呂亮杰，宿振起，孫麗靜，王莉梅，李 輝

(河北省農林科學院糧油作物研究所/河北省作物遺傳育種實驗室，河北石家莊 050035)

小麥(TriticumaestivumL.)是我國僅次于玉米和水稻的第三大糧食作物，其播種面積占全國耕地面積的20%～30%[1]。河北是我國重要的商品糧基地和小麥主產省，其小麥總產量和種植面積位居全國第三，發(fā)展河北優(yōu)質小麥對保障全國商品小麥的市場需求具有重要作用[2]。淀粉是小麥籽粒的主要成分，約占小麥籽粒重量的65%[3]，總淀粉含量和直、支鏈淀粉含量對小麥品質有重要影響[4]。近年來，國外對淀粉品質的研究越來越重視，特別是在面條加工和食用品質方面；國內關于小麥淀粉性狀的遺傳研究起步較晚，主要集中于淀粉含量[5-6]及淀粉糊化特性的遺傳規(guī)律[7-8]、淀粉含量的影響因素[9]及淀粉合成相關基因的定位[10-11]等方面。淀粉的合成途徑及參與合成的酶對小麥的淀粉品質有較大影響，其中淀粉合成過程中的酶直接影響淀粉的合成和直、支鏈淀粉的含量，進而影響淀粉粒的結構、淀粉理化特性，改變淀粉品質。一般認為ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉粒束縛淀粉合成酶(GBSS)和淀粉分支酶(SBE)對淀粉合成非常關鍵[12-13]，同時環(huán)境對淀粉合成也有較大的影響[14-15]。近年來的研究主要集中在與淀粉合成途徑相關的轉錄因子上。Zhu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，EREBP(乙烯反應元件結合蛋白)可以提高Waxy(GBSS顆粒結合淀粉合成酶)基因的轉錄水平。Rook等[17]發(fā)現(xiàn)apetala2-type蛋白能提高AGPL3(葡萄糖焦磷酸化酶大亞基)的轉錄水平。Fu等[18]通過基因探針共表達分析，發(fā)現(xiàn)一個與15個水稻淀粉合成相關基因表達負向調控有關的淀粉合成轉錄因子(Rice Starch Regulatory,RSR1)。然而，目前有關調控小麥籽粒淀粉合成的調控轉錄因子(wheat starch regulatory,WSR)的研究較少。

VIGS 是基于轉錄后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing,PTGS)引起內源mRNA 序列特異性降解發(fā)展起來的快速分析基因功能的新技術[19-20]。它通過整合部分靶基因表達序列的重組病毒侵染植物，引起植物內同源基因沉默，誘發(fā)表型變異進而實現(xiàn)基因的功能分析[20]。大麥條紋花葉病毒(barleystripemosaicvirus，BSMV)由于具有廣泛的寄主范圍而成為單子葉植物良好的VIGS沉默載體，為小麥和水稻等的基因功能研究提供了有效手段[21]。Scofield等[22]用BSMV-VIGS技術證明在抗葉銹病基因Lr21介導的抗性途徑中要有RAR1、SGT1和HSP90基因的參與。趙 丹等[23]利用該技術沉默小麥的TNBL1基因，沉默的YW642植株對黃矮病敏感，顯現(xiàn)感病癥狀。張立榮等[24]利用該技術證明小麥TaRAR1是抗葉銹病基因Lr24行使抗病作用所需要的。目前已證實BSMV-VIGS方法在小麥基因研究中的作用，但在小麥抽穗期對淀粉調控基因進行VIGS體系優(yōu)化的研究還有待進一步深入。

本研究以國審小麥品種冀麥325為材料，克隆小麥WSR1基因，并以小麥PDS(八氫番茄紅素脫氫酶)基因為指示基因，構建WSR1基因的BSMV-VIGS重組表達載體，進行小麥葉片和幼穗接種，再通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術，檢測WSR1基因在小麥籽粒發(fā)育期間的表達，以期初步闡明小麥WSR1基因對籽粒淀粉合成的影響，并為通過轉基因或分子標記輔助選擇來改善小麥品質、提高粒重和產量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為普通小麥品種冀麥325，該品種由河北省農林科學院糧油作物研究所培育。BSMV重組病毒載體α、β、γ和γ-PDS由中國農業(yè)科學院張增艷研究員惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1WSR1基因的克隆

