楊 偉 王燕瓊 李媛華 邵建林 白向峰

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科，昆明620032)

急性心肌梗死(Acute myocardiol infarction，AMI)是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血、缺氧引起的心肌壞死，臨床表現(xiàn)為劇烈、持久的胸骨后疼痛，且患者休息并給予硝酸甘油類藥物難以完全緩解，部分患者可伴有心肌酶活性增高及進(jìn)行性心電圖變化，嚴(yán)重者將會(huì)引起心律失常、休克或心力衰竭[1]。溶栓和經(jīng)皮冠脈介入是治療AMI主要方法，能降低患者病死率。但是，其所致的再灌注損傷影響預(yù)后，且患者治療后心力衰竭發(fā)病率在45%以上。缺血再灌注損傷則是指機(jī)體遭受一段時(shí)間缺血的組織恢復(fù)灌注后，缺血組織損傷程度不但沒(méi)有減輕反而急速加劇，常見(jiàn)誘因包括：血管內(nèi)皮功能障礙、心肌細(xì)胞凋亡、收縮功能障礙及再灌注心律失常等，影響患者心臟功能[2]。

microRNA是一類由20～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的高度保守的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，在高等生命中發(fā)揮了重要作用，能直接參與生物細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、免疫等[3，4]。通過(guò)前期基因預(yù)測(cè)軟件分析看出：mir-499可能參與心肌缺血再灌注損傷發(fā)生、發(fā)展。mir-499具有心肌細(xì)胞特異性，僅在心肌細(xì)胞表達(dá)，在心肌肥厚、心力衰竭、心臟電生理傳導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用。國(guó)外學(xué)者實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[5]：在心肌缺血再灌注損傷中，再灌注24 h內(nèi)可在梗死周邊檢測(cè)到T細(xì)胞，且在隨后的3～7 d持續(xù)性增加。由此看出：T淋巴細(xì)胞能在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，但是與microRNA的關(guān)系缺乏研究。因此，本課題以2016年12月～2018年2月在我院進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的SD大鼠60只為研究對(duì)象，探討心肌缺血再灌注損傷對(duì)mir-499水平表達(dá)及免疫學(xué)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 選擇2016年12月～2018年2月在我院進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的SD大鼠60只，隨機(jī)選取大鼠20只設(shè)為空白對(duì)照組。剩余40只SD大鼠建立心肌缺血再灌注損傷模型，建模成功后隨機(jī)分為缺血后處理組(n=20)和心肌缺血再灌注損傷組(n=20)。60只SD大鼠，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量220～270 g，平均(190.35±0.83)g，所選動(dòng)物均由醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食，試驗(yàn)均通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.1.2主要儀器和試劑 研究所需儀器與試劑包括：DAB Kit酶底物顯色試劑盒、白洋 G16 型臺(tái)式高速離心肌、中性樹膠、石蠟切片機(jī)(LEICA-RM2235型)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(HH.BII 型)、光學(xué)顯微鏡及Msho數(shù)字成像系統(tǒng)、mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、引物設(shè)計(jì)合成、PVDF膜及PCR等，其廠家見(jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1心肌缺血再灌注損傷模型的建立 60只SD大鼠隨機(jī)取20只設(shè)為空白對(duì)照組，其余40只SD大鼠參與心肌缺血再灌注損傷模型建立，建模方法如下：采用改良?jí)|扎球囊法完成SD大鼠動(dòng)物模型建立。取參與建模的SD大鼠，采用0.35 mg/g濃度3.5%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉，待麻醉生效后進(jìn)行常規(guī)消毒、鋪巾。取仰臥位姿勢(shì)，經(jīng)氣管插管后連接動(dòng)物呼吸機(jī)，設(shè)定相關(guān)參數(shù)：潮氣量2～3 ml/100 g，頻率為80次/min，呼吸比為1∶1，連接Ⅱ?qū)?lián)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠心電圖。上述操作步驟完成后幫助SD大鼠快速開胸，將心包膜撕開后在左側(cè)心耳下緣、肺動(dòng)脈圓錐部位采用6-0可吸收縫合線經(jīng)過(guò)左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支深部完成心大靜脈、 注水球囊結(jié)扎。 將結(jié)扎線收緊，使得球囊壓迫左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支，建立缺血模型。結(jié)扎完畢后缺血部位呈淺紅色，室壁運(yùn)動(dòng)減弱，導(dǎo)致心電圖下ST段升高。缺血30 min后迅速將球囊中水吸除，解除血管壓迫，對(duì)于缺血部位發(fā)紺消失、心電圖下ST段恢復(fù)正?；蛳陆?0.0%以上視為動(dòng)物建模成功。心肌缺血再灌注損傷組建模后不采取任何措施處理干預(yù)；缺血后處理組建模成功后再進(jìn)行30 s灌注、30 s缺血，連續(xù)進(jìn)行3次處理[6，7]。

