶室溫水平搖床上封閉1 h，TBST洗膜3次,每次5 min，分別加相應(yīng)一抗Cyt-C(1∶1 000)、Cleaved Caspase-3(1∶800)、Cleaved Caspase-9(1∶800)、Bcl-2(1∶1 000)和BAX(1∶1 000)，4℃ 孵育過夜，洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶10 000)，室溫水平搖床上孵育2 h。洗膜后加入ECL發(fā)光劑，用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以內(nèi)參β-acting作對照，計算各組目的蛋白的相對表達(dá)量。實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.7實時熒光定量 PCR 檢測相關(guān)蛋白mRNA表達(dá) 分別用終濃度為25、50和100 μg/ml的湖北楓楊乙醇提取物作用于生長融合到80% 的MH7A細(xì)胞24 h，同時設(shè)置陰性對照組(無湖北楓楊乙醇提取物)，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測RNA濃度和純度后按照試劑盒說明步驟將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。選用10 μl的實時熒光定量PCR反應(yīng)體系(熒光染料5 μl，上、下游引物各0.4 μl，去離子水3.2 μl，cDNA 1 μl)。反應(yīng)條件為：95℃ 15 s，58℃1 min，重復(fù)40個循環(huán)。分析以GAPDH的表達(dá)量為參照，采用公式2-ΔΔCt計算基因表達(dá)的相對倍數(shù)變化。實驗獨立重復(fù)3次。引物序列見表1。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)進行方差齊性和正態(tài)性檢驗，兩組數(shù)據(jù)間比較

采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05或P<0.01時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1湖北楓楊各提取物對MH7A細(xì)胞增殖的影響 如圖1所示，與陰性對照組相比，各濃度的湖北楓楊石油醚、正丁醇提取物在6、12和24 h對MH7A細(xì)胞增殖均無明顯的抑制作用。氯仿、乙酸乙酯提取物分別從500 μg/ml和1 mg/ml起在6、12和 24 h 對MH7A細(xì)胞增殖有抑制作用(P<0.05或P<0.01)；3.125、6.25和12.5 μg/ml 的乙醇提取物在6 h時對MH7A細(xì)胞增殖無明顯抑制作用，但在12 h 和24 h時對其增殖有抑制作用，其余各濃度乙醇提取物在6、12和24 h對MH7A細(xì)胞增殖均有抑制作用(P<0.05或P<0.01)，隨時間延長而增加，但無劑量依賴關(guān)系。當(dāng)濃度為25、50和100 μg/ml時MH7A增殖率有明顯改變，且隨著藥物濃度的增加細(xì)胞增殖率逐漸下降，100 μg/ml時對其增殖抑制作用最強(P<0.05)， 此后藥物濃度增加， 對其增殖抑制作用反下降?；诒緦嶒灪罄m(xù)選擇濃度為25、50和100 μg/ml的乙醇提取物干預(yù)MH7A細(xì)胞24 h來進行相關(guān)實驗。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

圖1 湖北楓楊不同提取物對MH7A細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of Pterocarya Hupehensis Skan different extracts on proliferation of MH7A cellsNote: At the same time，each drug group was compared with the negative control group,*.P<0.05，* *.P<0.01;compared with the 50 μg/ml concentration group，#.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，△.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，▲.P<0.05.

2.2湖北楓楊乙醇提取物對MH7A細(xì)胞凋亡的影響 如圖2所示，正常生長的MH7A細(xì)胞凋亡不明顯(凋亡率<5%)，用25、50和100 μg/ml的湖北楓楊乙醇提取物干預(yù)后，MH7A出現(xiàn)明顯的凋亡(P<0.01)，凋亡率隨藥物濃度的增加而升高(P<0.05)。

2.3湖北楓楊乙醇提取物對Caspase-3和Caspase-9酶活性的影響 如圖3所示，用25、50和100 μg/ml的湖北楓楊乙醇提取物干預(yù)后，各濃度作用組MH7A細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9酶活性均高于陰性對照組(P<0.05)，其中100 μg/ml濃度作用組細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-9酶活性最高(P<0.05)。

圖2 湖北楓楊乙醇提取物對MH7A細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Pterocarya Hupehensis Skan ethanol extract on apoptosis of MH7A cellsNote: At the same time，each drug group was compared with the negative control group，* *.P<0.01;compared with the 50 μg/ml concentration group，#.P<0.05;compared with 25 μg/ml conce-ntration group，△.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，▲.P<0.05.

圖3 湖北楓楊乙醇提取物對Caspase-3和Caspase-9酶活性的影響Fig.3 Effect of Pterocarya Hupehensis Skan ethanol extract on enzyme activity of Caspase-3 and Caspase-9Note: At the same time，each drug group was compared with the negative control group，*.P<0.05，* *.P<0.01;compared with the 50 μg/ml concentration group，#.P<0.05.

2.4湖北楓楊乙醇提取物對MH7A細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響 如圖4所示，與陰性對照組相比，25 μg/ml湖北楓楊乙醇提取物作用組MH7A細(xì)胞內(nèi)Cyt-C蛋白相對表達(dá)量增加不明顯，其余各濃度作用組細(xì)胞內(nèi)Cyt-C蛋白相對表達(dá)量增加(P<0.05)；各濃度作用組細(xì)胞內(nèi)Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和BAX蛋白相對表達(dá)量均明顯增加(P<0.05或P<0.01)；各濃度作用組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白相對表達(dá)量均降低(P<0.01)。

圖4 湖北楓楊乙醇提取物對MH7A細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Pterocarya Hupehensis Skan ethanol extract on protein expression related to apoptosis of MH7A cellNote: At the same time，each drug group was compared with the negative control group，*.P<0.05，* *.P<0.01;compared with the 50 μg/ml concentration group，#.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，△.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，▲.P<0.05.

