王楠，姜允嘉，王洋，趙曉宏，郭鵬，蔡大勇，謝勇

?

以高熱穩(wěn)定性的腺苷酸基琥珀酸合成酶為催化劑大量合成腺苷酸基琥珀酸（鹽）

王楠，姜允嘉，王洋，趙曉宏，郭鵬，蔡大勇，謝勇

100193 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥用植物研究所中草藥物質(zhì)基礎與資源利用教育部重點實驗室

實現(xiàn)腺苷酸基琥珀酸（鹽）（S-AMP）的大規(guī)模合成，為開展藥物學等研究提供原料。

以 pET-28-a 為表達載體，利用大腸桿菌表達古細菌OT3 來源的腺苷酸基琥珀酸合成酶（PhAdSS），利用 Ni-NTA 層析柱純化后作為催化劑在實驗室內(nèi)開展這種微生物體內(nèi)合成 S-AMP 的反應。用 Bradford 法測定純化后 PhAdSS 的濃度。利用硅膠薄層層析檢測反應進度。用硅膠柱層析法和重結晶法純化S-AMP，利用質(zhì)譜法測定合成品中 S-AMP 的分子量，利用紫外分光光度法測定合成品內(nèi) S-AMP 的含量及回收率。

經(jīng)純化后從 1 L 的自動誘導培養(yǎng)基中至少獲得 20 mg的His-tagged-PhAdSS。將含有 10 mmol/L 肌苷酸、11 mmol/L L-天冬氨酸、20 mmol/L 鳥苷三磷酸、4 mmol/L MgCl2、2.9 μmol/L 的 His-tagged-PhAdSS 溶液于常壓環(huán)境中，70 ℃恒溫6 h 以上可以實現(xiàn) IMP 完全轉(zhuǎn)化為 S-AMP。純化后可得到 S-AMP 的單晶體，利用紫外分光光度法測定的純度為 94%，收率為 17%。

實現(xiàn)了 PhAdSS 為催化劑的 S-AMP 的大量合成。

腺苷酸基琥珀酸（鹽）； 腺苷酸基琥珀酸合酶； 古細菌OT3

腺苷酸基琥珀酸（鹽）[adenylosuccinic acid（adenylosuccinate），S-AMP]存在于所有生物體內(nèi)，由腺苷酸基琥珀酸合成酶（adenylosuccinate synthetase，AdSS）利用肌苷酸（IMP）、L-天冬氨酸和鳥苷三磷酸（GTP）為原料合成[1]。S-AMP 是合成 AMP 的前體化合物，具有刺激胰島素分泌，促進II型糖尿病患者胰島 β 細胞恢復正常的功能[2]。我們發(fā)現(xiàn)在 HepG2 細胞內(nèi) S-AMP 能激活腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK），提升細胞的糖脂質(zhì)代謝效率[3-4]。因此，S-AMP 可作為改善糖脂代謝紊亂疾病新藥的先導化合物開展成藥性研究。僅有 Sigma公司曾經(jīng)銷售過純度 96% 的 S-AMP，現(xiàn)已停產(chǎn)。為了保障 S-AMP 成藥性研究的原料所需，首先要實現(xiàn) S-AMP 的大量制備。

AdSS 反應底物都是價格低廉的生物化工產(chǎn)品，獲得一定量的 AdSS 即可開展基于酶促反應的 S-AMP 的大規(guī)模合成。OT3 是分布于海底熱泉噴口附近高溫高壓環(huán)境中的一種古細菌，最佳生長溫度為 98 ℃[5]。這種微生物體內(nèi)的AdSS（PhAdSS）比常溫環(huán)境中生存的生物如細菌、高等動植物來源 AdSS 具有更高的熱穩(wěn)定性[5-6]，更有利于大量制備。用 PhAdSS 可以在實驗室或工廠內(nèi)進行生物體內(nèi)的S-AMP 合成反應，實現(xiàn)S-AMP 的大規(guī)模、低成本制備。本文報道大量制備 PhAdSS 并以其為催化劑實現(xiàn) S-AMP 的合成及純化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌的 DH5α 感受態(tài)細胞和 BL21(DE3) 感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術公司；pET-28-a 購自美國 Novagen公司；pET-19-b-PhAdSS 質(zhì)粒由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨、酵母提取物購自英國 Oxoid 公司；α-乳糖、葡萄糖購自上海國藥集團；限制性 DNA 內(nèi)切酶I 和H I、T4 DNA 連接酶購自美國 Transgen公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自美國 Genstar 公司；十水合磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化銨、硫酸鎂、硫酸鈉等試劑由北京化工廠生產(chǎn)；硫酸卡那霉素、IPTG、Tris、SDS 和 EDTA 等由美國 Amresco公司提供；腺苷酸基琥珀酸（含量 96%）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺由美國 Sigma公司提供；Ni-NTA 蛋白質(zhì)層析填料購自中國科學院過程工程研究所。合成S-AMP 的原料 IMP、GTP 和 L-天冬氨酸為希杰（聊城）生物技術公司生產(chǎn)，純度大于 90%；HSGF254 型硅膠層析板由煙臺市化學工業(yè)研究所制造。

