周懿，鄭浩，楊遠(yuǎn)，洪永剛，郝立強(qiáng)，林輝

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miR-199a通過靶向CTGF抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移

周懿，鄭浩，楊遠(yuǎn)，洪永剛，郝立強(qiáng)，林輝

200438 上海市楊浦區(qū)市東醫(yī)院普外一科（周懿、林輝）；200438 上海，海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝外三科（鄭浩、楊遠(yuǎn)）；200438 上海，海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外二科（洪永剛、郝立強(qiáng)）

旨在探討 miR-199a 在結(jié)直腸癌（CRC）發(fā)生過程中的分子機(jī)制。

用 miR-199a 模擬物轉(zhuǎn)染至 CRC 細(xì)胞系。通過 MTT 和 Transwell 實(shí)驗(yàn)鑒定 CRC 細(xì)胞的增殖和遷移能力。Western blot 和 qRT-PCR 檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平。雙熒光素酶法報(bào)告實(shí)驗(yàn)鑒定 miR-199a 與結(jié)締組織生長因子（CTGF）的作用關(guān)系。

miR-199a 在 CRC 細(xì)胞系中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá) miR-199a 可以顯著抑制 CRC 的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和血管生成。CTGF 是 miR-199a 的直接靶點(diǎn)。過表達(dá) CTGF 可抵消 miR-199a 對 EMT 和血管生成的抑制作用。

miR-199a 通過直接靶向 CTGF 抑制 CRC 細(xì)胞的 EMT 和血管生成。

結(jié)直腸腫瘤； 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化； 結(jié)締組織生長因子； miR-199a

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者預(yù)后不理想的重要原因[1]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和血管新生被認(rèn)為在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用[2-3]。新生的血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供了豐富的營養(yǎng)，也為癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供了途徑[4]。

microRNAs（miRNAs）是一種保守的小的非編碼 RNAs，通過轉(zhuǎn)錄后水平，miRNAs 可特異性結(jié)合 mRNAs 的 3'-未翻譯區(qū)（UTR）來調(diào)控基因表達(dá)[5]。miRNAs 的異常表達(dá)已證實(shí)在多種類型的腫瘤中發(fā)揮著重要作用[5]。研究表明 miR-199a 在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，例如 miR-199a 可下調(diào) HIF1α 抑制腫瘤細(xì)胞生長[6]；通過抑制 Yes 相關(guān)蛋白 1（YAP1）促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]；在肝細(xì)胞癌（HCC）中，miR-199a 可通過調(diào)控 MTOR、CD44和 MET 的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對阿霉素的敏感[8-9]。最近，已證實(shí) miR-199a通過靶向 VEGFA 及其受體抑制肝癌的生長、遷移、侵襲和血管生成[10]。然而，miR-199a 在結(jié)直腸癌的 EMT 和血管新生中的作用和機(jī)制尚不完全了解。

1 材料與方法

1.1 材料

164 例結(jié)直腸癌組織和配對的相鄰癌旁組織來自于 2013 年 1 月– 2015 年 12 月在海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外二科進(jìn)行根治手術(shù)的結(jié)直腸癌患者。癌旁組織距離癌灶邊緣超過 5 cm。標(biāo)本和相應(yīng)的鄰近組織來自同一結(jié)直腸癌患者。由本院擁有 5 年以上經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師檢查每個(gè)組織樣本確認(rèn)組織類型。術(shù)后腫瘤組織立即凍存于–80 ℃液氮中備用?；颊咴谑中g(shù)前沒有接受任何治療。本研究經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)且所有患者均簽署知情同意書。

