李 飛 周 靜 孫紅梅 趙 莉 張 鵬 高 峰

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科,延安716000)

缺氧缺血心臟疾病已經(jīng)成為威脅人類生命健康的主要因素之一，其主要是由動(dòng)脈狹窄、動(dòng)脈阻塞等引起的，其發(fā)病機(jī)制與心肌細(xì)胞氧化損傷有關(guān)。在缺氧缺血心臟疾病發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量的氧自由基，同時(shí)細(xì)胞中抗氧化酶活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，引起細(xì)胞膜通透性的改變，引起細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的破壞，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[1-3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor-4，TLR4)作為一種模式識(shí)別受體，其與配體結(jié)合以后可以激活下游信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)特性，其在淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞等幾乎所有細(xì)胞中都有表達(dá)，參與過敏性疾病、心血管系統(tǒng)等疾病的發(fā)生[4]。有研究表明，TLR4參與缺氧缺血心臟疾病的發(fā)生，在缺氧缺血心肌組織中表達(dá)異常升高[5,6]。本實(shí)驗(yàn)用心肌H9C2細(xì)胞作為體外研究對(duì)象，通過用H2O2處理構(gòu)建心肌H9C2細(xì)胞氧化損傷模型，通過慢病毒感染沉默心肌H9C2細(xì)胞中TLR4的表達(dá)，探討TLR4對(duì)氧化應(yīng)激條件下的心肌H9C2細(xì)胞凋亡、氧化損傷及炎癥因子釋放水平的影響，以期為明確TLR4在缺氧缺血心臟疾病中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 綠色熒光蛋白和嘌呤霉素標(biāo)記的siRNA 陰性對(duì)照慢病毒、TLR4 siRNA慢病毒由上海吉?jiǎng)P合成，TLR4 siRNA 序列為：CCCTCCATAGACTTCAATTAT；丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量測(cè)定試劑盒、IL-6含量測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶 (Superoxide orgotein dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒為碧云天產(chǎn)品；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量測(cè)定試劑盒、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)含量測(cè)定試劑盒，活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量測(cè)定試劑盒為南京建成生物研究所產(chǎn)品；剪切型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體、TLR4抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞分組處理 心肌H9C2細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，培養(yǎng)液中含有100 U/ml的青霉素及100 μg/ml的鏈霉素，細(xì)胞放在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。心肌H9C2細(xì)胞用含有200 μmol/L 的H2O2溶液培養(yǎng)12 h作為H2O2組，同時(shí)將TLR4 siRNA慢病毒感染后的心肌H9C2細(xì)胞以200 μmol/L的H2O2溶液培養(yǎng)12 h作為si-TLR4組，把siRNA 陰性對(duì)照慢病毒感染后的心肌H9C2細(xì)胞以200 μmol/L的H2O2溶液培養(yǎng)12 h作為si-NC組，把未經(jīng)處理的正常培養(yǎng)的心肌H9C2細(xì)胞作為Control組。慢病毒感染方法如下：心肌H9C2細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每個(gè)孔中加入105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞融合度為60%時(shí)，分別用siRNA 陰性對(duì)照慢病毒、TLR4 siRNA慢病毒以MOI=60感染細(xì)胞，24 h以后，換液，用嘌呤霉素篩選沉默TLR4的細(xì)胞株，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞感染效率超過85%。

1.2.2qRT-PCR檢測(cè)TLR4在H2O2處理以后的心肌H9C2細(xì)胞中的表達(dá) 取H2O2組、Control組心肌H9C2細(xì)胞，按照上述方法處理以后，用PBS將各組細(xì)胞洗滌2次。加入Trizol提取細(xì)胞中的總RNA。用DEPC水將RNA溶解以后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃ 10 min。取各組cDNA，進(jìn)行qRT-PCR，PCR程序?yàn)椋?5℃，15 s；60℃，60 s；共40個(gè)循環(huán)，以β-actin作為內(nèi)參。引物序列如下：TLR4上游5′-ACCTGTCCCTGAACCC-TATGAA-3′，下游5′-CTTCTAAACCAGCCAGACC-TTG-3′。β-actin上游5′-ACCACAGTCCATGCCAT-CAC-3′，下游5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。