以水稻RSR1基因(GenBank登錄號:JN192938)為探針，在NCBI-BLASTn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn)進行同源比對，獲得的同源片段為靶序列，設計引物W1-F:5′-TGAAGTTGCT GCTGAAGG-3′和W1-R:5′-CGATGACGAC GAGAAGAG-3′進行PCR擴增和基因克隆，以獲得的比對得分最高的片段為靶序列，按SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司，美國)說明書的要求，應用Primer Premier 6.0軟件，在其5′端設計反向特異引物WSR1-5:5′-GCCAGATTGGTGGATGCTCG GTCAGA-3′，在其3′端設計正向特異引物WSR1-3:5′-AGATGGTCGCAATCCCTCATC GATACCC-3′進行PCR擴增和基因克?。粚SR1基因5′RACE和3′RACE的測序結果進行拼接，根據(jù)拼接的全長序列，在其開放閱讀框兩端設計全長引物WSR1-F:5′-TCTTCTTGAA TCGTGAGGTT-3′和WSR1-R:5′-GCTGAGG TTAGTATCTGACA-3′進行PCR擴增和基因克隆。本研究涉及到的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2WSR1基因的生物信息學分析

用DNAMAN軟件對測序結果進行分析，用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和NCBI-ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找基因的保守結構域和開放閱讀框(ORF)。用GSDS(http://gsds.cbi. pku. edu. cn/)明確小麥WSR1基因的外顯子/內含子結構。用NCBI-BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對所克隆基因進行相似性比對和同源性分析，將比對結果輸入MAGE 7.0，采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統(tǒng)進化樹，其中， bootstrap值設置為1 000，其余均為默認參數(shù)。

1.2.3 VIGS載體構建

根據(jù)已克隆的WSR1基因的全長cDNA序列，選取2個不同位置，利用Primer Premier 6.0軟件設計帶有NheⅠ酶切位點和保護堿基的引物，擴增WSR1基因的沉默片段，其對應的擴增片段分別命名為V1和V2，V1為WSR1基因的保守區(qū)段，V2為WSR1基因的特異性區(qū)段。引物序列為V-WSR1-1F：5′-TACGCTAGCGTGT ACTTGGGTGGATTTGAC-3′，V- WSR1-1R：5′-TACGCTAGCTGACGCCTCTGTACTTGG AG-3′；V- WSR1-2F：5′-TACGCTAGCGGATA AGAGCAGCCTTGG-3′，V- WSR1-2R：5′-TAC GCTAGCCCTCCATGCCCAGGTTGGAA C-3′。用MluⅠ酶切α、γ、γ-PDS、γ-V1和γ-V2，SpeⅠ酶切β載體，酶切完成后，用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0(TaKaRa，日本)進行純化，將酶切完全的γ載體和沉默基因的片段進行連接；提取α、β、γ、γ-PDS、γ-V1和γ-V2的質粒并對其進行線性化，用RiboMAX Large Scale RNA Production Syetems-T7(Promega，美國) 和Ribo m7G Cap Analog(Promega，美國)對線性化產物進行體外轉錄。

1.2.4WSR1功能驗證

在小麥開花12 d后，選取生長健壯的小麥植株。將體外轉錄好的大麥條紋花葉病毒α、β和γ轉錄產物，各取10 μL混合后，加入2倍體積(60 μL)的DEPC水，再加入120 μL的GKP Buffer(50 mM甘氨酸,30 mM K2HPO4,pH 9.2,1%膨潤土,1%硅藻土)，制得總體積為210 μL的接種病毒混合液。接種時佩戴剛開封橡膠手套，用DEPC水處理過的槍頭取10 μL接種液放在食指上，一只手固定麥穗，另一手用大拇指和食指輕輕來回摩擦麥穗及葉片。接種20 min后向接種部位噴施DEPC水，保濕24 h。接種后每天觀察、記錄變化，并定期取材。

根據(jù)WSR1基因cDNA序列設計qRT-PCR(實時熒光定量PCR)引物WSR1RT-F：5′-TGAAGTTGCTGCTGAAGG-3′和WSR1RT-R：5′-CGATGACGACGAGAAGAG-3′，PDS-F:5′- TCGAAGGGTTCTATCTGG -3′和PDS-R:5′-CTACAACAATGTGGCAAT-3′；分別對田間對照冀麥325和接種后5、10、15、20和25 d的冀麥325取樣， -80 ℃保存。在Icycler iQ5 Real-time PCR儀(Bio-Rad，美國)上進行qRT-PCR分析，反應體系與程序參考SYBR Premix ExTaq Ⅱ(TaKaRa，日本)試劑盒說明書，試驗設置3個生物學重復和3個技術重復，采用2-△△Ct法計算相對表達量。

采用雙波長法測定籽粒直、支鏈淀粉含量,二者相加得出總淀粉含量。具體測定方法參照何照花[25]和戴 雙等[26]的方法并做適當調整。抗性淀粉測定方法參照 Megazyme RS assay kit(Megazyme International，愛爾蘭)試劑盒說明書并做適當調整,每個樣品測定三次求平均作為樣本值。

