賀 燕，唐小蘭，何 娟，王亮亮，肖 穩(wěn)，王曉慶

（湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南長(zhǎng)沙 410007）

蠶豆醬，也稱為豆瓣醬，是湖南岳陽地區(qū)家庭制作和食品企業(yè)生產(chǎn)的主要醬類產(chǎn)品，以去皮蠶豆為主要原料，經(jīng)蒸煮、自然接種或人工純種接種，發(fā)酵后拌以食鹽等其他調(diào)味料，經(jīng)調(diào)配之后形成的色香味俱全的調(diào)味品。永豐辣醬是湖南雙峰特產(chǎn)，以小麥為主要原料，通過自然接種制作曲醅，經(jīng)發(fā)酵、曬干、磨碎，再配以辣椒、食鹽、水等經(jīng)曬制而成。該產(chǎn)品氣味芳香、味道極鮮，含有豐富的蛋白質(zhì)及各種微量元素，并且具有促進(jìn)新陳代謝之功效[1]。蠶豆醬和永豐辣醬都屬于湖南人民餐桌上的上好調(diào)味品，但美中不足的是產(chǎn)品易發(fā)生黃曲霉毒素B1超標(biāo)、胖聽等質(zhì)量安全問題。其原因?yàn)閲?guó)內(nèi)發(fā)酵豆制品的生產(chǎn)模式以小作坊為主，發(fā)酵過程在開放的環(huán)境下進(jìn)行。另外，因原料在收貨和貯存過程中受外界環(huán)境的影響，產(chǎn)生黃曲霉毒素和污染其他微生物，導(dǎo)致胖聽和變質(zhì)現(xiàn)象[2]。試驗(yàn)擬以傳統(tǒng)蠶豆醬和永豐辣醬的曲胚、發(fā)酵半成品、成品等為對(duì)象，研究這2類特色醬類中的主要微生物，旨在從微生物的角度來尋求一條防控黃曲霉毒素B1超標(biāo)的途徑，為企業(yè)提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 樣品、培養(yǎng)基與試劑

1.1.1 樣品來源

蠶豆醬，岳陽市川康醬品有限公司、湖南省十三村食品有限公司、岳陽臨湘華一食品公司提供。

永豐辣醬，湖南湘軍永豐辣醬有限公司、湖南曾府辣醬有限公司、雙峰豐新農(nóng)業(yè)公司提供。

選取6個(gè)公司的原料、曲種，發(fā)酵半成品、發(fā)酵成品等25個(gè)樣品。

1.1.2 培養(yǎng)基、染色液及試劑

察氏培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（VRBA培養(yǎng)基）、棉蘭乳酚染色液、革蘭氏染色液；甲醇（色譜純），上海安譜有限公司提供；甲酸（AR），上海國(guó)藥有限公司提供。

1.1.3 霉菌種

標(biāo)準(zhǔn)米曲霉菌種CICC2358、標(biāo)準(zhǔn)總狀毛霉菌種CICC40531，中國(guó)菌種保存中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備

MIR-254型生化培養(yǎng)箱、VITEK2型細(xì)菌鑒定儀、80i型尼康顯微鏡、AB/SCIEX QTRAP 4500型液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蠶豆醬和永豐辣醬的優(yōu)勢(shì)微生物分析

（1）采樣中優(yōu)勢(shì)微生物的分離、純化、計(jì)數(shù)。優(yōu)勢(shì)微生物的研究擬采用稀釋平板分離計(jì)數(shù)法[3]。霉菌和酵母分離采用PDA和察氏培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基，大腸菌群采用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基，細(xì)菌采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。試驗(yàn)中樣品因有原料、曲胚、發(fā)酵半成品和成品，考慮到每種樣品含有的微生物不同，實(shí)際操作中宜進(jìn)行較高稀釋度的稀釋，特別是曲胚。

霉菌的分離和純化采用玻片插入培養(yǎng)方法。

（2）微生物的分類鑒定。根據(jù)霉菌培養(yǎng)的菌落特點(diǎn)及鏡檢孢子的微觀結(jié)構(gòu)，并結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》[4]，對(duì)醬類產(chǎn)品中的霉菌進(jìn)行分類鑒定。細(xì)菌經(jīng)純化之后采用VITEKⅡ型細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。

