鄭冠鵬，王曉雨，劉新倫，田增榮，王 超，吉萬(wàn)全

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家小麥改良中心楊凌分中心/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

近年來(lái)，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高小麥產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性的研究已日趨廣泛。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、可轉(zhuǎn)移較大片段 DNA等優(yōu)點(diǎn)，并且外源基因的整合多為單拷貝，遺傳穩(wěn)定性好，后代多數(shù)符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，所以在小麥轉(zhuǎn)基因研究中被廣泛應(yīng)用[1]。然而在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過(guò)程中，褐化問(wèn)題嚴(yán)重影響了小麥轉(zhuǎn)化的成功率，其與玻璃化和菌類污染并稱為組織培養(yǎng)的三大難題[2]。

褐化是外植體受到脅迫后釋放出酚類物質(zhì)并誘導(dǎo)植保素或物理屏障生成的一種自我保護(hù)機(jī)制。由于酚類物質(zhì)不穩(wěn)定，易在多酚氧化酶的作用下氧化形成褐色醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)又會(huì)在酪氨酸酶等酶的作用下，與外植體中的蛋白質(zhì)聚合，進(jìn)一步導(dǎo)致其他酶系統(tǒng)紊亂，導(dǎo)致外植體生長(zhǎng)停滯直至死亡[3]。研究表明，在培養(yǎng)基中添加一些抗褐化劑，如半胱氨酸(Cys)、抗壞血酸(Vc)、谷胱甘肽(GSH)及AgNO3等[4]，可以減輕愈傷組織的褐化。趙 瑋[5]在茶樹(shù)組織培養(yǎng)中使用1/2 MS培養(yǎng)基并加入0.50 g·L-1的Na2S2O3和0.50 g·L-1的活性炭，使茶樹(shù)的褐化率降為40.5%。饒慧云等[6]在葡萄組織培養(yǎng)中研究了7種抗褐化劑的作用，效果為PVP(2.0 g·L-1)>甘露醇(20.0 g·L-1)>AgNO3(0.02 g·L-1)>Vc(0.006 g·L-1)>活性炭(2.5 g·L-1)>檸檬酸(0.6 g·L-1)。在杉木精簡(jiǎn)組織培養(yǎng)中加入Vc和Cys可有效降低愈傷組織的褐化程度[7]；在堿茅種胚的誘導(dǎo)、繼代和芽分化培養(yǎng)基中添加500 mg·L-1的脯氨酸可有效防止愈傷組織褐化[8]；在小麥遺傳轉(zhuǎn)化的侵染和共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加400 mg·L-1的Cys，降低了愈傷組織的褐化率[9]。

硫辛酸(lipoic acid,LA)作為一種獨(dú)特的抗氧化劑，廣泛存在于各種原核和真核細(xì)胞中，它的存在可有效減少氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生[10]。硫辛酸的抗氧化功能體現(xiàn)在以下5個(gè)方面：(1)直接清除活性氧和活性氮；(2)通過(guò)螯合金屬離子發(fā)揮抗氧化作用；(3)循環(huán)再生其他內(nèi)源性抗氧化劑；(4)增強(qiáng)自身氧化酶的活性；(5)增加線粒體膜電位和細(xì)胞氧消耗，降低活性氧的產(chǎn)生。硫辛酸在木本植物的組織培養(yǎng)中有所應(yīng)用，Uchendu等[11]的研究表明，培養(yǎng)基中添加4～8 mmol·L-1的硫辛酸可顯著提高兩種樹(shù)莓莖尖的再生率。但硫辛酸在小麥組織培養(yǎng)中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

甜菜堿(glycine betaine,GB)是一種植物抵抗非生物脅迫的保護(hù)劑[12]，研究表明，甜菜堿可誘導(dǎo)H2O2介導(dǎo)的抗氧化機(jī)制[13]。Cuin等[14]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中添加低濃度(5 mmol·L-1)的甜菜堿可減少擬南芥根部伸長(zhǎng)區(qū)的氧自由基。Uchendu等[11]的研究表明，在培養(yǎng)基中添加10 mmol·L-1的甜菜堿可有效提高凍存莖尖的再生率。然而甜菜堿在小麥組織培養(yǎng)中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以小麥幼胚為試驗(yàn)材料，研究硫辛酸和甜菜堿在組織培養(yǎng)中對(duì)愈傷組織的作用，以期找到克服小麥愈傷組織褐化的方法，為進(jìn)一步優(yōu)化小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

