司二靜，楊淑蓮，孟亞雄，李葆春，馬小樂， 汪軍成， 任盼榮，姚立蓉，張 宇，王化俊

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)院，甘肅蘭州 730070；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)檔案館，甘肅蘭州 730070； 4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；5.甘肅省種子管理局，甘肅蘭州 730020)

大麥作為全球第四大禾谷類作物，因其較強(qiáng)的抗旱、耐貧瘠和耐鹽性被廣范種植，且具有良好的飼用、食用和啤用價(jià)值。籽粒蛋白質(zhì)含量是決定大麥用途的重要性狀之一，飼用、食用和啤用大麥對籽粒蛋白質(zhì)含量要求不盡相同，如啤用大麥蛋白質(zhì)含量一般要求在9.0%～12.0%之間，而飼用和食用大麥則蛋白質(zhì)含量越高越好，優(yōu)質(zhì)飼用和食用大麥的籽粒蛋白質(zhì)含量一般要求大于13.0%[1]。大麥籽粒蛋白質(zhì)含量受環(huán)境條件影響，但主要由遺傳因素控制[2]，且由主效基因和若干微效基因共同控制[3]。Marquez-Cedillo等[4]利用雙單倍體群體對麥芽質(zhì)量相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位，分別在2H、4H和5H上檢測到與大麥蛋白質(zhì)含量相關(guān)的QTL，標(biāo)記區(qū)間依次為vrs1-MWG503、INT-C-HVM40和MWG635d-ABC302a。

關(guān)聯(lián)分析通過對關(guān)聯(lián)群體的候選基因檢測或者分子標(biāo)記掃描，得到豐富的基因位點(diǎn)及其等位基因信息，進(jìn)一步與相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)，分析鑒定出對其目標(biāo)性狀有正向貢獻(xiàn)的優(yōu)異等位基因[5]。在小麥[6-7]、玉米[8-9]、水稻[10-11]和大麥[12-16]等作物中均有關(guān)聯(lián)分析應(yīng)用的報(bào)道，已有對大麥性狀的關(guān)聯(lián)分析主要涉及耐脅迫[12-13]、抗病[14-16]、農(nóng)藝性狀[17-20]等，而關(guān)于以大麥籽粒蛋白質(zhì)含量為目標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的研究還未見報(bào)道。

本研究擬運(yùn)用SSR標(biāo)記對大麥材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，并通過SSR標(biāo)記與目標(biāo)性狀的關(guān)聯(lián)分析，探討與大麥蛋白質(zhì)含量相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記，為大麥的分子輔助選擇育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的93份大麥材料由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室麥類種質(zhì)創(chuàng)新課題組和甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大麥研究所提供，來源及編號(hào)見表1。2015年3月將93份大麥材料點(diǎn)播種植于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)黃羊鎮(zhèn)實(shí)驗(yàn)田。采用常規(guī)田間管理，成熟期收獲并測定蛋白質(zhì)含量。

表1 供試材料來源Table 1 Origin of materials used in the study

1.2 籽粒蛋白質(zhì)含量的測定

用近紅外線分析儀(Foss NIR system)測定大麥籽粒蛋白質(zhì)含量。

1.3 SSR標(biāo)記分析

在直徑9 cm培養(yǎng)皿中進(jìn)行不同大麥品種萌發(fā)，22 ℃黑暗培養(yǎng)2周后采集大麥葉片，在研缽中添加液氮后進(jìn)行樣品研磨，運(yùn)用CTAB法[21-22]提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。參考Grain Genes 2.0網(wǎng)站、Korff等[23]構(gòu)建的遺傳圖譜、司二靜等[20]研究結(jié)果，按遺傳距離選取93個(gè)均勻分布于大麥1H～7H染色體的SSR標(biāo)記(表2)對93份大麥材料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增 。擴(kuò)增體系為10 μL，包括5 μL 2×MasterMix (BIOTEKE，PR1701)，上下游引物各1 μL(10 μmol)，1 μL模板(60 ng·μL-1)，加ddH2O至10 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 3 min；94 ℃ 50 s，64～55 ℃(touch-down PCR)50 s，72 ℃ 50 s，10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。