人結(jié)直腸癌細(xì)胞系（SW620、SW480、HCT8 和 HCT116）、人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系（NCM460）以及 HEK-293T 細(xì)胞系來自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；胎牛血清購自美國Invitrogen 公司；1% 青霉素/鏈霉素購自美國Thermo Fisher 公司；miR-199a 陰性對照（NC）或模擬物（mimic）轉(zhuǎn)染試劑購自廣州銳博公司；lip2000、Trizol 和M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自美國Invitrogen 公司；重組人結(jié)締組織生長因子（CTGF）蛋白購自美國Abcam 公司；實(shí)時(shí) PCR 試劑盒購自日本Takara 公司；Transwell 板購自美國BD Biosciences 公司；一抗抗體 GAPDH 和波形蛋白均購自美國Cell Signaling Technology 公司；β-actin、E-cadherin、α-catenin、纖連蛋白、VEGFA 和ANGPT2 均購自美國 Abcam 公司；Real-Time Thermocycler 7500 PCR 儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；酶標(biāo)儀購自美國BioTek Instruments 公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 所有細(xì)胞系在 DMEM 培養(yǎng)基中加入 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/鏈霉素，在 37 ℃，5% CO2下孵育。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將 2.5 × 105SW620 和 HCT116 細(xì)胞接種于 6 孔板中培養(yǎng)過夜，然后用 50 nmol/L miR-199a 陰性對照（NC）或模擬物（mimic）轉(zhuǎn)染，根據(jù)產(chǎn)品說明書，使用 lip2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。濃度為 10 ng/ml 的CTGF蛋白加入培養(yǎng)基中，30 min 后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 qRT-PCR 檢測 根據(jù)說明書用 Trizol 試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總 RNA。用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA。使用 SYBR Green 實(shí)時(shí) PCR 試劑盒進(jìn)行 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)。以 U6 和 GAPDH 分別作為 miRNA 和 mRNA 基因的內(nèi)參基因。使用 2?ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。

引物序列為：VEGFA：上游 5' CACCCACCCA CATACATAC 3'，下游 5' CATCTCCTCCTCTTC CCT 3'；ANGPT2：上游 5' CTTATGAGCGAGAATG GG 3'，下游 5' TAGGTTGTTGGGTTGTTT 3'；CTGF：上游 5' ACGGATTTGGTCGTATTG 3'，下游 5' GGAAGATGGTGATGGGATT 3'；GAPDH：上游 5' AACGGATTTGGTCGTATTG 3'，下游 5' GGAAGATGGTGATGGGATT 3'；每個(gè)樣本中 miRNA 和 mRNAs 的相對表達(dá)水平均重復(fù)檢測3 次。

1.2.3 MTT 實(shí)驗(yàn) 用 3-(4,5-二甲基噻唑-2 基)-2,5-二苯基四唑溴化銨（MTT）實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞生長速率。以每孔 3? × ?103接種細(xì)胞于 96 孔板中并過夜培養(yǎng)。洗板后，分別在 0、24、48、72 h 加入 0.5 mg/ml MTT。4 h 后除去培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解晶體。利用酶標(biāo)儀在 490 nm 波長下測量吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn) 將 1.0? × ?105個(gè)細(xì)胞置于 Transwell 板的上層。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在下層培養(yǎng)基中加入 10% 胎牛血清。24 h 培養(yǎng)后，將殘留在上層的細(xì)胞去除，通過膜遷移的細(xì)胞用 20% 甲醇和 0.1% 結(jié)晶紫的染料溶液染色。然后在光學(xué)顯微鏡下拍照，并對每個(gè)玻片的十個(gè)單獨(dú)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) 具體實(shí)驗(yàn)操作過程依照參考文獻(xiàn)[6]。文中所用抗體為 GAPDH（1:1000），β-actin（1:1000），E-cadherin（1:1000），α-catenin（1:1000），波形蛋白（1:1000），纖連蛋白（1:1000），VEGFA（1:1000）和 ANGPT2（1:1000）。

1.2.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 具體實(shí)驗(yàn)操作過程依照參考文獻(xiàn)[6]和試劑說明書進(jìn)行，文中報(bào)告基因購自上海吉馬生物制藥有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 18.0 版進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組之間的差異分析使用檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 miR-199a 在 CRC 中顯著下調(diào)表達(dá)

