劉金泉 紀(jì) 寧 劉金濤

(大同大學(xué)神經(jīng)病學(xué)與精神病學(xué)教研室,大同037009)

星形膠質(zhì)細(xì)胞是一種含量最多的中樞神經(jīng)細(xì)胞，可通過分泌細(xì)胞因子、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等，從而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)、支持的作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)起著關(guān)鍵的作用。大量研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦功能發(fā)揮重要作用，尤其是在腦缺血損傷中[1-4]。腦缺血缺氧的損傷程度可導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的改變[5]。腦缺血損傷初期，星形膠質(zhì)細(xì)胞可降低腦內(nèi)對(duì)神經(jīng)元有害物質(zhì)的含量如自由基、興奮性氨基酸等，從而發(fā)揮保護(hù)作用；當(dāng)腦缺血損傷嚴(yán)重時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生大量的凋亡，導(dǎo)致神經(jīng)元進(jìn)一步發(fā)生損傷。因此，在腦缺血損傷的相關(guān)研究中，降低星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡具有重要意義。近年來的研究表明，炎癥反應(yīng)對(duì)腦缺血損傷的發(fā)生、發(fā)展具有密切相關(guān)性[6,7]。NOD樣家族受體(NOD-like receptors,NLRS)在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中起重要作用。最近的研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中可分泌NOD樣受體家族蛋白2(NOD-like receptor protein 2,NLRP2)炎癥小體[8]。目前，關(guān)于NLRP2的相關(guān)研究較少，尤其是在腦缺血損傷中，因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP2水平及采用小RNA干擾(siRNA)技術(shù)沉默NLRP2的表達(dá)，觀察其在腦缺血損傷中的作用并初步探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6J小鼠購(gòu)買于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、Trizol、siRNA、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；RIPA裂解液、膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；鼠抗β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體、兔抗NLRP2抗體、兔抗白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β )抗體、兔抗核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear factor-Kappa B,NF-κB)p65抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1,caspase-1)抗體、caspase-1前體(Pro-caspase-1)抗體、兔抗磷酸化p65(p-p65)抗體、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3,caspase-3)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)抗體購(gòu)自武漢博士德公司；RT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Beckman coulter公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本Heraeus公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司。

1.2方法

1.2.1星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)以及氧糖剝奪模型的構(gòu)建 處死小鼠，取出大腦，去除小腦、腦膜、血管，收集大腦皮層組織，根據(jù)文獻(xiàn)[9]所示方法進(jìn)行純化。收集1×106個(gè)/ml細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、傳代。選取對(duì)數(shù)期星形膠質(zhì)細(xì)胞，以每孔4×104個(gè)接種于96孔板中，根據(jù)文獻(xiàn)[10]，將細(xì)胞置于無(wú)氧、無(wú)糖環(huán)境中培養(yǎng)6 h，造成氧糖剝奪(Oxygen glucose deprivation,OGD)損傷后，轉(zhuǎn)移至37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，常規(guī)氧氣供給，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞中NLRP2 mRNA的表達(dá)量 收集細(xì)胞，吸取適量Trizol冰上裂解5min，提取細(xì)胞中總RNA。吸取1 μg RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，合成為cDNA，在RT-PCR試劑盒說明書的指示下，進(jìn)行定量PCR，結(jié)果采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.3免疫印跡試驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞中NLRP2 蛋白的表達(dá)量 棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中溶液，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，離心，按1∶4的比例加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，BCA法測(cè)定蛋白樣品的濃度。采用12%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜中；5%脫脂奶粉中封閉1 h；分別加入一抗、二抗，顯色、曝光，凝膠成像儀中觀察圖像，Quantity One分析蛋白質(zhì)灰度值。

1.2.4細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)前，選取抑制效果較強(qiáng)的siRNA NLRP2；將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為4組，對(duì)照組、模型組、空載體組、siRNA NLRP2組。根據(jù)1.2.1所示實(shí)驗(yàn)方法，選取氧糖剝奪后繼續(xù)培養(yǎng)24 h的細(xì)胞，以每孔3×105個(gè)加入6孔板中，培養(yǎng)24 h進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將攜帶無(wú)義序列和NLRP2序列的siRNA分別轉(zhuǎn)染入氧糖剝奪細(xì)胞中。RT-PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后NLRP2的表達(dá)量。

