張聰，姚路路，侯林，樊麗博，楊會(huì)鮮，周德剛，張曉會(huì)

(1.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心,河南洛陽(yáng) 471000；2.洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司,河南洛陽(yáng) 471000)

加米霉素是法國(guó)梅里亞公司開發(fā)研制的新一代半合成十五元氮雜環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物，其注射液于2017年通過農(nóng)業(yè)部進(jìn)口獸藥注冊(cè)在我國(guó)上市銷售，用于治療和預(yù)防由溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌等主要病原菌引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病[1]。目前國(guó)內(nèi)有多家單位開展加米霉素及注射液的仿制研究[2-4]，但加米霉素法定對(duì)照品在國(guó)際和國(guó)內(nèi)并無(wú)單位提供，困擾了加米霉素原料及其注射液的質(zhì)量控制，本文研究建立了加米霉素對(duì)照品的標(biāo)定方法，為其對(duì)照品的標(biāo)定提供技術(shù)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜系統(tǒng)(Waters e2695型HPLC；2998型PDA檢測(cè)器；Empower 3色譜工作站軟件)，美國(guó)Waters公司；XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國(guó)Waters公司；AB265-S電子分析天平，梅特勒托利多公司；Seven easy型酸度計(jì)，梅特勒托利多公司；GZX-9070MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，SX2-2.5-10型箱式電阻爐，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；磷酸氫二鈉、磷酸為分析純；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水。

1.2 試藥 加米霉素對(duì)照品原料，由洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)確證

2.1.1 采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、質(zhì)譜(MS)、核磁共振波譜(NMR)對(duì)加米霉素原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn) 測(cè)試方法及條件：UV測(cè)定，供試品用乙醇溶解，濃度為0.011 mg/mL，掃描范圍190～400 nm；IR測(cè)定，采用KBr壓片法，供試品與KBr的比例約為1∶200；1H-NMR測(cè)定為500 MHz，13C-NMR測(cè)定為500 MHz，供試品采用CDCl3溶解；MS測(cè)定，離子化方式為ESI+。

結(jié)構(gòu)確認(rèn)結(jié)果如下：UV λmax：204 nm；IR v：3534、2969、2937、2876、2831、2795、1735、1637、1458、1421、1380、1349、1295、1279、1249、1166、1135、1109、1094、1075、1058、1016、1004、983 cm-1；ESI-MSm/z：777.54 [M+H]+；1H NMR(CDCl3)：δ 0.89, 0.98, 0.99, 1.08, 1.22, 1.30, 1.54, 1.70, 1.91, 2.01, 2.30, 2.74, 3.01, 3.14, 3.29 3.55, 3.62, 4.08, 4.23, 4.38, 5.00。13C NMR(CDCl3)：δ177.60, 105.09, 96.47, 77.92, 77.30, 7.05, 76.79, 75.31, 74.27, 72.79, 70.39, 69.23, 65.60, 64.97, 59.27, 49.37, 46.87, 42.48, 40.37, 34.97, 32.53, 28.95, 22.06, 21.55, 21.16, 17.82, 16.02, 15.23, 14.54, 12.92, 12.09, 11.35。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[3,5]報(bào)道數(shù)據(jù)一致，表明對(duì)照品原料化學(xué)結(jié)構(gòu)與加米霉素相同。

2.1.2 采用X射線單晶衍射法對(duì)加米霉素原料進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn) 單晶培養(yǎng)條件：取對(duì)照品原料0.1 g，置潔凈容器內(nèi)，加乙腈溶解，室溫放置，緩慢揮發(fā)溶劑至晶體長(zhǎng)成。

對(duì)照品原料X射線單晶衍射測(cè)定結(jié)構(gòu)單元見圖1，絕對(duì)構(gòu)型與加米霉素相同。

a含溶劑的結(jié)構(gòu)單元 b去除氫的結(jié)構(gòu)單元a Structural Unit Containing Solvents b Structural unit for hydrogen removal圖1 對(duì)照品原料結(jié)構(gòu)單元 Fig 1 Structure Unit of reference material

2.2 HPLC純度檢查

2.2.1 色譜條件 參考?xì)W洲藥典EP8.0版阿奇霉素有關(guān)物質(zhì)檢查方法[6]并進(jìn)行優(yōu)化，采用Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm 5 μm)色譜柱；流動(dòng)相A為0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液(稀磷酸調(diào)pH值至8.9)-甲醇-乙腈(90∶2.5∶7.5)，流動(dòng)相B為0.01 mol/L磷酸氫二鈉溶液(稀磷酸調(diào)pH值至8.9)-甲醇-乙腈(28∶18∶54),線性梯度洗脫，柱溫30 ℃；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm。

2.2.2 供試品測(cè)定 稱取對(duì)照品原料適量，加稀釋液[1.73 g/L磷酸二氫銨溶液(氨水調(diào)pH值至10.0)-甲醇-乙腈(35∶35∶30)]溶解并稀釋制成每1 mL中約含10 mg的溶液，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖?？鄢Ａ魰r(shí)間4 min前的溶劑色譜峰，按峰面積歸一化法計(jì)算純度，結(jié)果見圖2和表1。