表1 主要儀器和試劑

1.2.2心功能測(cè)定 采用經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖對(duì)三組大鼠心臟功能進(jìn)行評(píng)估，測(cè)量：左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)及左室短軸縮短率(LVFS)[8，9]。

1.2.3mir-499水平測(cè)定 ①組織中RNA的提取。三組大鼠建模、干預(yù)后以斷頸方式處死大鼠，去心肌部位組織，經(jīng)過(guò)PBS沖洗后加入500 μl Trizol吹打，使得組織充分溶解，加入500 μl Trizol充分混合、均勻。將上述溶液放入常溫下5 min，溶解蛋白體，加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩15 s，常溫下放置2～3 min，12 000 r/min離心15 min，獲得三層液體(上層為水相、中間層與下層為有機(jī)相)。取RNA沉淀，轉(zhuǎn)移到新的EP管中，加入0.5 ml異丙醇，充分混合后放置在-20℃冰箱中，12 000 r/min離心10 min，可見(jiàn)凝膠狀沉淀(即為RNA)。充分洗滌RNA，并加入250 μl DEPC與750 μl乙醇，利用乙醇完成沉淀的沖洗，7 400 r/min離心5 min，取沉淀放入工作臺(tái)上干燥20 min。利用紫外分光度儀檢測(cè)RNA濃度并完成RNA提純(以Rnase作為空白對(duì)照)，在A260下測(cè)定吸光度值。采用Dnase酶處理RNA，處理完畢后放入冰箱中，備用。②逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(完成cDNA的合成)。取獲得的RNA 1 μg、OligodT 1 μl，加水保證總體積為12 μl，充分混合后5 min水浴，冰上靜置1 min，加入5 μl緩沖液、1 μl Rninhib-itor及2 μl dNTP，保證總體溶液體積為12 μl，10 min 水浴，溫度設(shè)定為42℃，反應(yīng)完畢后放置在-20℃冰箱中備用。③PCR反應(yīng)。mir-499引物上游設(shè)定為：5′-GCCAGTTGTTTTTCTGATTTGTGGGCC-3′,下游引物設(shè)定為：5′-GCCAGTTGTTTTTCTG-CCAC-3′，為403 bp，hGAP-DH引物上游：5′-GGCTCTCCAGAACATCAT-3′，下游：5′-CACCTGGTGCTCAGTGTA-3′，為240 bp。根據(jù)每一例標(biāo)本情況設(shè)定反應(yīng)條件：94℃下進(jìn)行5 min變性，94℃下30 s、55℃下30 s、72℃ 1 min，連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃下完成10 min延長(zhǎng)。取hGAPDH為內(nèi)參，選擇獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物，放入1.5%瓊脂凝膠進(jìn)行電泳，完畢后采用UVP凝膠圖像完成灰度值的測(cè)定[10，11]。

1.2.4細(xì)胞免疫學(xué)水平測(cè)定 三組大鼠處理后7 d空腹?fàn)顟B(tài)下經(jīng)尾部取靜脈血3 ml，5 000 r/min離心15 min，完成血清分離后放置在-20℃冰箱中，備用。采用流式細(xì)胞儀測(cè)定三組CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平，有關(guān)操作嚴(yán)格遵循儀器操作說(shuō)明書完成[12，13]。

