張夢然，劉金梅，弓建華，劉秀均

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壞死性凋亡與腫瘤治療

張夢然，劉金梅，弓建華，劉秀均

100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所腫瘤室（張夢然、弓建華、劉秀均）；250022 濟南，山東特殊教育職業(yè)學院（劉金梅）

在多細胞生物個體中，細胞增殖和死亡之間的動態(tài)平衡是維持生物體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的必要條件，也是生物體生長發(fā)育的重要條件之一。當體內細胞過度增殖或細胞正常死亡受到抑制時，惡性腫瘤的發(fā)生率大大增加。因此，有研究者認為，惡性腫瘤的兩大顯著特征為細胞無限增殖和死亡抑制[1]。在傳統(tǒng)意義上，人們將細胞的死亡分為調控型和非調控型兩類。然而，近年來研究發(fā)現(xiàn)，細胞壞死也可以像細胞凋亡一樣受到遺傳物質的調控，這是一種新型的細胞死亡機制。因其由基因控制但細胞形態(tài)表現(xiàn)為細胞壞死，所以又稱為壞死性凋亡，并且其調控過程不經含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）介導。大量的研究證明，壞死性凋亡或程序性壞死在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移以及耐藥中發(fā)揮著重要的作用。本文將對壞死性凋亡機制及其有別于凋亡、壞死等的特點，在腫瘤治療中的潛在應用等做簡單闡述，以期為腫瘤治療提供新靶點、新思路。

1 壞死性凋亡是一種重要的細胞死亡形式

隨著研究的深入，越來越多的細胞死亡方式被發(fā)現(xiàn)和命名，例如凋亡、壞死、自噬、裂亡、脹亡、類凋亡、鐵凋亡及壞死性凋亡等[2]。凋亡和壞死是人們認識最早也是最經典的兩種細胞死亡方式。前者作為一種由遺傳基因控制的細胞自主、有序的死亡方式，不僅是生物體內絕大多數(shù)細胞在特定的生長發(fā)育階段都會發(fā)生的現(xiàn)象，而且是生物體內細胞保持正?；钚院凸δ鼙夭豢缮俚倪^程。與凋亡不同的是，壞死一般情況下被認為是非可控的，是從形態(tài)學上的特點來定義的一種死亡方式。外界抑制因素過強可直接引起壞死，是一種受環(huán)境影響的細胞被動死亡。然而，近年來的研究表明，細胞壞死也可以受到細胞內信號傳導通路調控，它可以不經 caspase 介導，因此在凋亡通路被抑制時仍然可以發(fā)揮作用，其細胞形態(tài)學表現(xiàn)與常規(guī)壞死一致。2005 年，Degterev等[3]首次發(fā)現(xiàn)并命名了受調節(jié)的壞死。這其中包含多種方式，如繼發(fā)性壞死、自死亡、鐵凋亡、細胞焦亡、PARP-1 依賴性細胞死亡、壞死性凋亡、親環(huán)素壞死等。其具有壞死的形態(tài)學特征，如細胞核碎裂、細胞和細胞器腫脹以及細胞質膜破裂等。

越來越多的研究表明，壞死性凋亡是一種重要的細胞死亡機制。在許多免疫系統(tǒng)疾病、慢性腎臟病、腦缺血、心肌缺血、急性和慢性神經退行性疾病、腫瘤等多種人類病理活動中具有重要作用[4-5]。

2 壞死性凋亡的胞內分子機制

細胞的壞死性凋亡是一個機體主動的、依賴細胞內信號轉導的過程，由相應配體通過激活死亡受體而觸發(fā)。與 Fas 蛋白的死亡結構域相似，這一細胞內的結構域是種附屬信號蛋白的結合位點，這些蛋白包括 Fas 相關死亡區(qū)段結合蛋白（FADD）、TNFR-1 相關死亡區(qū)段結合蛋白（TRADD）和 TNFR 相關因子 2（TRAF2）。其中，細胞內 caspase 活性是否受到抑制是壞死性凋亡能否被完全激活的關鍵因素。

2.1 壞死性凋亡的上游信號

壞死性凋亡與凋亡有著共同的上游信號元件，其中研究最多最深入的是腫瘤壞死因子受體 1（TNFR1，又稱作 p60、p55、CD120a）。TNFR1 又稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員 1A（TNFRSF 1A），是一種普遍存在的膜受體，屬于死亡受體的一種。死亡受體是在細胞膜表面發(fā)現(xiàn)的一組細胞表面標記，是指在腫瘤壞死因子受體超家族中含有死亡結構域的成員，例如 TNFR1、Fas 受體 DR4 和DR5[6]，與相應的配體結合后，可以通過自身結構的變化，將胞外信號向細胞內部傳遞。TNFR1 上面的死亡結構域是一段約 70 個氨基酸的序列，這對于 TNF-α 啟動細胞凋亡是必需的。此外 TNFR1 還可以與銜接蛋白 TNF 受體相關的死亡結構域蛋白（TRADD）和 TNF 受體相關因子（TRAF2）相互作用，并在受體介導的信號轉導中發(fā)揮調節(jié)作用。