1.2.5細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 根據(jù)Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書的指示，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，避光，避光15 min，流式儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。

1.2.6細(xì)胞凋亡蛋白及炎性因子的檢測(cè) 根據(jù)1.2.3所示，采用Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3及Pro-caspase-1、caspase-1、IL-1β、P65、p-P65蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1OGD損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP2的表達(dá)量 如圖1所示，以常規(guī)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞為對(duì)照組，對(duì)照組和OGD模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP2 mRNA的表達(dá)量分別為1.000±0.009、2.698±0.315；NLRP2蛋白水平分別為0.352±0.036、0.784±0.071。與對(duì)照組相比，OGD模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP2 mRNA和蛋白水平上調(diào)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染siRNA NLRP2對(duì)OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP2表達(dá)量的影響 如圖2所示，模型組、空載體組、siRNA NLRP2組氧糖剝奪星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP2 mRNA的表達(dá)量分別為1.002±0.007、0.993±0.008、0.421±0.038；NLRP2蛋白水平分別為0.348±0.035、0.363±0.041、0.124±0.013。與模型組相比，空載體組細(xì)胞中NLRP2 mRNA和蛋白水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，siRNA NLRP2組星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP2 mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3沉默NLRP2表達(dá)量對(duì)OGD損傷細(xì)胞凋亡的影響 如圖3所示，對(duì)照組、模型組、空載體組、siRNA NLRP2組氧糖剝奪星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率分別為(5.693±0.674)%、(32.682±3.415)%、(35.487±3.662)%、(18.674±2.453)%。與對(duì)照組相比，模型組、空載體組、siRNA NLRP2組細(xì)胞的凋亡率增加，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，空載體組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，siRNA NLRP2組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡率顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 OGD損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP2的表達(dá)量Fig.1 Expression of NLRP2 in astrocytes with OGD Note: 1.Control group;2.OGD model group.Compared with the control group,*.P<0.05.

圖2 轉(zhuǎn)染后對(duì)OGD損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP2的表達(dá)量的影響Fig.2 Effect of transfection on NLRP2 expression in astrocytes with OGD Note: 1.Model group;2.Empty vector group;3.siRNA NLRP2 group.Compared to model group,#.P<0.05.

2.4沉默NLRP2表達(dá)量對(duì)OGD損傷細(xì)胞凋亡蛋白的影響 如圖4所示，對(duì)照組、模型組、空載體組、siRNA NLRP2組氧糖剝奪星形膠質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2蛋白水平分別為0.652±0.068、0.215±0.023、0.234±0.020、0.539±0.056，Bax蛋白水平分別為0.362±0.041、0.832±0.085、0.814±0.082、0.421±0.038，caspase-3蛋白水平分別為0.257±0.024、0.685±0.063、0.692±0.065、0.365±0.032。與對(duì)照組相比，模型組、空載體組、siRNA NLRP2組Bcl-2蛋白降低(P<0.05)，Bax蛋白(P<0.05)、caspase-3蛋白增加(P<0.05)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，空載體組Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，siRNA NLRP2組星形膠質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2蛋白顯著增加(P<0.05)，Bax、caspase-3蛋白顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5沉默NLRP2表達(dá)量對(duì)OGD損傷細(xì)胞中NLRP2下游蛋白的影響 如圖5、表1所示，Pro-caspase-1蛋白在各組間的變化差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組相比，模型組、空載體組、siRNA NLRP2組caspase-1蛋白(P<0.05)、IL-1β蛋白(P<0.05)、P65蛋白(P<0.05)、p-P65蛋白(P<0.05)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組相比，空載體組各蛋白差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，siRNA NLRP2組星形膠質(zhì)細(xì)胞中caspase-1、IL-1β、P65、p-P65蛋白(P<0.05)顯著降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 沉默NLRP2表達(dá)量對(duì)OGD損傷細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of silencing NLRP2 expression on apoptosis in OGD-injured Note: Compared to control group,*.P<0.05;compared to model group,#.P<0.05.