1.2.3Western blot檢測(cè)TLR4在H2O2處理以后的心肌H9C2細(xì)胞中的表達(dá) 取H2O2組、Control組心肌H9C2細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白，保存在-80℃。蛋白樣品用BCA法測(cè)定濃度。蛋白電泳：10%分離膠、5%積層膠，蛋白樣品同等體積的2×Loading Buffer混勻，放置在100℃反應(yīng)5 min，每個(gè)泳道中添加40 μg蛋白樣品，電壓為90 V，電泳約2.5～3 h，直到溴酚藍(lán)到達(dá)底部邊緣1 cm后，停止電泳。將蛋白凝膠取出以后，調(diào)整200 mA電流進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，時(shí)間約為80 min。取出NC膜，用5%牛血清白蛋白置于室溫條件下孵育1.5 h。再將膜置于含有1∶800 稀釋的TLR4一抗、1∶1 000稀釋的β-actin一抗中，置于4℃搖晃過夜。NC膜再與1∶3 000稀釋的二抗在室溫?fù)u晃孵育2 h以后，ECL發(fā)光。以Quantity One軟件分析各個(gè)條帶灰度值，用目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值記為目的蛋白表達(dá)水平。

1.2.4qRT-PCR和Western blot檢測(cè)慢病毒感染后心肌H9C2細(xì)胞中TLR4表達(dá) 取H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細(xì)胞，依照上述方法處理以后，用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)細(xì)胞中TLR4表達(dá)水平，檢測(cè)慢病毒對(duì)H2O2處理以后心肌H9C2細(xì)胞中TLR4沉默效果。步驟同1.2.2和1.2.3。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)心肌H9C2細(xì)胞凋亡 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細(xì)胞按照上述方法處理以后，收集細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗滌2次以后，在細(xì)胞沉淀中加入400 μl的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μl碘化丙啶(Propidium iodide，PI)、5 μl膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)，將細(xì)胞置于避光中反應(yīng)20 min，再添加100 μl緩沖液，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細(xì)胞按照上述方法處理以后，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平，步驟同1.2.3。

1.2.7MDA、SOD、LDH、ROS水平檢測(cè) Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細(xì)胞按照上述方法處理以后，收集培養(yǎng)液上清及細(xì)胞，用硫代巴比妥酸法檢測(cè)細(xì)胞中MDA水平，黃嘌呤氧化法檢測(cè)細(xì)胞中SOD活性，二硝基苯肼顯色法檢測(cè)上清中LDH含量，二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法檢測(cè)ROS水平，步驟同試劑盒說明書。

1.2.8細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6水平檢測(cè) Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細(xì)胞按照上述方法處理以后，收集培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6水平，步驟同試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1H2O2誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞中TLR4表達(dá) Control組、H2O2組細(xì)胞中TLR4 mRNA水平依次為：1.00、2.64±0.28，TLR4蛋白水平依次為：0.25±0.03、0.63±0.05。H2O2處理以后的心肌H9C2細(xì)胞中TLR4 mRNA和蛋白水平均明顯升高，H2O2誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞中TLR4的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄。見表1和圖1。

2.2TLR4 siRNA慢病毒感染降低H2O2處理后的心肌H9C2細(xì)胞中TLR4的表達(dá) H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細(xì)胞中TLR4 mRNA水平依次為：1.00、1.00±0.12、0.10±0.06，TLR4蛋白水平依次為：0.71±0.08、0.72±0.06、0.15±0.03。心肌H9C2細(xì)胞感染TLR4 siRNA慢病毒以后，經(jīng)H2O2誘導(dǎo)，細(xì)胞中TLR4 mRNA和蛋白水平均明顯降低，說明TLR4 siRNA慢病毒感染成功下調(diào)了心肌H9C2細(xì)胞中TLR4的表達(dá)水平。見表2和圖2。