1.2.5相關(guān)性 采用SPSS Pearson相關(guān)性分析軟件對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠mir-499水平與T淋巴細(xì)胞水平進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1三組心功能水平比較 見(jiàn)表2。三組手術(shù)前LVEDV、LVESV、LVEF及LVFS水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；缺血后處理組、空白對(duì)照組LVEDV水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；缺血后處理組灌注后LVESV水平，低于心肌缺血再灌注組(P<0.05)；缺血后處理組灌注后LVEF及LVFS水平，均高于心肌缺血再灌注組(P<0.05)。

表2 三組心功能水平比較

Note：Vs myocardial ischemia-reperfusion injury group，1)P<0.05；vs blank control group,2)P<0.05.

表3 三組mir-499表達(dá)比較

Note：Vs myocardial ischemia-reperfusion injury group，1)P<0.05；vs blank control group，2)P<0.05.

表4 心肌缺血再灌注損傷mir-499水平與免疫學(xué)指標(biāo)相關(guān)性(r，P)

表5 三組大鼠細(xì)胞免疫學(xué)水平比較

Note：Vs myocardial ischemia-reperfusion injury group,1)P<0.05；vs blank control group,2)P<0.05.

2.2三組mir-499水平比較 見(jiàn)表3。缺血后處理組mir-499水平高于心肌缺血再灌注損傷組和空白對(duì)照組(P<0.05)；心肌缺血再灌注損傷組mir-499水平低于空白對(duì)照組(P<0.05)。

2.3心肌缺血再灌注損傷mir-499水平與免疫學(xué)指標(biāo)相關(guān)性 見(jiàn)表4。SPSS Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明：心肌缺血再灌注損傷mir-499水平與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與CD8+水平呈正相關(guān)性(P<0.05)。

2.4三組大鼠細(xì)胞免疫學(xué)水平比較 見(jiàn)表5。缺血后處理組、心肌缺血再灌注損傷組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，均高于空白對(duì)照組(P<0.05)；缺血后處理組、心肌缺血再灌注損傷組CD8+水平，均低于空白對(duì)照組(P<0.05)；缺血后處理組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注損傷組(P<0.05)；缺血后處理組CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注損傷組(P<0.05)。

3 討論

AMI是在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)上并發(fā)粥樣塊破裂、出血，血管腔內(nèi)血栓形成，從而引起血管發(fā)生急性閉塞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞進(jìn)行性壞死[14,15]。目前，對(duì)于AMI以溶栓、經(jīng)皮冠脈介入治療為主，雖然改善冠狀動(dòng)脈，促進(jìn)血流恢復(fù)，降低臨床死亡率，但是臨床上不宜忽視由缺血引起的再灌注損傷[16]。從大的角度來(lái)說(shuō)，缺血再灌注損傷是指機(jī)體遭受一段時(shí)間缺血組織恢復(fù)灌注后，缺血的組織損傷程度不但沒(méi)有得到緩解，反而急速加劇，能引起血管內(nèi)皮功能障礙、收縮功能障礙[17,18]。但是，缺血再灌注損傷過(guò)程中對(duì)于組織造成損傷的并不是缺血本身，而是恢復(fù)灌注后大量鈣離子內(nèi)流及過(guò)量的活性氧自由基產(chǎn)生，從而引起組織細(xì)胞凋亡。心肌梗死區(qū)域存在凋亡、壞死兩種細(xì)胞死亡形式，且多以凋亡為主(占80.0%以上)，而壞死僅占20.0%，并且多數(shù)由凋亡轉(zhuǎn)化而來(lái)。本研究中，缺血后處理組灌注后LVESV水平，低于心肌缺血再灌注組(P<0.05)；缺血后處理組灌注后LVEF及LVFS水平，均高于心肌缺血再灌注組(P<0.05)。由此看出：心肌缺血再灌注后心功能水平會(huì)發(fā)生明顯的改變，但是經(jīng)缺血再灌注后則能減輕心肌功能變化。由于缺血后處理組灌注后組織損傷并未得到緩解與改善，反而出現(xiàn)加重趨勢(shì)，導(dǎo)致心功能水平進(jìn)一步降低。但是，經(jīng)過(guò)缺血后處理后機(jī)體心功能將會(huì)得到提高[19,20]。