1.1.3 主要儀器 LQ-A30002 型電子天平、恒壓恒流電泳儀電泳槽購自美國 Bio-Rad 公司；HZQ 系列振蕩培養(yǎng)箱和TD5A 型離心機購自金壇市科析儀器有限公司；DHP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海一恒科技有限公司；TGL-16 型高速臺式冷凍離心機購自湖南湘儀離心機儀器有限公司；Envision 2104-0010 型酶標儀購自美國 Perkin Elmer 公司；Nano drop 2000C 紫外分光光度計購自美國 Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 PhAdSS 的制備 利用 pET-19-b 原核表達載體成功實現(xiàn)了PhAdSS 的表達、純化、結晶化[6]和晶體結構測定（PDB ID：2D7U，5K7X）。本項研究以 His-tagged-PhAdSS 為催化劑合成 S-AMP，為了減少 His-tag 融合蛋白的N 末端的序列，改用 pET-28-a 載體表達N 末端帶有 MGSSHHHH HHSSGLVPRGSH 序列的 His-tagged-PhAdSS。在 20 μl 的pET-28-a（1 μg/ml）和 pET-19-b-PhAdSS（1 μg/ml）溶液中分別加入限制性內(nèi)切酶I 和H I 各 1 μl，37 ℃下反應 2 h 后用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳進行產(chǎn)物分離。100 V 電壓下電泳40 min，從瓊脂糖凝膠中回收 pET-28-a 和 PhAdSS，操作依據(jù) DNA 膠回收試劑盒的條件開展；取 1 μl 的 pET-28-a 與 3 μl 的 PhAdSS 的 cDNA 混合，加入 0.5 μl 的 T4 DNA 連接酶和 0.5 μl 的 T4 DNA 連接酶反應溶液，16 ℃下反應 16 h。將反應生成的 pET-28-a-PhAdSS 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞內(nèi)，37 ℃恒溫箱中在含有 50 μg/ml 硫酸卡那霉素的 LB 固體平板培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，得到的轉(zhuǎn)化子用含有 50 μg/ml 硫酸卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基 37 ℃下培養(yǎng) 12 h，用質(zhì)粒小提試劑盒提取 pET-28-a-PhAdSS 質(zhì)粒。而后將質(zhì)粒 pET-28-a-PhAdSS 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21(DE3) 感受態(tài)細胞內(nèi)，利用自動誘導大腸桿菌表達法[7]表達 PhAdSS，轉(zhuǎn)化子接種于自動誘導培養(yǎng)基（1 L自動誘導培養(yǎng)基內(nèi)含有胰蛋白胨10 g、酵母提取物 5 g、磷酸氫二鈉 8.95 g、磷酸二氫鉀 3.4 g、氯化銨 2.67 g、硫酸鈉 0.71 g、硫酸鎂 0.5 g、甘油 15 ml、葡萄糖 0.5 g、α-乳糖 2 g、氯化鐵0.03 g）內(nèi)，37 ℃培養(yǎng) 24 h 后室溫下離心沉降大腸桿菌細胞。每升培養(yǎng)基內(nèi)回收的大腸桿菌細胞用 15 ml 的上樣緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑]懸浮，70 ℃恒溫 20 min 后讓樣品的溫度緩慢降至室溫。4℃，12 000 ×離心 20 min 去除產(chǎn)生的變性蛋白質(zhì)等沉淀；上清液流經(jīng)柱體積 10 ml 的 Ni-NTA 蛋白質(zhì)層析柱后，用 60 ml 的上樣緩沖液流過 Ni-NTA 蛋白質(zhì)層析柱洗去雜質(zhì)，然后用 30 ml 的洗脫液[20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、200 mmol/L 咪唑]將His-tagged-PhAdSS 從層析柱上洗脫出來，回收樣品用 SDS-PAGE 檢測純度，用 Bradford 法測定純化后的蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)層析分離在室溫下進行。柱層析法純化 His-tagged-PhAdSS 的流速約為 5 ml/min。