為了研究 miR-199a 在 CRC 中的表達(dá)情況，通過 qRT-PCR 分析了 164 對腫瘤組織和匹配的癌旁組織中 miR-199a 的表達(dá)水平，結(jié)果提示其在腫瘤組織中表達(dá)顯著下調(diào)（圖 1A）。同時(shí)不同分期的腫瘤標(biāo)本中 miR-199a 水平也發(fā)生了變化，miR-199a 在 I、II 期 CRC 患者的腫瘤組織的表達(dá)量高于 III、IV 期 CRC 患者的腫瘤組織的表達(dá)量（圖 1B）。接下來通過 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測 miR-199a 在 CRC 細(xì)胞系（SW480、SW620、HCT8、HCT116）以及正常的結(jié)腸上皮細(xì)胞系（NCM460）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與 NCM460相比，miR-199a 在 CRC 細(xì)胞系中均下調(diào)表達(dá)（圖 1C）。為了確定 miR-199a 在 CRC 細(xì)胞系中的生物學(xué)功能，選擇 SW620 和 HCT116 進(jìn)行進(jìn)一步研究。分別將 miR-199a mimic 和 NC 轉(zhuǎn)染至 SW620 和 HCT116 細(xì)胞系中，應(yīng)用 qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系中 miR-199a 的表達(dá)水平，轉(zhuǎn)染后 miR-199a mimic 組細(xì)胞系的 miR-199a 表達(dá)水平明顯高于NC 組細(xì)胞系（圖 1D）。

圖 1 miR-199a 在 CRC 細(xì)胞系和組織中表達(dá)下調(diào)[A：與相鄰癌旁組織相比，CRC 患者標(biāo)本中 miR-199a 水平明顯下降（n = 164）；B：miR-199a 在 III-IV 期 CRC 腫瘤（n = 85）中表達(dá)水平較 I-II 期 CRC 腫瘤中表達(dá)顯著降低（n = 79）；C：與人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞系 NCM460 相比，CRC 細(xì)胞系 SW620、SW480、HCT8、HCT116 中 miR-199a 的表達(dá)明顯下降；D：與對照組相比，轉(zhuǎn)染 miR-199a 模擬物后 SW620 和 HCT116 中的 miR-199a 水平顯著提高；**P?

Figure 1 miR-199a was down-regulated in CRC cell lines and tissue [A: Levels of miR-199a were obviously decreased in CRC patients' samples, compared to adjacent normal tissues (n = 164); B: In the III-IV stage CRC tumors (n = 85), miR-199a was dramatically decreased compared to I-II stage CRC tumors (n = 79); C: Compared to human normal colon epithelial cell line NCM460, miR-199a expression was significantly decreased in CRC cell lines, including SW620, SW480, HCT8, and HCT116; D: Transfection with miR-199a mimics significantly increased its level in SW620 and HCT116, compared to control groups;**

2.2 在體外 miR-199a 可以抑制 CRC 的增殖和遷移

miR-199a 對 CRC 增殖和遷移的影響，如圖 2A 和 2B 所示，與 NC 組相比，過表達(dá) miR-199a 在不同時(shí)間點(diǎn)顯著抑制 SW620（48 和 72 h）和HCT116（48 和 72 h）的增殖能力。Transwell 實(shí)驗(yàn)中，與 NC 組對比，過表達(dá) miR-199a 后 SW620 和 HCT116 遷移能力均下降（圖 2C 和 2D）。綜上所述，以上結(jié)果提示 miR-199a 在體外顯著抑制 CRC 細(xì)胞的增殖和遷移能力。