2.3沉默TLR4減少H2O2誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞凋亡 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細(xì)胞凋亡率依次為：(4.13±0.52)%、 (28.32±2.31)%、(27.96±3.45)%、(20.14±1.58)%，Cleaved Casp-ase-3蛋白水平依次為：0.15±0.02、0.36±0.03、0.35±0.06、0.23±0.04，Bax蛋白水平依次為：0.25±0.03、0.47±0.05、0.49±0.06、0.38±0.04。H2O2處理以后的心肌H9C2細(xì)胞中Bax蛋白、Cleaved Caspase-3蛋白和細(xì)胞凋亡率明顯升高，H2O2誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞凋亡。沉默TLR4可以減少H2O2條件下心肌H9C2細(xì)胞中Bax蛋白、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡率，提示沉默TLR4可以減少H2O2誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞凋亡。見表3和圖3。

表1 H2O2處理后的心肌H9C2細(xì)胞中TLR4表達(dá)變化

Note：Compared with Control，1)P<0.05.

圖1 Western blot測(cè)定H2O2處理后的心肌H9C2細(xì)胞中TLR4的表達(dá)Fig.1 Western blot determination of TLR4 expression in cardiac myocytes after H2O2 treatment

表2 各組心肌H9C2細(xì)胞中TLR4表達(dá)變化

Note：Compared with H2O2，1)P<0.05.

2.4沉默TLR4抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞氧化損傷 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組細(xì)胞MDA水平依次為：(10.59±1.36)、(17.82±1.23)、(17.22±1.63)、(13.54±1.05)μmol/mg，SOD水平依次為：(41.36±3.28)、(26.58±2.69)、(26.74±3.26)、(34.16±2.17)U/ml，LDH水平依次為：(85.46±8.73)、(145.37±12.98)、(145.72±10.87)、(120.86±11.64)U/L。H2O2處理以后的心肌H9C2細(xì)胞中MDA水平升高，同時(shí)細(xì)胞中SOD活性下降，細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH水平明顯升高，提示H2O2可以誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，造成細(xì)胞氧化損傷。沉默TLR4后的心肌H9C2細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)處理以后，細(xì)胞中MDA水平降低，SOD活性升高，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH水平降低，提示沉默TLR4可以減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞氧化損傷。見表4。

圖2 Western blot檢測(cè)TLR4 siRNA對(duì)心肌H9C2細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)影響Fig.2 Western blot to detect effect of TLR4 siRNA on expression of TLR4 protein in cardiac myocytes

表3 各組心肌H9C2細(xì)胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平變化

Note：Compared with Control,1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

2.5沉默TLR4減少H2O2誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞中ROS積累 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組ROS水平依次為：9.65±0.82、32.74±2.98、32.11±2.56、18.52±1.71。H2O2處理以后的心肌H9C2細(xì)胞ROS水平升高，提示H2O2可以誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞中ROS的積累。沉默TLR4后的心肌H9C2細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)處理以后，細(xì)胞中ROS水平降低，提示沉默TLR4可以減少H2O2誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞中ROS的積累。見表5。

2.6沉默TLR4減少H2O2誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6 Control組、H2O2組、si-NC組、si-TLR4組TNF-α水平依次為：(1.45±0.12)、(2.96±0.31)、(2.94±0.25)、(2.15±0.15)μg/L，IL-6水平依次為：(54.26±4.17)、(142.01±12.36)、(140.58±13.86)、(99.75±10.25)pg/ml。H2O2處理以后的心肌H9C2細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6水平升高，提示H2O2可以誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞分泌炎癥因子。沉默TLR4后的心肌H9C2細(xì)胞經(jīng)H2O2誘導(dǎo)處理以后，細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-6水平降低，提示沉默TLR4可以減少H2O2誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞分泌炎癥因子。見表6。

圖3 沉默TLR4減少 H2O2誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞凋亡Fig.3 Silencing TLR4 reduces H2O2 induced cardiomyo-cyte apoptosisNote: A.Flow cytometry was used to detect the apoptosis of cardiac myocytes；B.Detection of apoptosis related protein Bax and Cleaved Caspase-3 protein in cardiac myocytes by Western blot.