1.2.2 PhAdSS 的活性研究 測定反應開始后特定時間下反應體系的290可以計算 S-AMP 的濃度，據(jù)此可以判斷酶活性的大小[8-9]。酶標儀測定反應開始后體系的290，確定 PhAdSS 的最佳活性條件。

1.2.2.1 酸度對 PhAdSS 活性的影響 反應體系中含有500 μmol/L IMP、250 μmol/L GTP、10 mmol/L 天冬氨酸和 0.12 μmol/L（0.9 μg）PhAdSS。用醋酸鹽緩沖溶液、MES 緩沖鹽溶液以及 Tris-HCl 緩沖溶液控制 pH 值分別在4.0 ~ 5.0、5.5 ~ 6.5 和7.0 ~ 8.0 范圍。緩沖溶液的濃度為 30 mmol/L。50℃環(huán)境中測定反應體系 pH 值分別為 4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和 8.0 的反應初始速率，以此作為判斷酶活性大小的依據(jù)。

1.2.2.2 溫度對 PhAdSS 活性的影響 依據(jù) PhAdSS 的活性對酸度的依存性實驗結果，選定在 pH 7.5 條件下，檢測溫度對 PhAdSS 催化活性的影響。在酶反應體系含有 30 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、15 mmol/L 醋酸鎂、500 μmol/L IMP、250 μmol/L GTP、10 mmol/L 天冬氨酸和0.12 μmol/L（0.9 μg）的 PhAdSS。測定 30、37、40、50℃溫度環(huán)境中的反應初始速率作為衡量酶活性的標準。

1.2.3 S-AMP 的實驗室小試合成

1.2.3.1 S-AMP 合成反應裝置和條件 為了保證 IMP 能完全轉(zhuǎn)化為 S-AMP，兼顧 S-AMP 合成效率，設定反應體積 0.5 L；反應體系配方為10 mmol/L IMP、20 mmol/L GTP、11 mmol/L L-天冬氨酸、4 mmol/L MgCl2，His-tagged-PhAdSS 濃度分別為 80、100、200 mg/L，根據(jù) PhAdSS 活性分析結果，用 10 mol/L 的 NaOH 調(diào)節(jié)反應體系 pH 為7.5，由于 S-AMP 具有良好的熱穩(wěn)定性，溫度增加有利于提高反應速度。因此，反應體系設定在 70 ℃水浴鍋內(nèi)緩慢攪拌 20 h。用硅膠薄層層析法檢測反應進行時間段的 IMP 轉(zhuǎn)化率。

1.2.3.2 合成反應體系成分鑒定 合成反應結束后，利用硅膠薄層層析法分析產(chǎn)物中的成分。展開劑中異丙醇和 6.25% 氨水的體積百分比分別為 65% 和 35%（展開劑配方為本項研究中確定，對 IMP 和 S-AMP 有良好的分離）。

1.2.4 S-AMP 純化

1.2.4.1 硅膠柱層析 根據(jù)分離樣品的極性差異，用硅膠薄層層析法檢測能讓S-AMP 和 GDP 在硅膠層上遷移速率相差最大的展開劑配方，流動相中無水乙醇和 6.25% 氨水的體積比為 6:4 可實現(xiàn) S-AMP 和 GDP 的最大分離。稱取分離樣品總質(zhì)量 50 倍的 H 硅膠（200 ~ 300 目），用無水乙醇調(diào)成糊狀，填充至層析柱內(nèi)，層析柱直徑為18 cm，硅膠填充高度 20 cm。打開層析柱下部活塞，讓無水乙醇盡量流出，硅膠層中不得殘留氣泡。