2.3 miR-199a 調(diào)控與 EMT 和血管生成相關(guān)的蛋白

為了確定 miR-199a 對 CRC 進(jìn)展的機(jī)制，檢測了其與 EMT 和血管生成相關(guān)的蛋白表達(dá)水平。如圖 3A 所示，與 NC 組相比，過表達(dá) miR-199a 后顯著提高了 SW620 和 HCT116 細(xì)胞中 E-cadherin 和 α-catenin 蛋白表達(dá)水平，同時(shí)降低了波形蛋白和纖連蛋白的表達(dá)水平。在血管生成過程中，過表達(dá) miR-199a 明顯抑制 SW620 和 HCT116 中 VEGFA和 ANGPT2 蛋白表達(dá)水平，這些蛋白在腫瘤血管生成中起重要作用（圖 3B）。qRT-PCR 檢測 VEGFA 和 ANGPT2 的 mRNA 水平也有相同趨勢（圖 3C）。這些結(jié)果表明，miR-199a 通過調(diào)控與 EMT 和血管生成相關(guān)的基因來抑制 CRC 進(jìn)展。

2.4 miR-199a 直接靶向 CTGF 抑制 CRC 的進(jìn)展

通過在線預(yù)測軟件 Targetscan（http://www. targetscan.org/vert_72/）提示 CTGF 是 miR-199a 的下游靶基因，因此通過一系列的分子學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證 miR-199a 是否直接調(diào)控 CTGF 的表達(dá)。qRT-PCR 和 Western blot 結(jié)果表明，過表達(dá) miR-199a 可以抑制 SW620 和 HCT116 細(xì)胞系中 CTGF 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平（圖 4A 和 4B）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 miR-199a 是否能與 CTGF的3'UTR 結(jié)合，包含 miR-199a 與 CTGF 3'UTR 結(jié)合位點(diǎn)野生型和突變型的序列被克隆到報(bào)告基因（圖 4C）。如圖 4D 所示，過表達(dá) miR-199a 顯著抑制了野生型 CTGF 3'UTR 的熒光素酶活性，而對突變型 CTGF 3'UTR 的熒光素酶活性無任何影響。這些結(jié)果證明 miR-199a 通過與 CTGF 3'UTR 結(jié)合抑制其在 CRC 細(xì)胞系中的表達(dá)。

圖 2 miR-199a 在體外可以抑制 CRC 的增殖和遷移[A、B：轉(zhuǎn)染 miR-199a 模擬物后，SW620（A）和 HCT116（B）的增殖能力明顯低于對照組；C、D：Transwell 實(shí)驗(yàn)中過表達(dá) miR-199a 可以明顯抑制 CRC 細(xì)胞遷移能力；*P < 0.05，***P < 0.001]

Figure 2 miR-199a inhibits CRC proliferation and migration[A, B: When transfected with miR-199a mimic, the growth rate of SW620 (A) and HCT116 (B) was remarkably inhibited compared to control groups; C, D: Over expression of miR-199a could obviously suppress the ability of CRC cells migration by Transwell assay;*< 0.05,***< 0.001]

在 SW620 和 HCT116 培養(yǎng)基中加入重組 CTGF。研究結(jié)果表明，過表達(dá) CTGF 抵消了過表達(dá)miR-199a 產(chǎn)生的對 EMT 和血管生成的抑制作用，表現(xiàn)為 E-cadherin 以及 α-catenin 蛋白質(zhì)減少，和波形蛋白、纖連蛋白、VEGFA 和 ANGPT2 蛋白質(zhì)水平的增加（圖 4E 和 4F）。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了miR-199a 通過直接抑制 CTGF 表達(dá)抑制 CRC 進(jìn)展的觀點(diǎn)。