所用小麥?zhǔn)荏w材料為弱春性小麥品種小偃22，半冬性小麥品種Z50和鄭麥366，農(nóng)桿菌菌株為GV3101，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)染色體工程實(shí)驗(yàn)室保存。植物表達(dá)載體DRB-bar-TaGW2由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+2 mg·L-12,4-D,+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，pH 5.8。重懸液：1/10MS+2,4-D(2 mg·L-1)+30 g·L-1蔗糖+150 mmol·L-1乙酰丁香酮，pH 5.8。共培養(yǎng)基：1/10MS+2,4-D(2 mg·L-1)+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8。抑菌培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+2,4-D(2 mg·L-1)+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，分別添加不同濃度的硫辛酸和甜菜堿(表1)。硫辛酸與甜菜堿均于滅菌前加入并將pH調(diào)至5.8，滅菌結(jié)束后溫度降至約50 ℃時(shí)加入終濃度為500 mg·L-1的羧芐青霉素。

表1 抑菌培養(yǎng)基中硫酸鋅(LA)和甜菜堿(GB)的添加量Table 1 Concentration of lipoic acid(LA) and glycine betaine(GB) in the bacteriostatic medium

基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為MS+2,4-D(2 mg·L-1)+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂。

The basic medium is MS+2,4-D(2 mg·L-1)+30 g·L-1sucrose+7 g·L-1agar.

1.3 小麥幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)

取揚(yáng)花后13～15 d的小麥未成熟種子，用75%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次，隨后用0.1%升汞處理10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次。于超凈工作臺(tái)中用滅菌的手術(shù)刀切取幼胚置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于25 ℃下暗培養(yǎng)15 d。

1.4 幼胚愈傷組織的侵染

將含有載體DRB-bar-TaGW2的農(nóng)桿菌GV3101接種于LB液體培養(yǎng)基(含50 mg·L-1利福平+100 mg·L-1壯觀霉素)中，28 ℃ 280 r·min-1過(guò)夜培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，4 000 r·min-1離心10 min，棄上清后加入與上清等量的重懸液重懸農(nóng)桿菌，用重新懸浮的菌液浸泡愈傷組織20 min后除去多余菌液。將愈傷組織轉(zhuǎn)入含有適量共培養(yǎng)基的濾紙培養(yǎng)皿中，25 ℃共培養(yǎng)48 h，再轉(zhuǎn)入含有不同處理的抑菌培養(yǎng)基中。各處理均重復(fù)3次，每重復(fù)取愈傷組織50枚左右。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

a：0級(jí)；b：1級(jí)；c ：2級(jí)；d： 3級(jí)。 a:Level 0; b:Level 1; c:Level 2; d:Level 3.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種的褐化及水漬化程度

本研究發(fā)現(xiàn)，在均未添加LA和GB時(shí)，于5、10和15 d抑菌處理后，Z50和小偃22的褐化程度均顯著低于鄭麥366 ，各品種隨著抑菌時(shí)間的延長(zhǎng)，褐化程度均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但除小偃22外，差異均不顯著(圖2)。三個(gè)品種的水漬化程度均表現(xiàn)為隨抑菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，Z50、鄭麥366抑菌10 d時(shí)的水漬化程度均顯著低于5 d。抑菌5 d時(shí)小偃22水漬化程度顯著低于鄭麥366，但抑菌10和15 d時(shí)差異不顯著(圖3)。

圖柱上小寫(xiě)字母不同表示相同抑菌時(shí)間內(nèi)不同品種之間差異顯著(P<0.05)，大寫(xiě)字母不同表示相同品種在不同抑菌時(shí)間下差異顯著(P<0.05)。圖3同。

圖3 不同品種在不同抑菌處理天數(shù)后的水漬化程度

2.2 硫辛酸處理對(duì)抑菌階段愈傷組織的影響

2.2.1 硫辛酸處理對(duì)抑菌階段愈傷組織褐化程度的影響

從圖4可以看出，Z50、小偃22和鄭麥366的褐化程度基本呈現(xiàn)隨硫辛酸濃度的升高而降低的趨勢(shì)，并且隨著抑菌時(shí)間的延長(zhǎng)，其中添加4和8 mmol·L-1硫辛酸處理的褐化程度均顯著低于CK(小偃22處理15 d的情況例外)。在抑菌培養(yǎng)第10 d，添加4 mmol·L-1硫辛酸的Z50褐化程度最低，僅為對(duì)照的10.50%。在硫辛酸對(duì)小偃22愈傷組織的處理中，添加2 mmol·L-1硫辛酸褐化程度最高，而添加4和8 mmol·L-1硫辛酸處理的褐化程度顯著低于CK。鄭麥366在抑菌第5 d，2 mmol·L-1硫辛酸處理的褐化程度略高于CK，而在第10和15 d的褐化程度均隨硫辛酸濃度的升高而降低。這說(shuō)明硫辛酸在抑制愈傷組織褐化方面起到積極的作用，且其影響程度與品種類型密切相關(guān)。