合成反應完成后調(diào)節(jié)反應溶液 pH 值為 2.9，室溫下放置 10 h，讓過量的 L-天冬氨酸析出。過濾去除固體后，上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，用蒸氣浴法濃縮至原來體積的 20%，溶液中的不溶物過濾去除。用分離硅膠質(zhì)量十分之一的上樣硅膠（60 ~100 目）吸附待分離樣品，加入到分離硅膠層上，高度不超過 0.5 cm。膠層頂部放上一張圓形濾紙，防止加入流動相時液體擾亂硅膠層。加入體積相當于硅膠柱體積 1.5 倍的流動相溶液。室溫下按每瓶 50 ml 回收流出液。溶液內(nèi)成分用硅膠薄層層析檢測。展開劑中乙醇和 6.25% 氨水體積百分比分別為 65% 和 35%。

1.2.4.2 S-AMP 重結晶 合并 S-AMP 為單一成分的流出液，用 10 mol/L NaOH 水溶液調(diào)節(jié)pH 值至 10，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除有機溶劑和氨后，將剩余水溶液 pH 值調(diào)節(jié)為 3，在空氣浴上蒸干。37℃恒溫箱內(nèi)用 60% 乙醇水溶液溶解固體至飽和。過濾去除不溶物后將溶液溫度降低到室溫，然后于–20℃冰箱內(nèi)放置 10 h 以上，讓 S-AMP 重結晶，而后在室溫下迅速抽濾去除液體。

1.3.4.3 產(chǎn)物內(nèi) S-AMP 的定性和定量分析 配制濃度為 0.2 mmol/L 的S-AMP 標準品和合成品溶液，測定紫外吸收光譜；而后配制 S-AMP 標準溶液，用工作曲線法測定重結晶樣品中 S-AMP 的含量。質(zhì)譜法測定分子量：取 1 mg 合成品溶解于 5 ml 甲醇中，用 DFS 質(zhì)譜分析儀測定樣品中各成分的分子量。

2 結果

2.1 PhAdSS 的制備

純化 His-tagged-PhAdSS 各階段的蛋白質(zhì)樣品 SDS-PAGE經(jīng)過 Ni-NTA 柱層析后，無雜質(zhì)蛋白被檢出（圖 1）。用 Bradford 法測定蛋白質(zhì)濃度計算蛋白總量，多次試驗結果證明，從1 L 自動誘導培養(yǎng)基可得到不少于 20 mg 的 His-tagged-PhAdSS。

M：標準分子量蛋白質(zhì)；1：大腸桿菌破碎后的可溶性蛋白；2：70 ℃恒溫去除變性蛋白的樣品；3：70 ℃恒溫產(chǎn)生的變性蛋白；4：Ni-NTA 柱層析純化后的蛋白樣品

M: Marker; 1: Soluble proteins fromcells; 2: Sample after removed denatured protein incubated at 70 ℃; 3: Denatured proteins generated at 70 ℃; 4: Protein sample purified by Ni-NTA column chromatography

圖 1 純化 PhAdSS 各階段的蛋白質(zhì)樣品的 SDS-PAGE

Figure 1 SDS-PAGE of purification stages of PhAdSS

2.2 PhAdSS 的活性

在50℃，溶液的 pH 6.0 以下時 PhAdSS 的活性低，pH 值從 6.0增加到 6.5 時，PhAdSS 的活性有顯著性增加，pH 6.5 ~ 8.0 環(huán)境中 PhAdSS 的活性是測試條件中最好的（圖 2A）。在 pH 7.5 的條件下檢測溫度對 PhAdSS 活性的影響，結果如圖 2B 所示，40℃以下環(huán)境中 PhAdSS 無明顯的活性，當溫度達 50 ℃時，PhAdSS 的活性顯示突躍式增加。酶標儀能控制最大溫度為 55 ℃。在55℃環(huán)境中測定的結果由于 96 孔微孔板中樣品很快蒸發(fā)，結果準確度欠佳。根據(jù) PhAdSS 在溫度高于 70 ℃環(huán)境中不變性[6]的特點，可以認為在50℃以上溫度環(huán)境中，PhAdSS 的活性應該增大。為了提高反應速度，在小試合成研究中選用 pH 7.5 和 70 ℃條件下以 PhAdSS 為催化劑開展 S-AMP 的小試合成。