圖5 湖北楓楊乙醇提取物對MH7A細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Pterocarya Hupehensis Skan ethanol extract on expression of mRNA related to apoptotic protein of MH7A cellsNote: At the same time，each drug group was compared with the negative control group，*.P<0.05，* *.P<0.01;compared with the 50 μg/ml concentration group，#.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration group，△.P<0.05;compared with 25 μg/ml concentration groupd，▲.P<0.05.

2.5湖北楓楊乙醇提取物對MH7A細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達(dá)的影響 如圖5所示，與陰性對照組相比，25 μg/ml湖北楓楊乙醇提取物作用組MH7A細(xì)胞內(nèi)P53、BAX和BAK的mRNA表達(dá)增加不明顯，其余各濃度作用組細(xì)胞內(nèi)P53、BAX和BAK的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05或P<0.01)；各濃度作用組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bcl-xL的mRNA表達(dá)降低(P<0.01)。

3 討論

在本試驗中用湖北楓楊不同部位提取物分別作用于體外培養(yǎng)的MH7A細(xì)胞，通過CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)湖北楓楊抑制MH7A細(xì)胞增殖的活性部位是乙醇、氯仿和乙酸乙酯提取部，其中乙醇部位提取物對MH7A細(xì)胞增殖抑制作用最強，并可有效誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是由病理學(xué)家Kerr 等[8]提出的一個不同于壞死的細(xì)胞死亡新概念，它是一個主動、高度有序、由特定基因調(diào)控以及一系列特異性酶參與的過程。其形態(tài)學(xué)改變表現(xiàn)為：胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)凝縮，細(xì)胞膜內(nèi)陷，凋亡小體形成等[9,10]。線粒體作為真核生物能量和代謝的中心，亦是調(diào)控細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器，線粒體凋亡通路是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一[11]。

線粒體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑中最關(guān)鍵的步驟是Cyt-C從線粒體內(nèi)的釋放。釋放的Cyt-C進入胞漿后與細(xì)胞內(nèi)存在的一種凋亡細(xì)胞蛋白酶激活因子(Apaf-1)結(jié)合，在dATP或ATP存在的條件下，使Caspase-9發(fā)生剪切活化[12]。位于Caspase級聯(lián)反應(yīng)上游的Caspase-9是線粒體凋亡途徑中最重要的啟動子，正常情況下以無活性酶原形式存在于細(xì)胞中，當(dāng)受到凋亡信號刺激后可經(jīng)蛋白酶水解成大、小亞單位，與Cyt-C和Apaf-1等形成凋亡復(fù)合體，進而激活Caspase-3等下游的凋亡執(zhí)行子，從而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[13]。其中Caspase-3作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，亦是多種凋亡途徑傳導(dǎo)的匯聚點，它的活化標(biāo)志著凋亡進入不可逆階段[14]。用湖北楓楊乙醇提取物作用MH7A細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9酶活性及活化的Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)增加，說明湖北楓楊乙醇提取物可通過增加Cyt-C的釋放，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)來誘導(dǎo)MH7A凋亡。Bcl-2家族是作用于線粒體的另一類細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，線粒體是其調(diào)控內(nèi)在凋亡途徑的靶點[15]。Bcl-2家族包括抗凋亡成員(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w和Al/Bfl-1等)和促凋亡成員(BAX、Bad、BAK、Bid和Bim/Bod等)[16,17]。湖北楓楊乙醇提取物作用于MH7A細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)BAX的蛋白表達(dá)及BAX和BAK的mRNA表達(dá)增加，Bcl-2的蛋白表達(dá)及Bcl-2和Bcl-xL的mRNA表達(dá)降低，促凋亡和抑凋亡蛋白的比率升高。Bcl-2家族中促凋亡和抑凋亡蛋白的比率可協(xié)調(diào)線粒體內(nèi)、外膜的滲透性，當(dāng)促凋亡和抑凋亡蛋白的比率升高時可使線粒體外膜通透性增加，引起Cyt-C等膜間隙蛋白釋放，激活下游Caspases級聯(lián)反應(yīng)，啟動凋亡[18,19]。

此外，我們還發(fā)現(xiàn)湖北楓楊乙醇提取物可增加腫瘤抑制蛋白P53的mRNA表達(dá)。P53一方面可通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白促進線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，造成Cyt-C的釋放，進一步激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡[20-22]；另一方面，P53可直接激活BAK、上調(diào)BAX而誘導(dǎo)Cyt-C的釋放，或與親環(huán)素CyclophilinD結(jié)合，開放線粒體膜通道孔，進而誘導(dǎo)凋亡[23-25]。

因此，推測湖北楓楊乙醇提取物誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞凋亡的可能機制是通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Cyt-C、Caspase-9、Caspase-3、BAX、BAK、Bcl-2、Bcl-xL 和P53的表達(dá)，從而激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞凋亡，為利用和開發(fā)湖北楓楊治療RA提供實驗和理論基礎(chǔ)，使之能更好地服務(wù)臨床，造?；颊?。而湖北楓楊乙醇提取物是如何具體影響線粒體途徑的傳導(dǎo)機制，以及是否還通過其他途徑達(dá)到誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞凋亡，抑制其增殖的目的，我們將在后續(xù)的試驗中進行研究和探索。