1.3.2 黃曲霉毒素B1測(cè)定

按照GB 5009.22—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物體系的組成分析

分別對(duì)蠶豆醬和永豐辣醬的醬胚、半成品和成品進(jìn)行分離計(jì)數(shù)后，按培養(yǎng)基和菌落特征進(jìn)行歸類，初步確定了兩大類醬類微生物體系的組成，以利于產(chǎn)品質(zhì)量控制的研究。

對(duì)蠶豆醬、永豐辣醬的醬胚、半成品和成品進(jìn)行了不同培養(yǎng)基的分離培養(yǎng)后。

蠶豆醬不同發(fā)酵階段微生物的組成見表1，永豐辣醬不同發(fā)酵階段微生物的組成見表2。

表1 蠶豆醬不同發(fā)酵階段微生物的組成

表2 永豐辣醬不同發(fā)酵階段微生物的組成

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蠶豆醬發(fā)酵過程中主要微生物體系組成為霉菌、細(xì)菌和酵母。由于采用了不同廠家的樣品，但主要微生物體系組成的結(jié)論一致，3種微生物的構(gòu)成比例在不同的發(fā)酵階段不同，出現(xiàn)了消長(zhǎng)的現(xiàn)象。不同廠家的醬類產(chǎn)品微生物不同發(fā)酵階段組成大同小異，源于相似的制曲工藝、發(fā)酵工藝、原料，因廠家生產(chǎn)環(huán)境、人員操作的差異而導(dǎo)致了個(gè)體在數(shù)量上的微小變化。醬類產(chǎn)品在不同階段出現(xiàn)霉菌、細(xì)菌、酵母消長(zhǎng)的現(xiàn)象。第一階段是霉菌迅速繁殖階段。經(jīng)人工純種接種或自然接種的前期制曲胚階段，接種的主要微生物是霉菌，并且培養(yǎng)的環(huán)境一般為28~30℃，此階段霉菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，并分泌各種的酶，如糖化酶、蛋白酶等，為后期的入池發(fā)酵準(zhǔn)備條件。第二階段是細(xì)菌和酵母迅速繁殖階段。在這個(gè)階段，工藝中一般添加了食鹽進(jìn)行發(fā)酵，較高濃度的食鹽和氧氣的缺乏，霉菌的生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)菌和酵母有所增長(zhǎng)[5]。第三階段是微生物生長(zhǎng)受抑制階段。由于代謝產(chǎn)物的積累，微生物生長(zhǎng)基本停止。從生產(chǎn)工藝來看，根據(jù)傳統(tǒng)的蠶豆醬和永豐辣醬制作工藝，有高溫曬制工藝，永豐辣醬的小麥曲有洗曲過程，這也是影響微生物體系組成的因素，特別是霉菌，在成品普遍檢出率不高。

2.2 微生物的鑒定

2.2.1 優(yōu)勢(shì)霉菌的鑒定[4，6]

分別選擇了PDA、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)霉菌在PDA、孟加拉紅培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較為好，從霉菌生長(zhǎng)的速度和菌落特征來看PDA和察氏培養(yǎng)基相當(dāng)，孟加拉紅可能因加入了抗生素，菌落個(gè)頭和數(shù)量較PDA和察氏培養(yǎng)基要小，這和有關(guān)培養(yǎng)基對(duì)酵母和霉菌檢測(cè)結(jié)果影響研究的結(jié)論一致[7]。

（1）永豐辣醬中優(yōu)勢(shì)霉菌菌落生長(zhǎng)形態(tài)及顯微形態(tài)特征。

永豐辣醬在PDA和孟加拉紅培養(yǎng)基上分離得到的霉菌見圖1，經(jīng)純化后的A菌落特征見圖2，菌落A顯微特征圖譜見圖3，經(jīng)純化后的B菌落特征見圖4，B菌落顯微鏡特征圖譜見圖5，標(biāo)準(zhǔn)米曲霉菌落形態(tài)及顯微特征圖譜見圖6。