圖 2 反應體系的 pH（A）和溫度（B）對 PhAdSS 活性的影響

Figure 2 pH (A) and temperature (B) of the reaction system effect on the PhAdSS activity

圖 3 硅膠薄層層析鑒定的不同濃度 PhAdSS 作為催化劑反應開始后一定時間的反應體系成分的結果

Figure 3 Compositions of the reaction system were identified using the silica gel thin-layer chromatography with various concentrations PhAdSS as a catalyst and at a certain time after the reaction started

2.3 S-AMP 合成反應條件

合成后 S-AMP 用硅膠薄層層析檢測，結果見圖 3，酶濃度為 2.3 μmol/L（80 μg/ml）的反應體系中，盡管反應時間超過10 h，IMP 仍不能完全轉(zhuǎn)化為 S-AMP；酶濃度為2.9 μmol/L 的反應體系中，反應時間超過 6 h，反應體系中已無 IMP 檢出，可以認為 IMP 完全轉(zhuǎn)化為 S-AMP；酶濃度為 5.8 μmol/L 的反應體系中，反應時間超過2 h，IMP 可完全地轉(zhuǎn)化為 S-AMP。因此可認為 His-tagged-PhAdSS 能使 IMP 完全轉(zhuǎn)化為 S-AMP 的最低濃度是2.9 μmol/L，至少反應 6 h。反應體系放大為 2 L 也能達到同樣的轉(zhuǎn)化效果。

2.4 產(chǎn)物中 S-AMP 的定性分析結果

迄今為止無 S-AMP 的紫外吸收光譜被報道，0.2 mmol/L 的 Sigma 產(chǎn)S-AMP 的紫外吸收光譜（圖 4A）和本研究合成的 S-AMP 的紫外吸收光譜（圖 4B）都顯示 S-AMP 的最大吸收波長是266 nm，根據(jù) Sigma 產(chǎn)S-AMP 的266 nm計算 S-AMP 的266 nm為 1.94 × 105L/(mol·cm)。依據(jù)該波長下測定的 S-AMP 的266 nm濃度工作曲線（圖 4C）計算的合成品中 S-AMP 的含量為 94%，獲得的 S-AMP 質(zhì)量為 0.394 g，理論產(chǎn)量為 2.31 g，收率為 17%。

圖 4 0.2 mmol/L 的 Sigma 公司產(chǎn) S-AMP 的紫外吸收光譜（A）和同樣濃度下 S-AMP 合成品的紫外吸收光譜（B）、濃度標準曲線（C）、質(zhì)譜圖（D）

Figure 4 UV spectrum of 0.2 mmol/L S-AMP from Sigma (A) and synthesized in this study (B), concentration standard curve (C), mass spectrometry (D) of S-AMP synthesized in this study

利用 TQD 質(zhì)譜儀的高分辨率陰離子法測定的合成品中 S-AMP 的分子量為 462.0655（圖 4D），化合物數(shù)據(jù)庫收錄的陰離子質(zhì)譜法測定的 S-AMP 分子量為 462.066，兩者相同，與 Sigma 公司提供的S-AMP 的分子量也相同。質(zhì)譜圖中無 IMP、GDP 等峰出現(xiàn)，證明樣品中的雜質(zhì)可能來源于反應原料并且對紫外光沒有吸收的功能，需要利用 HPLC-MS 等方法進一步開展研究。

3 討論

先導化合物的成藥性研究需要大量樣品作為支撐，實現(xiàn)藥物先導化合物的低成本合成是保障藥物研究經(jīng)濟性的前提。對 S-AMP 的合成研究而言，已有研究闡明了 S-AMP 在解偶聯(lián)嘌呤核苷酸代謝通路中的位置，即由 AdSS 利用 IMP、L-天冬氨酸和 GDP 合成。對 AdSS 的反應機制已開展了 50 多年的研究，已有大腸桿菌、瘧原蟲、兔等來源的酶促反應動力學研究論文發(fā)表[8-11]，但未見 S-AMP 的大規(guī)?；瘜W合成或生物合成的研究成果發(fā)表。