表1 純度測(cè)定結(jié)果Tab 1 The results of purity test

圖2 對(duì)照品原料純度測(cè)定色譜圖Fig 2 The chromatogram of reference material Purity test

2.3 干燥失重 按《中國(guó)獸藥典》2015年版一部[7]干燥失重測(cè)定法(附錄0831)測(cè)定，結(jié)果見表2。

2.4 熾灼殘?jiān)?按《中國(guó)獸藥典》2015年版一部[7]熾灼殘?jiān)鼫y(cè)定法(附錄0841)測(cè)定，結(jié)果見表3。

表2 干燥失重測(cè)定結(jié)果Tab 2 The results of Loss on drying

表3 熾灼殘?jiān)鼫y(cè)定結(jié)果Table 3 The results of residue on ignition

2.5 定量賦值 加米霉素對(duì)照品原料定值采用國(guó)際通用的質(zhì)量平衡法確定含量，同時(shí)采用定量NMR技術(shù)對(duì)質(zhì)量平衡法賦值準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。

2.5.1 質(zhì)量平衡法賦值結(jié)果 含量(%)=純度×(1-干燥失重-熾灼殘?jiān)?×100%，結(jié)果為99.93%×(1-1.05%-0.10%)×100%=98.8%。

2.5.2 定量NMR法驗(yàn)證結(jié)果 依據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部[8]通則0441核磁共振波譜法，試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法，以馬來(lái)酸作為內(nèi)標(biāo)，樣品用氘代乙醇溶解后，以加米霉素1H譜中的2.66(3H)信號(hào)峰與內(nèi)標(biāo)物1H譜中的6.26(1H)信號(hào)峰(圖3)計(jì)算供試品的含量，定量NMR法含量測(cè)定結(jié)果為98.3%。

圖3 加米霉素定量核磁共振光譜圖Fig 3 The spectrogram of Quantitative nuclear magnetic resonance

2.6 對(duì)照品原料穩(wěn)定性考察 加米霉素對(duì)照品原料，用安瓿瓶分裝，50 mg/瓶，放入藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中，在(40±2)℃、相對(duì)濕度75%±5%條件下放置6個(gè)月，分別于第1、2、3、6月取樣，對(duì)樣品性狀、熔點(diǎn)、純度進(jìn)行檢查，結(jié)果見表4。

表4 穩(wěn)定性考察結(jié)果Tab 4 The results of stability investigation

3 討論與結(jié)論

3.1 加米霉素結(jié)構(gòu)確證 加米霉素為十五元氮雜環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有較多的手型碳原子，因此,單純采用核磁共振方法難以確定每個(gè)手型中心的絕對(duì)構(gòu)型，本研究通過溶劑結(jié)晶方法培養(yǎng)得到加米霉素單晶，采用X-射線單晶衍射方法對(duì)加米霉素的絕對(duì)構(gòu)型進(jìn)行了測(cè)定。

3.2 質(zhì)量平衡法賦值 本研究按質(zhì)量平衡法對(duì)本批加米霉素對(duì)照品原料進(jìn)行了含量定值[9]。根據(jù)質(zhì)量平衡法原理，標(biāo)準(zhǔn)品含量(%)=[100%-水分(%)-殘留溶劑(%)-無(wú)機(jī)雜質(zhì)(%)]×純度(%)，當(dāng)用干燥失重方法可將標(biāo)準(zhǔn)品中的水分和殘留溶劑全部揮發(fā)出來(lái)并使供試品達(dá)到恒重時(shí)，本公式中的水分和殘留溶劑的測(cè)定結(jié)果可用干燥失重結(jié)果代替[10]。加米霉素對(duì)照品原料最后采用丙酮-水系統(tǒng)進(jìn)行精制，在105 ℃能全部揮發(fā)出去，試驗(yàn)證明加米霉素對(duì)照品原料在該溫度能很快干燥至恒重，說(shuō)明水分和有機(jī)溶劑能完全揮發(fā)，可用干燥失重結(jié)果代替水分和殘留溶劑的測(cè)定。

3.3 含量定值 為了準(zhǔn)確標(biāo)定加米霉素對(duì)照品原料的含量，采用了兩種不同原理的方法進(jìn)行測(cè)定。由于原研公司加米霉素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并未公開，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征，參考泰拉霉素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[11]及各國(guó)家阿奇霉素藥典標(biāo)準(zhǔn)[6,12]，本研究建立了加米霉素HPLC純度檢測(cè)方法，并對(duì)采用的方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，以確保純度檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明質(zhì)量平衡法結(jié)果與定量NMR法結(jié)果相對(duì)偏差為0.3%，兩種方法標(biāo)定結(jié)果一致。

本批加米霉素對(duì)照品原料的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果與其結(jié)構(gòu)相符合，純度大于99%(HPLC法)，證明該批原料可以用于加米霉素對(duì)照品的制備。采用質(zhì)量平衡法測(cè)得的加米霉素對(duì)照品原料含量為98.8%，用定量NMR法測(cè)得的結(jié)果為98.3%，兩種方法測(cè)定結(jié)果差異較小，說(shuō)明本批加米霉素對(duì)照品原料賦值結(jié)果準(zhǔn)確，可作為加米霉素原料及其制劑研制過程中對(duì)照品使用。