如圖 1 所示，TNF-α 首先與細胞膜上受體 TNFR1 結合，從而觸發(fā) TNF-α 的三聚化以及 TNFR1 的胞內結構域相關complex I 的組裝，其中 complex I 是由 TRADD、TRAF2、胞內凋亡蛋白抑制因子 1（cIAP1 / 2）和受體相互作用蛋白 1（RIP1）組成。在 complex I 中，對活性調控起著關鍵作用的是 cIAP1、cIAP2 及 RIP1 等分子的泛素化，在不同情況下會激活下游不同的信號通路，并決定細胞的最終結局是存活、凋亡還是壞死性凋亡[7]。

2.2 complex I 的激活

在 complex I 的激活中，RIP1 作為關鍵蛋白首先被多種泛素化迅速修飾，然后泛素化的 RIP1 作為 IKK 復合體調節(jié)亞基（NEMO）和轉化生長因子激酶 1（TAK1）招募的支架，可以分別引起 NF-κB 和 MAPK 激酶通路的激活[8]。這兩條途徑均可抑制 caspase8 的活化從而提高細胞的存活率；第二種情況是在缺少 cIAP1 或細胞 FLICE 抑制蛋白（cFLIP）時，RIP1 與 Fas 相關死亡域蛋白（FADD）和 caspase8 形成胞漿復合物 IIa，進而激活 caspase 級聯(lián)并誘導細胞凋亡。在 caspase8 活性受到抑制的條件下，出現(xiàn)了第三種情況，即 RIP1 與 RIP3 和混合譜系激酶結構域蛋白（混合連接激酶結構域樣蛋白，MLKL）共同形成了 complex IIb，介導壞死性凋亡。隨后，在 complex IIb 中 RIP3 和 MLKL 被磷酸化并轉運至質膜，介導膜透化。

圖 1 TNFR1 介導的細胞存活、凋亡和壞死性凋亡通路

2.3 RIP1 的磷酸化

RIP1 作為壞死性凋亡的關鍵蛋白之一，其在 complex I 介導細胞存活的通路中扮演支架的角色，壞死桿菌素 1（Nec-1）可以抑制 RIP1 的激酶作用，而對 TNF 誘導的 NF-κB 通路沒有影響[7]。Nec-1 可以抑制細胞的壞死性凋亡，這表明了 RIP1 的激酶活性對壞死性凋亡至關重要[9]。在 complex IIb 中包括 RIP1、RIP3、 MLKL 、FADD 和 caspase8。但其中的 caspase8 必須保持無活性[10]，以確保它不會使RIP1 切割。同時有研究通過 RIP1 激酶敲除突變小鼠實驗也證實了 RIP1 激酶對壞死性凋亡是必要的。實驗使用表達催化失活的 D138N 或 K45A RIP1 等位基因的突變小鼠和細胞，其對 TNF 誘導的壞死具有高度抗性[11]。

2.4 RIP3 的磷酸化

RIP3 是壞死性凋亡的關鍵下游介質[12]，其轉錄后修飾對調節(jié)壞死性凋亡非常重要。磷酸化的 RIP1 和 RIP3 通過 RIP 同源相互作用基序（RHIM）相互結合，形成壞死復合物。RIP1 在 Ser204 處磷酸化 RIP3 是促進壞死性凋亡的關鍵，RIP1 與 RIP3 相互作用引起的最關鍵變化的是后者的磷酸化。另外，RIP3 的二聚化也可以直接導致其自磷酸化從而激活下游的 MLKL，引起細胞壞死性凋亡[13-17]。RIP3 的激酶活性對于由 TNF 刺激引起的壞死性凋亡也是重要的，對于完全缺乏 RIP3 的突變小鼠來說，由于受到TNF 誘導的系統(tǒng)性炎癥反應綜合征（SIRS）的保護，小鼠可以正常發(fā)育。但是對于催化失活的 D161N RIP3 等位基因突變小鼠，則會以基因劑量依賴的方式激活 caspase8 依賴性細胞凋亡導致早期胚胎致死[18]。

2.5 MLKL 的激活

MLKL 是目前有報道的壞死性凋亡最具代表性的下游效應物，是 RIP3 的下游底物[19-20]，在小鼠的 S345/T349 位和人的 T357/S358 位被磷酸化。隨后，通過構象變化將 p-MLKL 轉化為八聚體，易位至質膜上，并在質膜上形成孔，從而使質膜透化[21]?；罨?MLKL 除質膜外還可能移位至細胞內細胞器膜，導致線粒體和溶酶體的透化[22-23]。其中，肌醇磷酸（IP）作為一種新發(fā)現(xiàn)的調節(jié)壞死性凋亡的分子，是 MLKL 寡聚化和定位于質膜的關鍵因子[24]。