每對SSR引物擴(kuò)增的每一條帶記為1個(gè)位點(diǎn)，基因型以大寫字母A、B、C等表示。運(yùn)用Power marker V3.25對93個(gè)標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性統(tǒng)計(jì)；以Structure 2.3.1軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，估計(jì)最佳群體數(shù)K，其取值范圍為1～10，將參數(shù)iterations設(shè)為10 000，burn-in period 設(shè)為100 000，每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行5次，依據(jù)似然值最大原則選取合適的K值為群體數(shù)目[24]。當(dāng)K值持續(xù)增大時(shí)，參照Evanno等[25]方法計(jì)算ΔK，選擇合適的K值，計(jì)算Q參數(shù)，將其作為協(xié)變量，運(yùn)用Tassel 2.1軟件一般線性模型(general linear model，GLM)，將Q作為協(xié)變量進(jìn)行回歸分析，混合線性模型(mixed linear model，MLM)采用Q+K方法，分析方法選擇EM，運(yùn)用蛋白質(zhì)含量與分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，并結(jié)合群體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行SSR-蛋白質(zhì)含量關(guān)聯(lián)分析，確定與蛋白質(zhì)含量相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試大麥的蛋白質(zhì)含量

供試的93份大麥材料中，蛋白質(zhì)含量變化范圍為8.4%～15.8%，西安91-2含量最高(15.8%)，其次為EMPRESS(15.4%)，而法爾非特的蛋白質(zhì)含量最低(8.4%)；蛋白質(zhì)含量平均為11.7%，標(biāo)準(zhǔn)差為1.7，變異系數(shù)是14.6%。不同來源大麥材料的蛋白質(zhì)含量差異程度不同，來源于匈牙利的大麥(5)蛋白質(zhì)含量較高，平均為12.9%；來源于德國(19)、美國(25)、日本(4)、中國(34)的大麥平均蛋白質(zhì)含量依次為11.5%、11.7%、11.9%和11.9%，而來源于敘利亞(2)的大麥平均蛋白質(zhì)含量最低，為10.8%。來源于澳大利亞、波蘭、丹麥和法國的大麥材料均為一份，蛋白質(zhì)含量依次為12.2%、10.0%、10.4%和12.8%。國內(nèi)不同省份大麥材料蛋白質(zhì)含量差異較大，來源于山東的大麥平均蛋白質(zhì)含量最高，為12.9%，來源于福建、浙江、甘肅和內(nèi)蒙古的平均蛋白質(zhì)含量依次為12.6%、12.3%、11.3%和10.6%，來源于北京、湖北、江蘇、山西、陜西和西藏均為1份材料，蛋白質(zhì)含量依次為13.7%、13.4%、9.0%、11.9%、15.8%和14.3%，來源于國家?guī)斓膬煞萦谰帽４娲篼湶牧掀骄鞍踪|(zhì)含量為11.2%。

2.2 SSR標(biāo)記分析

利用93個(gè)SSR標(biāo)記對93份大麥材料進(jìn)行多態(tài)性分析，共檢測出等位變異406個(gè)，變化范圍為2～9，其中，標(biāo)記Bmac40和Bmag0225的等位變異最多，均為9個(gè)，其次是Bmag0872、Bmag603和Bmag0812，均為8個(gè)，有8個(gè)標(biāo)記(HVABAIP、HVM54、MGB334、MGB384、Bmac0163、HVM31、GBM1140和GBM1456)的等位變異較少，均為2個(gè)?；蚨鄻有宰兓秶鸀?.021 3～0.862 0，平均為0.575 6；PIC變化范圍為0.021 0～0.648 5，平均為0.521 4，基因多樣性和PIC均以標(biāo)記Bmac40最高，GBM1140最低(表2)。以PIC≥0.5為高多態(tài)性位點(diǎn)，0.25

表2 93對SSR多態(tài)性統(tǒng)計(jì)Table 2 Polymorphic statistics of 93 SSR markers

(續(xù)表2 Continued table 2)

(續(xù)表2 Continued table 2)

2.3 群體結(jié)構(gòu)分析

運(yùn)用多態(tài)性較好的引物對93份大麥材料進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。由圖1A可以看出，隨著K值增大，LnP(D)持續(xù)增大，無明顯拐點(diǎn)，故不能判斷亞群數(shù)，需要通過ΔK來進(jìn)一步確定該群體的亞群數(shù)[25]。由圖1B可以看出，在K=5時(shí)出現(xiàn)明顯峰值，供試材料被劃分為5個(gè)亞群，分別包含18、23、15、22和15份材料(圖1C)。當(dāng)某個(gè)品種在某亞群中的Q≥0.6時(shí)，認(rèn)為該品種來源較為單一，若小于0.6則認(rèn)為有混合來源[26]。93材料中，Q<0.6的材料有34份，占總數(shù)的36.56%，表明這34份材料來源背景復(fù)雜，而Q>0.6的材料有59份，占總數(shù)的63.44%，表明這些材料來源較為單一。