3 討論

miRNAs 是一類小的非編碼 RNAs，通常為 18 ~ 22 個(gè)核苷酸，于 20 世紀(jì) 90 年代在線蟲中首次被發(fā)現(xiàn)[6]。迄今為止，已經(jīng)在人類中鑒定出 1000 多個(gè) miRNAs，其通過靶向 mRNAs 來調(diào)控基因表達(dá)從而在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和血管生成過程中發(fā)揮重要作用[11]。許多 miRNAs 已被證實(shí)為腫瘤抑制因子，這些 miRNAs 水平的失調(diào)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，例如：miR-23b 通過靶向 MAPK 通路抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[12]；miR-190 通過直接靶向 VEGF 抑制腫瘤血管生成[13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn) miR-199a 在 CRC 腫瘤組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)表達(dá)，過表達(dá) miR-199a 可以抑制 CRC 細(xì)胞的增殖、遷移和集落形成。表明 miR-199a 可能是 CRC 發(fā)生和發(fā)展中的抑制因子，有望成為一個(gè)潛在的 CRC 治療的分子靶點(diǎn)。

圖 3 在 SW620 和 HCT116 中，miR-199a 的過表達(dá)可以增加 E-cadherin 和 α-catenin 的表達(dá)水平，同時(shí)降低波形蛋白和纖連蛋白的表達(dá)水平（A）；過表達(dá) miR-199a 顯著抑制 SW620 和 HCT116 中 VEGFA 和 ANGPT2 的蛋白（B）和 mRNA（C）的表達(dá)（n = 3），***P < 0.001

Figure 3 Over expression of miR-199a could increase the level of E-cadherin and α-catenin, while decrease the expression of vimentin and fibronectin in SW620 and HCT116 (A); Up regulation of miR-199a significantly inhibited the protein (B) and mRNA (C) levels of VEGFA and ANGPT2 in SW620 and HCT116 (n = 3),***< 0.001

EMT 和血管生成在腫瘤遷移和侵襲中起著關(guān)鍵作用[14-16]，本研究中揭示了 miR-199a 在 CRC 中可以調(diào)控 EMT 相關(guān)的蛋白標(biāo)志物，在轉(zhuǎn)染miR-199a 類似物后 E-cadherin 和 α-catenin 蛋白的表達(dá)增加，而波形蛋白和纖連蛋白的表達(dá)量明顯減少，同時(shí)過表達(dá) miR-199a 明顯抑制 CRC 細(xì)胞中 VEGFA 和 ANGPT2 蛋白表達(dá)水平，提示 miR-199a 在 EMT 和血管生成中發(fā)揮重要作用。由于 miRNAs 通常調(diào)控多個(gè)基因，因此確定其在 CRC 中的靶點(diǎn)非常重要。通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)和在線預(yù)測數(shù)據(jù)庫，我們選擇 CTGF 作為研究對象。以往的研究表明 CTGF 在 EMT 和血管生成過程中都起著重要的作用。CTGF 為 TGF-β 的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，能夠與其他生長因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)相互作用發(fā)揮重要生物學(xué)作用[17]。在 CRC 中 TGF-β 能夠促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致術(shù)后患者預(yù)后不良[18-19]。已報(bào)道，CTGF 可通過調(diào)控 KLF4 蛋白表達(dá)促進(jìn)川崎病的 EMT 進(jìn)程[20]。血管生成過程中，CTGF 已被證實(shí)是 ANGPT2 表達(dá)的調(diào)控因子，而后者是腫瘤血管生成的關(guān)鍵因素[21]。研究報(bào)道證實(shí)抑制 CTGF 蛋白表達(dá)能顯著降低體內(nèi)腫瘤的生長[22]和血管生成[21]。在本研究中，首次通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測證實(shí) CTGF 為 miR-199a 的直接靶點(diǎn)，在 CRC 細(xì)胞系中過表達(dá) miR-199a 可以顯著抑制 CTGF 的 mRNA 和蛋白表達(dá)。為了確定 CTGF 在調(diào)控 miR-199a 介導(dǎo)中 CRC 增殖和遷移的作用，我們直接用 CTGF 蛋白處理 CRC 細(xì)胞，Western blot 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，提高 CTGF 可以抵消 miR-199a 對 EMT 和血管生成的抑制作用。這些數(shù)據(jù)表明，miR-199a 通過直接抑制 CTGF 表達(dá)從而抑制CRC 細(xì)胞的 EMT 和血管生成的過程。