3 壞死性凋亡與惡性腫瘤密切相關

眾所周知，癌癥的發(fā)生與細胞死亡密切相關，除細胞凋亡外，壞死性凋亡同樣也與癌癥的發(fā)展有關。然而，有研究證明，壞死性凋亡在癌癥進展和發(fā)展中起著雙重作用[25]。其中，靶向壞死蛋白對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有雙重影響[26]。

一般研究認為，壞死性凋亡的功能障礙與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關。例如，RIP3 的表達在患有急性髓性白血?。ˋML）的患者中顯著下調，急性髓性白血病是已知阻斷造血分化和細胞死亡的侵襲性造血系統(tǒng)惡性腫瘤。RIP3 的減少降低了造血細胞的死亡，這與 AML 的發(fā)生有關[27]。另有一項研究報道，RIP3 的遺傳缺陷通過增加白血病起始細胞的積累將 FLT3-ITD 和 RUNXETO 驅動的小鼠骨髓增殖轉變?yōu)?AML[28]。因此，RIP3 在 AML 發(fā)病機制中的作用可能由細胞環(huán)境決定。此外，MLKL 的低表達與手術后結腸癌患者的總體存活率降低相關[29]。MLKL 在胰腺癌和宮頸鱗狀細胞癌中也被下調，其中血漿中低水平的 MLKL 預示胰腺癌和卵巢癌的預后不良[30-31]?？偠灾?，該信息為研究腫瘤發(fā)展中的壞死蛋白提供了研究方向。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，細胞對壞死性凋亡的抵抗往往是由癌基因介導的，這表明從壞死性凋亡中逃脫可能是類似于逃避細胞凋亡的腫瘤潛在標志[32]。

4 壞死性凋亡在腫瘤治療中的研究進展

研究已經證明通過傳統(tǒng)的壞死性凋亡誘導物或現(xiàn)有的化學治療劑可以使許多癌細胞系發(fā)生壞死，這些癌細胞系涵蓋幾乎所有的常見癌癥類型，尤其是結直腸癌細胞和造血系統(tǒng)腫瘤（例如白血病和多發(fā)性骨髓瘤）對壞死性凋亡誘導物更敏感[33]。

基于壞死性凋亡的腫瘤治療是現(xiàn)今抗腫瘤治療的新策略，但其可行性仍然存在很大爭議。支持者認為，由于壞死性凋亡和細胞凋亡通過不同的信號通路發(fā)揮作用，誘導腫瘤細胞的壞死性凋亡有潛力作為治療抗細胞凋亡的惡性腫瘤的替代療法。根據現(xiàn)階段的研究，這個假設已經被初步驗證。但質疑者則認為，在許多癌細胞中已經觀察到壞死機制存在先天或后天缺陷，使用的壞死誘導物是否能選擇性地殺死癌細胞而不干擾正常細胞活動以及是否會導致生物體內去炎癥作用等問題仍然有待進一步的研究。

事實上，除了已有證據表明的天然產物，如紫草醌等可以誘導細胞發(fā)生壞死性凋亡，許多最近已被批準用于臨床試驗的傳統(tǒng)化療或分子靶向藥物，已在某些癌癥類型中被鑒定為癌癥壞死誘導物[34-35]，如 VEGFR 抑制劑、m-TOR 抑制劑等。在癌細胞中誘導壞死并不一定對正常細胞有毒性甚至導致嚴重的體內副作用。同時，為了進一步增強藥物的特異性和選擇性，也可考慮使用壞死誘導物與腫瘤靶向藥物結合，以增加藥物對腫瘤細胞作用的特異性[36]，如使用 IFN-γ 與蛋白酶體抑制劑硼替佐米聯(lián)用來抑制腫瘤細胞。

5 總結與展望

作為一種不同于傳統(tǒng)理論的細胞死亡方式，壞死性凋亡受到了越來越廣泛的關注。它能夠誘導與抑制機體多種疾病的發(fā)展與變化。壞死性凋亡的激活過程涉及死亡受體的激活，細胞存活及凋亡通路抑制，complex I、complex IIb 的形成及 MLKL 磷酸化激活生成壞死小體。進一步深入研究壞死性凋亡在機體內特別是惡性腫瘤中的作用，不僅有利于加深對細胞內信號分子、機體內穩(wěn)態(tài)維持的進一步認識，而且對腫瘤治療靶點的確證、新型治療藥物的研究以及腫瘤耐藥機制研究也具有重要意義。

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弓建華，Email：ann_gong@hotmail.com；劉秀均，Email：liuxiujun2000@163.com

2019-01-16

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.012