A：LnP(D)值隨K值變化折線圖；B：ΔK 值隨K值變化折線圖； C：93 份材料分為5個(gè)亞群。

2.4 SSR標(biāo)記與蛋白質(zhì)含量關(guān)聯(lián)分析

運(yùn)用不同大麥材料的蛋白質(zhì)含量與93個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，GLM模型檢測結(jié)果顯示，所檢測的93個(gè)SSR標(biāo)記中，共檢測到9個(gè)與大麥蛋白質(zhì)含量顯著相關(guān)的標(biāo)記(P<0.05)，對表型變異的解釋率在7.49%～14.13%間，分布于染色體3H、4H、5H、6H和7H上，其中，位于染色體5H上的標(biāo)記GMS061與蛋白質(zhì)含量極顯著相關(guān)(P<0.01)，表型變異解釋率為13.98%。MLM模型所檢測到的SSR標(biāo)記相關(guān)性與GLM結(jié)果一致，但MLM中關(guān)聯(lián)標(biāo)記的變異解釋率較GLM低，對表型變異的解釋率為7.30%～13.97%，標(biāo)記GMS061與蛋白質(zhì)含量的相關(guān)也達(dá)到極顯著水平，對表型變異的解釋率為13.84%。

表3 與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的標(biāo)記P值及其對表型變異的解釋率Table 3 Significance and explained phenotypic variation of the marker associated with barley protein content

3 討 論

籽粒蛋白質(zhì)含量是衡量大麥品質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，如優(yōu)級啤麥、一級啤麥和二級啤麥對籽粒蛋白質(zhì)含量的要求分別是≤12.0%、12.0%～12.5%以及12.5%～13.5%[27]。本研究中，蛋白質(zhì)含量在9.0%～12.0%之間的材料共51份，占總材料的54.8%，而蛋白質(zhì)含量在12.0%～12.5%和12.5%～13.5%的分別包含7份和15份，分別占總材料的7.5%和16.1%，其蛋白質(zhì)含量均符合啤用大麥要求；蛋白質(zhì)含量大于13.5%的材料共17份，占總材料的18.3%，可食用和飼用。供試大麥蛋白質(zhì)含量為8.4%～15.8%，平均為11.7%，與許如根等[28]和馬得泉等[29]研究結(jié)果不同，這可能與供試大麥材料來源和數(shù)量有關(guān)，許如根等[28]僅選用國內(nèi)7個(gè)大麥品種，而本研究大麥材料來源更廣泛；馬得泉等[29]選用的是西藏野生大麥，而西藏野生大麥蛋白質(zhì)含量較高[30]。大麥籽粒蛋白質(zhì)含量不僅受基因型控制，還受其他因素影響，如氣象因子、栽培措施和環(huán)境條件等[31]，這些因素影響程度的確定還需進(jìn)行多年多點(diǎn)試驗(yàn)。

因群體結(jié)構(gòu)能增加染色體間的連鎖不平衡，致使目的性狀與不相關(guān)位點(diǎn)表現(xiàn)出關(guān)聯(lián)，即造成了偽關(guān)聯(lián)，因此關(guān)聯(lián)分析前需要進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析，進(jìn)而減少群體結(jié)構(gòu)對關(guān)聯(lián)分析結(jié)果的影響，避免人為因素對亞群劃分的影響，通過降低偽關(guān)聯(lián)概率提高關(guān)聯(lián)分析結(jié)果準(zhǔn)確性[32-33]。本研究中，經(jīng)群體結(jié)構(gòu)分析，供試材料被劃分為5個(gè)亞群，并將Q值作為協(xié)變量納入計(jì)算，在一定程度上降低了亞群混合造成的偽關(guān)聯(lián)概率[34]。蛋白質(zhì)含量相關(guān)QTL報(bào)道較少，只在2H、4H和5H上鑒定到，本研究經(jīng)GLM和MLM模型分析均將9個(gè)與蛋白質(zhì)含量相關(guān)的SSR標(biāo)記定位在3H、4H、5H、6H和7H上，只有標(biāo)記HVM40與Marquez-Cedillo等[4]結(jié)果一致，而其他8個(gè)標(biāo)記與前人研究結(jié)果差異較大，需進(jìn)一步驗(yàn)證標(biāo)記的可靠性。本研究中，MLM模型檢測到的關(guān)聯(lián)標(biāo)記對表型變異的解釋率較GLM中檢測到的關(guān)聯(lián)標(biāo)記對表型變異的解釋率低，主要原因可能是MLM模型不僅考慮群體結(jié)構(gòu)Q的影響，還考慮了親緣關(guān)系K對關(guān)聯(lián)分析的影響，結(jié)果比較準(zhǔn)確可靠。