2 結果與分析

2.1 WSR1基因克隆結果

根據(jù)水稻RSR1基因的同源片段設計引物，以冀麥325的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在小于500 bp處有一條帶(圖1)，該目的條帶經測序大小為459 bp。為獲得WSR1基因的全長序列，以459 bp片段為靶序列，分別設計3′ RACE和5′ RACE引物，擴增后經瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)3′ RACE的擴增產物約為700 bp，5′ RACE擴增產物約為1 600 bp。將擴增片段回收克隆測序，3′RACE和5′RACE產物分別為710 bp和1 664 bp(圖1)，與靶序列的3′端和5′端均有重疊區(qū)，將3′RACE和5′RACE 序列進行拼接，得到長2 284 bp的拼接序列。

M：DL2000 marker；1：電子克隆PCR產物；2：3′ RACE 的PCR產物；3：5′ RACE的PCR產物。

2.2 WSR1基因在cDNA和DNA中的驗證

在拼接序列的3′末端和5′末端設計特異性引物WSR1-F和WSR1-R，以冀麥325的cDNA和DNA為模板，進行PCR擴增，擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在cDNA和DNA中分別擴增出一條2 000 bp和5 000 bp左右的條帶。經測序發(fā)現(xiàn)WSR1的cDNA長2 003 bp，DNA長4 316 bp(圖2)，測序結果和拼接序列基本一致。

2.3 WSR1基因的生物信息學分析

將所獲得的cDNA序列和DNA序列進行查找比較，結果表明，WSR1基因含8個外顯子和7個內含子(圖3)。用NCBI-ORF Finder查找拼接序列的ORF，結果顯示，該基因包含一個1 584 bp 的ORF，編碼527個氨基酸以及469 bp的5′非翻譯區(qū)(non translated region，UTR)和231 bp的3′UTR。SMART軟件分析結果表明，WSR1基因編碼蛋白的181～239和273～317 位的氨基酸是保守的AP2核苷酸結合域，屬于AP2/ERF家族基因(圖3)。

2.4 WSR1基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

經BLAST分析發(fā)現(xiàn)，小麥WSR1基因的編碼蛋白與粗山羊草(Aegilopstauschii)的一致性為96%，與大麥(Hordeumvulgare)的一致性為94%，與二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)的一致性為76%，與麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)、黍屬(Setaria)和栗(Castaneamollissima)的一致性為70%，與高粱(Sorghumbicolor)的一致性為66%。利用MAGE 7.0對WSR1蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)WSR1基因與大麥、山羊草、二穗短柄草的親緣關系比較近，與水稻、麻竹、高粱的親緣關系比較遠。

M：DL2000；C：cDNA的 PCR產物；D：DNA 的PCR產物。

圖3 WSR1基因的結構域和基因結構圖

圖4 WSR1基因及其編碼蛋白的系統(tǒng)進化樹

2.5 WSR1基因的功能分析

以加入NheⅠ酶切位點和保護堿基的引物V-WSR1-1F和V-WSR1-1R、V-WSR1-2F和V-WSR1-2R分別擴增WSR1基因上的目的片段(圖5A)，產物測序后驗證，已經成功引入酶切位點和保護性堿基，片段大小依次為220 bp和247 bp，并且序列沒有發(fā)生突變，與原始序列一致，2個片段分別命名為V1和V2。提取α、β、γ、γ-PDS質粒及γ-V1和γ-V2重組質粒并對其進行線性化，線性化后的質粒大約是6 kb的單一條帶(圖5B)，表明線性化成功。

在小麥開花12 d后，選取生長健壯的冀麥325，在穗部和葉片摩擦接種BSMV:00、BSMV:PDS、BSMV:V1和BSMV:V2，各接種20株。以BSMV:00為對照，以BSMV:PDS確保能將小麥的基因沉默。接種后每天觀察、記錄變化，并定期取材。發(fā)現(xiàn)接種BSMV:PDS的小麥在第5天開始出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，在第10天時，光漂白現(xiàn)象比較明顯，在第20 天時光漂白達到最大程度(圖6)，而接種BSMV:00的對照組卻沒有明顯變化，接種率達90%。

為確保接種BSMV:PDS后可引起PDS基因沉默，造成光漂白現(xiàn)象，提取接種小麥的RNA，反轉錄得到cDNA，對接種PDS基因的相對表達量進行分析。結果如圖7A，在接種BSMV:PDS后，小麥PDS基因的相對表達量顯著降低，接種后第5天下降了37%，第15天下降了75%，持續(xù)到第25天PDS基因的相對表達量仍保持低水平狀態(tài)，而接種BSMV:00的對照組卻沒有變化。證明在該條件下利用BSMV-VIGS技術可以引起小麥穗部基因的沉默。qRT-PCR檢測接種麥穗中WSR1基因的表達情況，如圖8所示，在接種了BSMV:V1和BSMV:V2后，WSR1基因的表達量，第5天下降了50%，第25天下降到了12%，說明沉默WSR1基因成功引起了基因相對表達量的下降。