橫坐標(biāo)上的天數(shù)為抑菌處理的時(shí)間；圖柱上小寫(xiě)字母不同表示在不同濃度硫辛酸處理下相同品種和相同抑菌時(shí)間內(nèi)褐化程度在0.05水平上差異顯著。圖5、圖6、圖7同。

2.2.2 硫辛酸處理對(duì)抑菌階段愈傷組織水漬化程度的影響

如圖5所示，在添加不同濃度硫辛酸處理5、10和15 d后，隨著硫辛酸濃度的提高，Z50和小偃22愈傷組織的水漬化程度依次增加。添加8 mmol·L-1硫辛酸的Z50水漬化程度在5、10和15 d均顯著高于CK。添加4和8 mmol·L-1硫辛酸的小偃22在抑菌15 d時(shí)水漬化程度顯著高于CK。添加硫辛酸對(duì)鄭麥366的影響與另兩個(gè)品種不同，在抑菌5 d時(shí)，添加8 mmol·L-1硫辛酸處理的水漬化程度顯著高于CK，抑菌處理10和15 d時(shí)，添加2、4和8 mmol·L-1硫辛酸處理的水漬化程度與CK的差異均未達(dá)到顯著水平。

圖5 硫辛酸濃度對(duì)抑菌處理后各品種水漬化程度的影響

2.3 甜菜堿處理對(duì)抑菌階段愈傷組織的影響

2.3.1 甜菜堿處理對(duì)抑菌階段愈傷組織褐化程度的影響

如圖6所示，統(tǒng)計(jì)了甜菜堿處理下Z50和小偃22愈傷組織的褐化程度，由于鄭麥366處理較少，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故未計(jì)入其中。在抑菌5 d的愈傷組織中，添加10 mmol·L-1甜菜堿的Z50表現(xiàn)為褐化程度加深，而在抑菌的第10 和15 d，添加甜菜堿的愈傷組織褐化程度低于對(duì)照，但差異均未達(dá)到顯著水平。而添加甜菜堿后，在抑菌的第5、10和15 d，小偃22愈傷組織的褐化程度均高于對(duì)照，但差異均未達(dá)到顯著水平。說(shuō)明添加10 mmol·L-1甜菜堿對(duì)這兩個(gè)品種愈傷組織褐化程度的影響都不明顯。

2.3.2 甜菜堿處理對(duì)抑菌階段愈傷組織水漬化程度的影響

由圖7可知，在對(duì)Z50、小偃22幼胚愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的抑菌階段，添加10 mmol·L-1的甜菜堿略微降低了愈傷組織的水漬化程度，但處理5、10和15 d后與CK的差異均未達(dá)到顯著水平。說(shuō)明添加10 mmol·L-1甜菜堿對(duì)Z50和小偃22水漬化程度的影響均不明顯。

圖6 甜菜堿濃度對(duì)抑菌處理后Z50和小偃22褐化程度的影響

圖7 甜菜堿濃度對(duì)抑菌處理后Z50和小偃22水漬化程度的影響

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，硫辛酸可以有效地降低小麥幼胚愈傷組織的褐化程度，但也會(huì)提高愈傷組織的水漬化程度，這可能是由于小麥幼胚愈傷組織的不適應(yīng)造成的。且在后期的繼續(xù)培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，添加硫辛酸濃度較高的處理組，愈傷組織生長(zhǎng)緩慢甚至停止生長(zhǎng)，考慮可能由于硫辛酸濃度過(guò)高，處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致愈傷組織受到毒害。所以筆者認(rèn)為，硫辛酸雖在抑制褐化方面具有一定的作用，但在添加時(shí)間、濃度、添加方法等方面還需進(jìn)一步的研究。

甜菜堿作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以參與細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)，外源甜菜堿可提高小麥幼苗SOD和APX的活性，緩解活性氧帶來(lái)的傷害[15]。但本研究發(fā)現(xiàn)，甜菜堿對(duì)小麥品種Z50和小偃22幼胚愈傷組織的褐化程度及水漬化程度均無(wú)明顯影響，這可能是因?yàn)檫@兩個(gè)品種對(duì)甜菜堿都不敏感的緣故。前人的一些研究證明甜菜堿的添加與品種有關(guān)，例如孫文越等[16]研究發(fā)現(xiàn)，外源甜菜堿對(duì)“黑芒”小麥?zhǔn)艿礁珊得{迫引起的傷害具有加深作用；而趙博生等[17]的研究卻表明，外源甜菜堿可降低干旱/鹽脅迫對(duì)“京核 931”小麥生長(zhǎng)的抑制作用。