圖1 永豐辣醬在PDA和孟加拉紅培養(yǎng)基上分離得到的霉菌

圖2 經(jīng)純化后的A菌落特征

圖3 菌落A顯微特征圖譜

圖4 經(jīng)純化后的B菌落特征

圖5 B菌落顯微鏡特征圖譜

圖6 標(biāo)準(zhǔn)米曲霉菌落形態(tài)及顯微特征圖譜

永豐辣醬經(jīng)孟加拉紅和PDA培養(yǎng)基進(jìn)行分離后主要得到2種優(yōu)勢(shì)霉菌（如圖1，圖2），經(jīng)純化分離后得到2種菌，即A，B，其特征分別描述為：①A菌落呈純白色厚絨狀的大菌落，生長(zhǎng)迅速，3 d后可布滿整個(gè)培養(yǎng)皿孢子呈黑色（圖2），肉眼可以看到菌絲上面分布著黑色孢子，發(fā)展成熟后，整個(gè)菌落呈深褐色，頂部基本上為黑色。其顯微鏡特征（圖3）：菌絲呈無色透明狀，無橫隔，孢子囊呈球形，分生孢子自頂囊全面著生，像菊花狀，表面略顯粗糙。參照齊組同編寫的《中國(guó)真菌志》第5卷曲霉屬及其相關(guān)有性型可步鑒定屬于曲霉屬中的黑曲霉。②B菌落2 d后長(zhǎng)成直徑為1.5~2.0 cm的白色菌落，3 d后菌落中間出現(xiàn)黃色小點(diǎn)，4 d后外圈有白色菌絲，中層為黃色，內(nèi)圈凸起且因有孢子原因呈現(xiàn)為黃綠色孢子，隨著進(jìn)一步的培養(yǎng)，孢子布滿整個(gè)菌絲上面，出現(xiàn)黃綠或藍(lán)綠色的菌落，如圖4菌落形態(tài)。在顯微鏡下觀察，分生孢子梗較長(zhǎng)，菌絲無色透明，頂囊粗大，近似橢圓形，小梗著生于頂囊上半部，分生孢子呈串著生在小梗的頂端（如圖5），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)米曲霉菌落形態(tài)及顯微特征（如圖6），同時(shí)參照齊組同編寫的《中國(guó)真菌志》第5卷曲霉屬及其相關(guān)有性型可步鑒定屬于曲霉屬中的米曲霉[8]。

永豐辣醬主要采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵，從分離和鑒定得到的霉菌菌系來看，主要是以黑曲霉和米曲霉為主。另因生產(chǎn)是開放的環(huán)境下進(jìn)行，對(duì)生產(chǎn)過程中微生物的污染不能有效控制，在抽檢的企業(yè)中存在個(gè)別其他霉，如青霉、黃曲霉菌，因而安全性會(huì)存在一定的問題。黑曲霉具有產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶系功能[9]。米曲霉是一類產(chǎn)復(fù)合酶的菌株，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等。永豐辣醬的原料主要為小麥、糯米等，這就需要產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、糖化酶能力強(qiáng)的霉菌來分解原料。辣醬前期制曲階段的霉菌菌相的組成，特別是有益曲霉屬的存在，成為直接決定辣醬產(chǎn)品發(fā)酵成功的關(guān)鍵。

（2）蠶豆醬中優(yōu)勢(shì)霉菌的菌落生長(zhǎng)形態(tài)及顯微形態(tài)特征。

蠶豆醬中不同培養(yǎng)時(shí)間的霉菌菌落特征見圖7，蠶豆醬主要霉菌顯微特征見圖8。

圖7 蠶豆醬中不同培養(yǎng)時(shí)間的霉菌菌落特征

圖8 蠶豆醬主要霉菌顯微特征

從湖南省岳陽地區(qū)抽取的3家企業(yè)10多個(gè)樣品中，經(jīng)多種真菌培養(yǎng)基上分離主要得到一種霉菌：在PDA上首先生長(zhǎng)為純白色，隨后菌落中間出現(xiàn)黃色小點(diǎn)，接著黃色孢子增多并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色孢子，隨著進(jìn)一步的培養(yǎng)，孢子布滿整個(gè)菌絲上面，出現(xiàn)黃綠色菌落，如圖7菌落形態(tài)。在顯微鏡下觀察，分生孢子梗較長(zhǎng)，菌絲無色透明，頂囊粗大，近似橢圓形，小梗著生于頂囊上半部，分生孢子呈串著生在小梗的頂端（如圖8），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)米曲霉菌落形態(tài)及顯微特征（如圖6），同時(shí)參照齊組同編寫的《中國(guó)真菌志》第5卷曲霉屬及其相關(guān)有性型可步鑒定屬于曲霉屬中的米曲霉[8]。