H：λDNA/HindⅢ marker；M：Marker 2000； 1和2：擴增片段V1；3和4：擴增片段V2；5～10：α、β、γ、γ-PDS、γ-V1(S1)和γ-V2(S2)。

從左至右分別是：接種BSMV:00第15天的葉片，接種BSMV:PDS第5天、10天、20天的葉片。

淀粉含量測定結果如圖8所示，在接種了BSMV:WSR1之后，接種材料的直鏈淀粉含量由14.47% 增加到15.60%，千粒重由43.1 g增加到45.8 g。t測驗結果表明，直鏈淀粉含量、千粒重與對照的差異均達到極顯著水平。支鏈淀粉含量由43.95%增加到44.80%，總淀粉含量由58.42%增加到60.40%，抗性淀粉含量由1.53%增加到 1.76%。t測驗結果表明，支鏈淀粉含量、總淀粉含量、抗性淀粉含量與對照的差異均達到顯著水平。說明沉默WSR1基因后促進了淀粉合成，淀粉含量、千粒重增加。

3 討 論

植物AP2/ERF是一個龐大的轉錄因子基因家族，參與多種生物學過程，包括種子發(fā)育、植物生長、病菌防御、果實發(fā)育、高鹽、干旱等[27]。本研究利用同源克隆技術和RACE技術獲得了小麥WSR1基因的全長cDNA，生物信息學分析表明，該基因含有AP2保守結構域。與已克隆的WSR1基因所編碼的蛋白進行比較，發(fā)現(xiàn)WSR1基因所編碼的蛋白序列與大麥、山羊草、二穗短柄草的親緣關系比較近，與水稻、麻竹、高粱、擬南芥、大豆和苜蓿的親緣關系比較遠。因此推斷WSR1基因為AP2/ERF家族基因內調控種子中淀粉含量發(fā)育的轉錄因子。

*和**分別表示與對照的差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

AAC:直鏈淀粉含量; APC:支鏈淀粉含量;SC:總淀粉含量;RS:抗性淀粉。

BSMV-VIGS 技術的作用機制是 RNA 干擾，與研究基因功能的傳統(tǒng)方法相比具有高效、高通量、避免突變、克服基因功能重復等優(yōu)點；但它也存在誘導的靶基因未100%沉默、靶基因沉默不同步、沉默后被解除等局限性[28]。馬 猛[29]用BSMV-VIGS技術沉默小麥的PSD基因，以麥穗和籽粒作為接種的受體組織，將BSMV-VIGS技術應用到了小麥品質基因的研究上。李淼淼[30]也應用 BSMV-VIGS 技術誘導沉默了淀粉合成相關基因SBEⅡa和SSⅡa，抑制了淀粉的合成。利用摩擦接種時，由于局部摩擦不均或濃度不均勻及病毒擴展時效問題，可能導致病毒在穗部的發(fā)展不均，基因表達不盡相同。因此要排除穗部的部分區(qū)域感染病毒不均引起的實驗干擾。本研究探索了BSMV-VIGS技術在小麥穗部進行WSR1基因沉默的相對最優(yōu)條件，成功構建了WSR1基因的 BSMV 重組載體，并用實時熒光定量 PCR 從分子水平對實驗結果進行了驗證，同時還證明 BSMV-VIGS技術誘導淀粉合成轉錄因子沉默的方法是可行的。

小麥籽粒淀粉合成的主要場所是造粉體，光合產物以蔗糖的形式運輸?shù)胶铣善鞴俚呐呷榧毎?，然后水解形成葡萄?1-磷酸(G-1-P)，在造粉體內腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-Glc pyrophosphorylase,AGPase)催化其 ATP 反應生成腺苷二磷酸葡萄糖(ADP-glucose,ADPG)參與淀粉的合成。在造粉體內淀粉合成的最后階段還有 3 個關鍵調控酶：淀粉合成酶(starch synthase,SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)、淀粉脫分支酶(starch debranching enzyme,DBE)[31]。轉錄因子是能與目的基因5′端上游序列結合，調控目的基因時空表達功能的蛋白質，分為特異型和非特異性轉錄因子。它們既可以有選擇性的調控目的基因的表達；也可以對基因的轉錄表達調控沒有選擇性，如擬南芥的CBF1轉錄因子。本研究通過VIGS技術，在WSR1基因中選取2個不同部位的片段進行沉默，沉默的2個片段均影響了小麥淀粉的合成；在接種了BSMV:WSR1之后，直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量、總淀粉含量、抗性淀粉含量及千粒重均有顯著提高，表明冀麥325在接種WSR1基因后從表型上和內部組織中均表現(xiàn)出淀粉含量增高的現(xiàn)象，說明WSR1基因參與了小麥淀粉合成的過程，是抑制淀粉合成的轉錄因子。