microRNA是一種高度保守的內(nèi)緣性小分子單鏈、非編碼的RNA，能通過(guò)靶mRNA特異性序列互補(bǔ)配對(duì)相互結(jié)合，從而能抑制靶基因的生成。同時(shí)，microRNA產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后能實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的調(diào)控[21,22]。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明：miRNA參與心肌缺血再灌注損傷，并且在IPC、IPO介導(dǎo)的心肌缺血損傷的保護(hù)中發(fā)揮作用[23]。mir-499是myomiRs家族一員，多表達(dá)于心肌、骨骼肌慢肌纖維組織中，而在其他組織中表達(dá)量相對(duì)較少，在人體心肌細(xì)胞分化、再生中均發(fā)揮了重要的作用[24,25]。生理?xiàng)l件下，內(nèi)源性miRNA的表達(dá)能維持在一個(gè)恒定的水平，但是當(dāng)受到病理或生理刺激時(shí)其表達(dá)水平能發(fā)生變化。本研究中，缺血后處理組mir-499水平高于心肌缺血再灌注損傷組和空白對(duì)照組(P<0.05)；心肌缺血再灌注損傷組mir-499水平低于空白對(duì)照組(P<0.05)。由此看出：mir-499水平在心肌缺血再灌注損傷患者中呈高表達(dá)，能參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展，能抑制PDCD4表達(dá)水平減少心肌細(xì)胞的凋亡，從而能改善缺血再灌注損傷大鼠心臟功能。

積極采取有效的措施防治心肌缺血再灌注損傷是提高心臟手術(shù)成功率，促進(jìn)患者術(shù)后恢復(fù)的關(guān)鍵[26]。國(guó)外學(xué)者研究表明[27,28]：免疫、炎癥反應(yīng)是心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。中性粒細(xì)胞是缺血再灌注損傷的主要炎癥細(xì)胞，但是最新研究表明CD3+、CD4+細(xì)胞在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮效應(yīng)，盡早采取有效的措施抑制CD3+、CD4+細(xì)胞聚集能實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)。本研究中，缺血后處理組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注損傷組(P<0.05)；缺血后處理組CD8+水平，均低于心肌缺血再灌注損傷組(P<0.05)。由此看出：心肌缺血再灌注損傷加速了CD3+、CD4+細(xì)胞的聚集。國(guó)內(nèi)學(xué)者研究表明[29]：缺血再灌注損傷整個(gè)過(guò)程中對(duì)于組織產(chǎn)生的損傷不是缺血本身，而是灌注過(guò)程中產(chǎn)生的大量鈣離子內(nèi)流及氧自由基的大量產(chǎn)生。為了驗(yàn)證心肌缺血再灌注損傷后處理方法，本研究中設(shè)立心肌缺血處理組，在大鼠心肌缺血后予以短暫的再灌注缺血循環(huán)，然后恢復(fù)灌注，結(jié)果表明：該后處理方法能縮小心肌梗死面積，實(shí)現(xiàn)心肌的保護(hù)，減輕缺血再灌注損傷，能為心肌缺血再灌注損傷治療提供方法和思路。本研究中，SPSS Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明：心肌缺血再灌注損傷mir-499水平與CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05)，與CD8+水平呈正相關(guān)性(P<0.05)。因此，心肌缺血再灌注損傷治療過(guò)程中可以加強(qiáng)免疫細(xì)胞水平，評(píng)估治療預(yù)后，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果調(diào)整治療方案，降低死亡率[30]。

綜上所述，心肌缺血再灌注損傷會(huì)引起mir-499表達(dá)降低，經(jīng)缺血處理后mir-499水平得到提高，有助于改善大鼠心臟功能，且與免疫學(xué)水平具有一定的相關(guān)性。