蠶豆醬分自然發(fā)酵的方法和純種接種發(fā)酵，自然發(fā)酵是指制曲的過程是在開放式條件下進(jìn)行。有研究表明，霉菌是在發(fā)酵過程中起主要作用的一類微生物，從醬曲中分離所得到的霉菌有黑曲霉、米曲霉、醬油曲霉、高大曲霉等[10]。為便于穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量，目前有很多廠家使用發(fā)酵劑純種進(jìn)行發(fā)酵。試驗(yàn)從抽取的3家企業(yè)從原料、發(fā)酵半成品、發(fā)酵成品分離的結(jié)果來看，分離得到的優(yōu)勢(shì)霉菌菌種為米曲霉，但也有個(gè)別企業(yè)的產(chǎn)品出現(xiàn)了其他霉菌，經(jīng)鑒定為黃曲霉菌。

2.2.2 引起永豐辣醬脹包現(xiàn)象的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的鑒定

永豐辣醬主要采用的是傳統(tǒng)自然發(fā)酵，在開放的環(huán)境下，易受到外界環(huán)境中微生物的污染，易產(chǎn)生脹包、變色等現(xiàn)象。針對(duì)企業(yè)提出的成品醬易出現(xiàn)脹包現(xiàn)象，試驗(yàn)對(duì)部分成品醬按照GB 4789的方法進(jìn)行了大腸菌群、細(xì)菌、霉菌和酵母的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸菌群和霉菌酵母均未檢出，菌落總數(shù)達(dá)到了108數(shù)量級(jí)。從菌落形態(tài)來看，存在著幾種優(yōu)勢(shì)菌，對(duì)優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行分離純化，經(jīng)革蘭氏染色后上VITEK2進(jìn)行生化鑒定，確定引起辣醬脹包現(xiàn)象的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為耶爾氏菌、甲基桿菌屬、魯沃夫不動(dòng)桿菌。

2.2.3 永豐辣醬中黃曲霉毒素B1含量

從3家不同的企業(yè)中抽取原料、半成品、成品進(jìn)行黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。

永豐辣醬原料、半成品、成品中黃曲霉毒素B1的含量見表3。

表3 永豐辣醬原料、半成品、成品中黃曲霉毒素B1的含量

永豐辣醬通常采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵，工藝路線基本相同，但是3個(gè)不同的企業(yè)卻出現(xiàn)截然不同的結(jié)果，特別是湖南C辣醬有限公司，抽取的3個(gè)醬都已超過國(guó)標(biāo)的限量要求5.0 μg/kg[11]，最高者達(dá)到了13.97 μg/kg。黃曲霉毒素是真菌毒素的一種，主要由黃曲霉和寄生曲霉2種真菌菌株產(chǎn)生，此外還有曲霉、青霉、根霉等。黃曲霉毒素是強(qiáng)致癌物質(zhì),是毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)[12]，毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍[13]。因而安全問題需引起高度重視。追溯到對(duì)湖南C辣醬有限公司成品醬的微生物特別是霉菌分析發(fā)現(xiàn)，此3個(gè)樣品除了有優(yōu)勢(shì)霉菌——米曲霉和黑曲霉之外，因?yàn)槁短彀l(fā)酵，還存在著其他的雜霉——經(jīng)鑒定為黃曲霉菌。黃曲霉菌廣泛存在于土壤、灰塵、植物及其果實(shí)上，辣醬在發(fā)酵過程中，要注意加工場(chǎng)所的環(huán)境條件，控制好發(fā)酵工作間的溫度和濕度，防止滋生其他雜菌，從來引起質(zhì)量安全問題。