AdSS 存在于所有生物體內(nèi)，美國 National Center for Biotechnology Information（NCBI）數(shù)據(jù)庫內(nèi)已經(jīng)登錄了約三萬種不同生物來源的 AdSS 的基因序列和氨基酸序列。已知幾乎所有生物體內(nèi)的 AdSS 含有 430 ~ 470 個氨基酸，分子量為45 ~ 50 kD。另外，有極少數(shù) AdSS 含有 330 ~350 個氨基酸，分子量為 36 ~ 39 kD。這些小分子量的AdSS 可以歸納為 AdSS 中的特殊一類，小分子量 AdSS 主要存在于古細菌體內(nèi)。迄今為止，對大腸桿菌[12-15]、擬南芥和小麥[16]、瘧原蟲[17]、小鼠[18-19]等常溫生物體內(nèi)的大分子量 AdSS 的晶體結構（一部分物種來源的 AdSS 晶體結構中結合了底物或底物的結構類似物）和 PhAdSS 的晶體結構（PDB ID：2D7U，5K7X）證明，AdSS 具有活性中心結構的高度相似性。大分子量 AdSS 的穩(wěn)定性較差，純化困難，未見利用生物催化劑實現(xiàn) S-AMP 大量制備的報道。古細菌來源的小分子量 AdSS 具有良好的熱穩(wěn)定性，本項研究基于 PhAdSS 的高熱穩(wěn)定性，利用蛋白質(zhì)熱變性沉淀原理簡便地實現(xiàn)了 His-tagged-PhAdSS 的大量純化，以其為催化劑實現(xiàn)了 S-AMP 的實驗室小試制備。從合成產(chǎn)物中純化 S-AMP 的方法簡單，純化步驟短，實現(xiàn)了實驗室內(nèi)大規(guī)模、低成本合成 S-AMP，有望發(fā)展為工業(yè)化生產(chǎn) S-AMP 的新工藝，為開展 S-AMP 的成藥性研究等保障原料供應。

志謝 中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所司書毅教授幫助實施 PhAdSS 活性研究，在此表達誠摯謝意。

[1] Bubi? A, Mrnjavac N, Stuparevi? I, et al. In the quest for new targets for pathogen eradication: the adenylosuccinate synthetase from the bacterium Helicobacter pylori. J Enzyme Inhib Med Chem, 2018, 33(1):1405-1414.

[2] Gooding JR, Jensen MV, Dai X, et al. Adenylosuccinate is an insulin secretagogue derived from glucose-induced purine metabolism. Cell Reports, 2015, 13(1):157-167.

[3] Qian HL. Pharmacological study on the structure and function of small molecular weight Adenylosuccinate synthase and its products. Beijing: Peking Union Medical College, 2014.(in Chinese)

錢火連. 小分子量腺苷酸基琥珀酸合成酶的結構與功能及其產(chǎn)物的藥理學研究. 北京: 北京協(xié)和醫(yī)學院, 2014.

[4] Thomson DM, Winder WW. AMP-activated protein kinase control of fat metabolism in skeletal muscle. Acta Physiol (Oxf), 2010, 196(1): 147-154.

[5] Kawarabayasi Y, Sawada M, Horikawa H, et al. Complete sequence and gene organization of the genome of a hyper-thermophilic archaebacterium, pyrococcus horikoshii OT3. DNA Res, 1998, 5(2): 55-76.

[6] Wang X, Akasaka R, Takemoto C, et al. Overexpression, purification, crystallization and preliminary crystallographic studies of a hyperthermophilic adenylosuccinate synthetase from Pyrococcus horikoshii OT3. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2011, 67(Pt 12):1551-1555.

[7] Di Gennaro P, Ferrara S, Bestetti G, et al. Novel auto-inducing expression systems for the development of whole-cell biocatalysts. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 79(4):617-625.

[8] Raman J, Mehrotra S, Anand RP, et al. Unique kinetic mechanism of Plasmodium falciparum adenylosuccinate synthetase. Mol Biochem Parasitol, 2004, 138(1):1-8.

[9] Wang W, Gorrell A, Honzatko RB, et al. A study of Escherichia coli adenylosuccinate synthetase association states and the interface residues of the homodimer. J Biol Chem, 1997, 272(11):7078-7084.

[10] Borza T, Iancu CV, Pike E, et al. Variations in the response of mouse isozymes of adenylosuccinate synthetase to inhibitors of physiological relevance. J Biol Chem, 2003, 278(9):6673-6679.