表4 各組心肌H9C2細(xì)胞中MDA、SOD及培養(yǎng)液中LDH水平變化

Note：Compared with Control，1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

表5 各組心肌H9C2細(xì)胞中ROS水平變化

Note：Compared with Control，1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

表6 各組心肌H9C2細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6變化

Note：Compared with Control，1)P<0.05;compared with H2O2，2)P<0.05.

3 討論

TLR4是被第一個(gè)發(fā)現(xiàn)的TLR相關(guān)蛋白，參與機(jī)體的固有免疫應(yīng)答，其在病原體識(shí)別、細(xì)胞程序性死亡分子結(jié)構(gòu)識(shí)別等過程中具有重要作用，TLR4的分布極為廣泛，在巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等中均有表達(dá)，參與腫瘤、缺血再灌注、免疫相關(guān)疾病等的發(fā)生[7-10]。很多研究表明，TLR4在缺血再灌注心肌組織中高表達(dá)，參與缺血再灌注早期和晚期炎癥損傷和心肌細(xì)胞功能損傷，其可以促進(jìn)心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)，阻礙心肌組織正常功能的發(fā)揮[11,12]?；蚯贸齌LR4后的小鼠心肌梗死的面積明顯減小，TLR4基因敲除的小鼠較野生型的小鼠心功能改善程度較好，這些研究結(jié)果均提示，TLR4參與缺血缺氧心臟損傷[13,14]。

缺血缺氧心臟損傷的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有關(guān)，缺血缺氧可以誘導(dǎo)心肌組織中產(chǎn)生大量的氧自由基，這些氧自由基過度積累導(dǎo)致細(xì)胞中脂質(zhì)發(fā)生過氧化，引起細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，使得原本存在于細(xì)胞內(nèi)的LDH外漏至細(xì)胞外[15]。脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物之一是MDA，檢測(cè)MDA水平可以間接反映細(xì)胞中脂質(zhì)發(fā)生過氧化的程度[16]。SOD是細(xì)胞中的氧自由基清除劑，其可以清除細(xì)胞中過量的氧自由基，維持細(xì)胞氧化平衡[17]。本次研究表明，H2O2誘導(dǎo)心肌H9C2細(xì)胞中MDA水平和細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH水平升高，降低細(xì)胞中SOD活性，促進(jìn)細(xì)胞中ROS合成，而沉默TLR4可以逆轉(zhuǎn)H2O2對(duì)心肌H9C2細(xì)胞的上述作用，TLR4沉默可以減輕心肌H9C2細(xì)胞氧化損傷，提高抗氧化酶活性，TLR4可能參與心肌H9C2細(xì)胞氧化損傷過程。

心肌細(xì)胞過度凋亡與缺血缺氧心臟疾病發(fā)生有關(guān)，缺氧缺血誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。研究表明，細(xì)胞內(nèi)過量的ROS可以激活細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞中Caspase-3的活化，促進(jìn)心肌細(xì)胞中Bax的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[18,19]。缺氧缺血心臟疾病還與炎癥反應(yīng)有關(guān)，細(xì)胞受到氧化損傷又可以誘導(dǎo)細(xì)胞釋放炎癥因子，TNF-α、IL-6是重要的免疫調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞炎癥反應(yīng)，在缺氧缺血心臟損傷中含量增加[20-22]。TLR4參與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等過程，在腎小管上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞中均已證實(shí)[23-25]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，沉默TLR4可以減少H2O2誘導(dǎo)的心肌H9C2細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞中Bax、Cleaved Caspase-3蛋白水平和細(xì)胞分泌炎癥因子，沉默TLR4可能通過抑制細(xì)胞凋亡和炎癥減輕心肌H9C2細(xì)胞氧化損傷。

TLR4參與氧化應(yīng)激條件下的心肌H9C2細(xì)胞功能發(fā)揮，沉默TLR4可以減輕心肌H9C2細(xì)胞氧化損傷，減少細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，本實(shí)驗(yàn)明確了TLR4在氧化應(yīng)激條件下心肌H9C2細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化損傷中的作用，為以后研究缺氧缺血心肌損傷提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，其調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥等的具體作用機(jī)制還需要在以后的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)探索。