2.2.4 蠶豆醬中黃曲霉毒素B1的含量

從3家不同的企業(yè)中抽取原料、半成品、成品，進(jìn)行黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。蠶豆醬主要采用的純種醬曲發(fā)酵，所以上文對(duì)蠶豆醬的霉菌分析主要為米曲霉且菌種比較單一。但個(gè)別廠家因生產(chǎn)環(huán)境差，特別是曲房多年未進(jìn)行清理，導(dǎo)致發(fā)酵過程中其他霉菌的滋生，從而影響產(chǎn)品的品質(zhì)。

蠶豆醬原料、半成品、成品中黃曲霉毒素B1含量見表4。

表4 蠶豆醬原料、半成品、成品中黃曲霉毒素B1含量

從表4中的結(jié)果來看，3家企業(yè)中岳陽市E醬品有限公司的發(fā)酵中間品黃曲霉毒素B1出現(xiàn)嚴(yán)重超標(biāo)現(xiàn)象，高者達(dá)到30.03 μg/kg。分析其原因，產(chǎn)品中霉菌種類除了優(yōu)勢(shì)菌米曲霉之外，還有黃曲霉菌，其中黃曲霉菌是產(chǎn)生黃曲霉毒素B1的一個(gè)來源。對(duì)于該企業(yè)，致使滋生黃曲霉菌的主要原因是曲房和生產(chǎn)環(huán)境條件惡劣，其次原料品質(zhì)、發(fā)酵工藝條件也能影響到黃曲霉毒素產(chǎn)生，已有研究[14]發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵溫度為30℃和32℃時(shí)黃曲霉毒素值最小。

3 結(jié)論

（1）通過對(duì)6個(gè)醬類生產(chǎn)企業(yè)從原料、曲胚、醬胚、半成品、成品的微生物分析，得出醬類產(chǎn)品不同發(fā)酵階段霉菌、酵母、細(xì)菌出現(xiàn)消長(zhǎng)的現(xiàn)象，這與發(fā)酵過程中不同階段的主要任務(wù)和代謝產(chǎn)物有關(guān)。

（2）根據(jù)霉菌菌落形態(tài)及顯微特征并結(jié)合有關(guān)霉菌鑒定書籍，對(duì)永豐辣醬和蠶豆醬中的主要霉菌進(jìn)行了鑒定，確定了永豐辣醬中主要的優(yōu)勢(shì)霉菌為米曲霉和黑曲霉，蠶豆醬中主要的優(yōu)勢(shì)菌為米曲霉。通過分析醬產(chǎn)品中主要優(yōu)勢(shì)霉菌，為企業(yè)控制好產(chǎn)品質(zhì)量提供了菌種知識(shí)的理論指導(dǎo)。

（3）利用VITEK2對(duì)易引起辣醬產(chǎn)品脹包現(xiàn)象的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，并確定引起辣醬脹包現(xiàn)象的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為耶爾氏菌、甲基桿菌屬、魯沃夫不動(dòng)桿菌。下一步應(yīng)對(duì)此3類菌進(jìn)行生理生化研究，并對(duì)其進(jìn)行防腐條件的探索，有望解決醬制品中易出現(xiàn)脹包的質(zhì)量問題。

（4）從醬類企業(yè)的原料、半成品和成品的黃曲霉毒素B1的監(jiān)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃曲霉毒素B1嚴(yán)重超標(biāo)的問題主要是發(fā)酵過程中滋生了黃曲霉菌。醬料生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)注意曲房等環(huán)境條件，在制曲和發(fā)酵過程中控制好溫度和濕度，促進(jìn)優(yōu)勢(shì)霉菌的生長(zhǎng)，防止其他雜菌的滋生，同時(shí)嚴(yán)把原料關(guān)，以防止黃曲霉毒素的污染。此外，國(guó)內(nèi)外在進(jìn)行黃曲霉毒素的防控方面有物理、化學(xué)、生物技術(shù)進(jìn)行脫毒處理研究[15]。下一步，若能將這些研究將應(yīng)用到醬類產(chǎn)品中黃曲霉毒素B1的脫毒處理上，將會(huì)極大地推動(dòng)醬類產(chǎn)品的發(fā)展。