[11] Muirhead KM, Bishop SH. Purification of adenylosuccinate synthetase from rabbit skeletal muscle. J Biol Chem, 1974, 249(2): 459-464.

[12] Silva MM, Poland BW, Hoffman CR, et al. Refined crystal structures of unligated adenylosuccinate synthetase fromescherichia coli. J Mol Biol, 1995, 254(3):431-446.

[13] Fonné-Pfister R, Chemla P, Ward E, et al. The mode of action and the structure of a herbicide in complex with its target: binding of activated hydantocidin to the feedback regulation site of adenylosuccinate synthetase. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996, 93(18):9431-9436.

[14] Choe JY, Poland BW, Fromm HJ, et al. Mechanistic implications from crystalline complexes of wild-type and mutant adenylosuccinate synthetases from Escherichia coli. Biochemistry, 1999, 38(21):6953- 6961.

[15] Hou Z, Wang W, Fromm HJ, et al. IMP alone organizes the active site of adenylosuccinate synthetase from escherichia coli. J Biol Chem, 2002, 277(8):5970-5976.

[16] Prade L, Cowan-Jacob SW, ChemLa P, et al. Structures of adenylosuccinate synthetase from Triticum aestivum and Arabidopsis thaliana. J Mol Biol, 2000, 296(2):569-577.

[17] Eaazhisai K, Jayalakshmi R, Gayathri P, et al. Crystal structure of fully ligated adenylosuccinate synthetase from plasmodium falciparum. J Mol Biol, 2004, 335(5):1251-1264.

[18] Iancu CV, Borza T, Choe JY, et al. Recombinant mouse muscle adenylosuccinate synthetase: overexpression, kinetics, and crystal structure. J Biol Chem, 2001, 276(45):42146-42152.

[19] Iancu CV, Borza T, Fromm HJ, et al. IMP, GTP, and 6-phosphoryl-IMP complexes of recombinant mouse muscle adenylosuccinate synthetase. J Biol Chem, 2002, 277(30):26779- 26787.

Large-scale synthesis of adenylosuccinate using a high thermal stability adenylosuccinate synthetase as a bio-catalyst

WANG Nan, JIANG Yun-jia, WANG Yang, ZHAO Xiao-hong, GUO Peng, CAI Da-yong, XIE Yong

Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Beijing 100193, China

To set up a large-scale synthesis system of adenylosuccinate (S-AMP) for providing mass chemical resources in pharmaceutical studies.

Adenylosuccinate synthetase (AdSS) from archaeaOT3 (PhAdSS) was expressed incells using the pET-28a vector as a His-tagged fusion protein. The His-tagged-PhAdSS was purified by a Ni-NTA column. Concentration of the His-tagged-PhAdSS was determined using the Bradford method. The His-tagged-PhAdSS was used as a catalyst to perform large-scale synthesis of S-AMP. Analysis of the reaction progress was carried out using the silica gel thin-layer chromatography. S-AMP was purified using the silica gel column chromatography and re-crystallization. The molecular weight of synthesized S-AMP was measured using mass spectrometry. The concentration of S-AMP in the synthesized sample and yield of the large-scale synthesis system were determined using the UV spectrophotometry.

More than 20 mg His-tagged-PhAdSS could be obtained from per liter of auto-induce medium. Under a normal pressure environment, IMP can completely be converted to S-AMP in a solution containing 10 mmol/L inosine mono-phosphate (IMP), 11 mmol/L L-aspartate, 20 mmol/L guanosine tri-phosphate (GTP), 4 mmol/L MgCl2and 2.9 μmol/L His-tagged-PhAdSS, with gently stirring at 70 ℃ for more than 6 hours. After purification, single crystal of S-AMP was obtained. Yield and recovery rate of the large-scale synthesis system of S-AMP set up in this study were 94% and 17%, respectively.

A large-scale synthesis system of S-AMP is set up using PhAdSS as a bio-catalyst.

Adenylosuccinic acid (Adenylosuccinate); Adenylosuccinate synthase;OT3

XIE Yong, Email: xyosaka@163.com, yxie@implad.ac.cn

國家自然科學基金（81473114）

謝勇，Email：xyosaka@163.com、yxie@implad.ac.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.02.002

2018-12-20