圖 4 CTGF 是 miR-199a 的直接靶點(diǎn)，可以抵消其對 CRC 進(jìn)展的抑制作用[miR-199a 能夠抑制 CTGF 的mRNA（A）和蛋白（B）表達(dá)；C、D：過表達(dá) miR-199a 降低了 CTGF 3'-UTR WT 熒光素酶活性，而未改變突變的CTGF 3'-UTR MUT 中熒光素酶活性；E：提高 CTGF 抵消了過表達(dá) miR-199a 對 EMT 相關(guān)蛋白的抑制作用；F：提高 CTGF 抵消了過表達(dá) miR-199a 對 VEGFA 和 ANGPT2 的抑制作用；**P < 0.01]

Figure 4 CTGF was a direct target of miR-199a and could restore its inhibition effects on CRC progression [miR-199a was able to suppress the mRNA (A) and protein (B) expression of CTGF; C, D: miR-199a could inhibit the luciferase reported activity to 50%, demonstrating that it directly targeted CTGF; E: CTGF treatment rescued the inhibition effects on EMT associated proteins brought by miR-199a over expression; F: CTGF treatment restored the inhibition effects on VEGFA and ANGPT2 brought by miR-199a over expression;**< 0.01]

綜上所述，本研究表明 miR-199a 在 CRC 腫瘤組織中下調(diào)表達(dá)，抑制了 CRC 細(xì)胞的增殖和遷移能力。一系列的體外分子實(shí)驗(yàn)證實(shí) CTGF 是miR-199a 的直接靶點(diǎn)，miR-199a 通過直接抑制 CTGF 表達(dá)來抑制 CRC 細(xì)胞的 EMT 和血管生成。這些結(jié)果表明 miR-1297 可能是一個(gè)新的 CRC 治療靶點(diǎn)。

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miR-199a inhibited colorectal cancer proliferation and migration via targeting CTGF

ZHOU Yi, ZHENG Hao, YANG Yuan, HONG Yong-gang, HAO Li-qiang, LIN Hui

First Department of Surgery, Shidong Hospital, Shanghai 200438, China (ZHOU Yi, LIN Hui); Third Department of Hepatic Surgery, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China (ZHENG Hao, YANG Yuan); Second Department of Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China (HONG Yong-gang, HAO Li-qiang)

microRNAs are expressed abnormally in colorectal cancer (CRC) and could participate in its development. In the study, we aimed to explore the molecular mechanisms of miR-199a in the genesis of CRC.

CRC cell lines were transfected with miR-199a mimics. Proliferation and migration were identified by MTT assay and Transwell assay, respectively. Protein and mRNA expression levels of associated genes were measured by Western blot and qRT-PCR, respectively. Dual luciferase assay was used to determine the relation of miR-199a and CTGF.

miR-199a was down-regulated in CRC cell lines and over expression of miR-199a significantly inhibited EMT and angiogenesis. CTGF was a direct target of miR-199a. Up regulation of CTGF level sufficiently reversed the suppression effects of miR-199a on EMT and angiogenesis.

miR-199a directly targets CTGF and inhibits its expression, leading to suppression on EMT and angiogenesis of CRC cells. miR-199a might be used as potential therapeutic strategy for CRC treatment.

Colorectal neoplasms; Epithelial-mesenchymal transition; Connective tissue growth factor; miR-199a

LIN Hui, Email:linhui9981@126.com

上海市楊浦區(qū)科學(xué)技術(shù)委員會及衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會立項(xiàng)資助（YP18M05）；上海市楊浦區(qū)重點(diǎn)學(xué)科計(jì)劃+胃腸道腫瘤微創(chuàng)專科（YP16ZA05）

林輝，Email：linhui9981@126.com

2019-01-07

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.007