圖4 沉默NLRP2表達(dá)量對(duì)OGD損傷細(xì)胞凋亡蛋白的影響Fig.4 Effect of silencing NLRP2 expression on apoptotic proteins in OGD-injured

圖5 沉默NLRP2表達(dá)量對(duì)OGD損傷細(xì)胞中NLRP2下游蛋白的影響Fig.5 Effect of silencing NLRP2 expression on downstr-eam protein in OGD-injury Note: Compared to the model group,*.P<0.05.

表1 沉默NLRP2表達(dá)量對(duì)OGD損傷細(xì)胞凋亡蛋白的影響

Note：Compared to control group,1)P<0.05;compared to model group,2)P<0.05.

表2 沉默NLRP2表達(dá)量對(duì)OGD損傷細(xì)胞中NLRP2下游蛋白的影響

Note：Compared to control group，1)P<0.05;compared to model group，2)P<0.05.

3 討論

NLRP2是NLRPs家族中的成員之一，存在于細(xì)胞質(zhì)中，由多種細(xì)胞系分泌、表達(dá)。目前關(guān)于NLRP2的研究較少，主要集中在胚胎發(fā)育、流產(chǎn)等方面[11，12]，NLRP2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用上不清楚。在本研究中，通過氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)構(gòu)建腦缺血損傷的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)NLRP2在OGD損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量顯著增加，提示NLRP2參與機(jī)體腦缺血損傷的發(fā)生、發(fā)展過程。利用siRNA技術(shù)抑制NLRP2表達(dá)后，檢測(cè)顯示細(xì)胞中NLRP2的表達(dá)量較模型組顯著降低，表明轉(zhuǎn)染成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

目前，NLRP2炎癥小體已成為機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要組成部分，通過促進(jìn)Pro-caspase-1裂解為具有活性的caspase-1，激活和放大促炎細(xì)胞因子如IL-1β的作用，從而誘導(dǎo)腦缺血損傷后導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)細(xì)胞的死亡[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP2可與caspase-1組成炎性小體，調(diào)控NF-κB信號(hào)通路的活性[16，17]。NF-κB主要由P65和P50兩種異源二聚體構(gòu)成，對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡發(fā)揮關(guān)鍵作用[18-20]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，OGD損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡率顯著增加，Pro-caspase-1蛋白的表達(dá)量無(wú)顯著變化，caspase-1、IL-1β、P65、p-P65蛋白水平顯著增加；沉默NLRP2的表達(dá)量顯著降低細(xì)胞的凋亡，抑制caspase-1、IL-1β、P65、p-P65蛋白的表達(dá)，表明NLRP2通過激活caspase-1，誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路從而調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，減輕腦缺血損傷。

Bcl-2主要通過與Bax的結(jié)合、水解，抑制細(xì)胞的凋亡。Bcl-2也可直接與凋亡蛋白因子結(jié)合，抑制caspase家族蛋白的激活[21，22]。caspase-3是caspase家族在細(xì)胞凋亡過程中關(guān)鍵的蛋白因子、多種凋亡信號(hào)通路共同的下游靶因子、細(xì)胞凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的樞紐，可直接促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[23，24]。既往研究表明，在神經(jīng)細(xì)胞受損的過程中，Bcl-2基因首先被激活，抑制細(xì)胞凋亡，其中caspase-3也參與腦缺血損傷的保護(hù)作用[25]。在本實(shí)驗(yàn)中，氧糖剝奪后星形膠質(zhì)細(xì)胞中Bcl-2蛋白水平顯著降低，Bax、caspase-3蛋白水平顯著增加，表明Bcl-2等細(xì)胞凋亡信號(hào)通路參與腦缺血損傷中神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程；抑制NLRP2的表達(dá)量，顯著促進(jìn)Bcl-2水平、抑制Bax、caspase-3蛋白表達(dá)，表明沉默NLRP2可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路降低神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)腦缺血損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建氧糖剝奪星形膠質(zhì)細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)NLRP2參與腦缺血損傷過程；沉默NLRP2可通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，調(diào)控NF-κB和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，阻礙神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，從而對(duì)腦缺血損傷發(fā)揮一定的保護(hù)作用，為腦缺血損傷的治療提供潛在的靶位點(diǎn)。