魏秀麗，徐恩民，劉霄飛，李有志*，張秀英，王海軍

(1.山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，濟(jì)南250022；2.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；3.山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南250022；4.北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102206；5.北京市中獸藥工程技術(shù)研究中心，北京 102206)

蒲公英為菊科植物蒲公英TaraxacummongolicumHand-Mazz、堿地蒲公英TaraxacumborealisineseKitam或同屬數(shù)種植物的干燥全草。味甘、微苦，性寒，無(wú)毒，用于疔瘡腫毒、乳癰、咽痛、濕熱黃疸、熱淋澀痛。蒲公英同時(shí)含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等，有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是藥食兼用的食物。藥材及相關(guān)制劑被收錄于中華人民共和國(guó)藥典和獸藥典[1-2]。由于其良好的治療效果和親民的價(jià)格，蒲公英提取物在獸藥中的研究也成為熱點(diǎn)，對(duì)其有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制成為必然。蒲公英主要含有黃酮類、酚酸類、糖類、倍半萜內(nèi)酯類等成分，其中以咖啡酸為代表成分。

有文獻(xiàn)報(bào)道采用薄層色譜法(TLC)為蒲公英提取物制定定性鑒別方法；采用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定其咖啡酸含量[1-8]。前者耗時(shí)較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了改進(jìn)。本文對(duì)經(jīng)水提醇沉的蒲公英提取物，采用超高效液相色譜法對(duì)其有效成分咖啡酸進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，方法經(jīng)濟(jì)快速，滿足日常檢測(cè)需求，為下一步蒲公英提取物的工藝調(diào)整和優(yōu)化方案的篩選提供最快速的檢測(cè)方法，為制定檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)提供方法借鑒。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平：感量0.00001g；儀器 Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色譜儀。

1.2 藥品及試劑 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)110885-201703，含量99.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲酸、甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；超純水。蒲公英提取物為水提醇沉，北京生泰爾科技股份有限公司小試生產(chǎn)的產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLCTMHSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：水溶液(0.4%磷酸)，進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.35 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35 ℃。二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為323 nm。液相色譜梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫條件表Tab 1 Gradient elution condition table

2.2 樣品制備

2.2.1 樣品 蒲公英提取物

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備 精密稱取咖啡酸對(duì)照品9.36 mg，加甲醇至100 mL，制成100 μg/mL的溶液，作為咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用初始比例流動(dòng)相稀釋，制備成系列濃度為： 1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.4 蒲公英提取物樣品的制備 精密稱取蒲公英提取物樣品約0.5、0.2、0.1、0.05 g，置15 mL離心管中，加5%甲酸甲醇溶液溶解并定容至10 mL，超聲30 min，5000 rpm.離心10 min，過(guò)濾至15 mL離心管中，作為樣品初始液；分別精密量取相應(yīng)濃度的樣品初始液適量，用初始比例流動(dòng)相稀釋5倍，搖勻，0.22 μm濾膜濾過(guò)，上機(jī)測(cè)試。

2.3 方法線性考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 咖啡酸對(duì)照品和蒲公英提取物樣品待測(cè)液，在2.1項(xiàng)條件下，色譜保留時(shí)間為3.45 min左右見(jiàn)圖1-圖2。光譜圖見(jiàn)圖3-圖4。

圖1 10ug/mL咖啡酸對(duì)照品色譜圖Fig 1 Chromatogram of 10ug/mL caffeic acid reference substance

圖2 蒲公英提取物樣品中咖啡酸色譜圖Fig 2 Caffeic acid chromatogram of dandelion extract sample

圖3 10ug/mL咖啡酸對(duì)照品光譜圖Fig 3 Spectra of 10ug/mL caffeic acid reference substance

圖4 蒲公英提取物樣品中咖啡酸光譜圖Fig 4 caffeic acid spectrum of dandelion extract sample

由光譜圖可以看出對(duì)照品和樣品中咖啡酸的紫外最大吸收波長(zhǎng)分別為324.4、323.2 nm。測(cè)試比較323與324 nm波長(zhǎng)的峰面積，323 nm處咖啡酸峰面積更大些，見(jiàn)表2。定量檢測(cè)時(shí)選擇323 nm波長(zhǎng)。

表2 不同波長(zhǎng)的峰面積比較Tab 2 Comparison of pesk area of different wavelengths

2.3.2 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可以有效地分離各雜質(zhì)峰，在1～100 μg/mL的范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=70200x+38300，Y為咖啡酸峰面積，X為咖啡酸的濃度，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999，線性良好。見(jiàn)圖5。

圖5 咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig 5 Standard curve of caffeic acid

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 配制10 μg/mL咖啡酸對(duì)照品溶液，重復(fù)6份，進(jìn)樣，計(jì)算咖啡酸峰面積RSD為0.82%。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取10 μg/mL咖啡酸對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算咖啡酸峰面積RSD為0.51%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.4”項(xiàng)下10 μg/mL咖啡酸對(duì)照品溶液，在室溫放置3、6、12、24 h;在4 ℃放置3、6、12、24 h后，各進(jìn)樣5 μL，計(jì)算咖啡酸峰面積RSD為0.73%。

2.3.6 檢測(cè)限和定量限 0.25 μg/mL咖啡酸對(duì)照品溶液信噪比>3為檢出限，1 μg/mL 咖啡酸對(duì)照品溶液信噪比>10為定量限。

2.3.7 取樣量及校正方法的選擇 稱取蒲公英提取物樣品約0.5、0.2、0.1、0.05 g，各2個(gè)平行，處理后，約為0.5 g稱樣量的上機(jī)溶液的峰面積與10 μg/mL的對(duì)照品溶液的峰面積較為接近，其他的峰面積按比例減小，最終選取5 μg/mL的對(duì)照品溶液對(duì)約0.2 g稱樣量的上機(jī)溶液進(jìn)行定量計(jì)算，平均值為0.77 mg/g，與按標(biāo)準(zhǔn)曲線含量計(jì)算結(jié)果0.785 mg/g相差0.015 mg/g，隨著取樣量的減少，兩者計(jì)算的偏差越來(lái)越大，見(jiàn)表3，最終選擇稱取0.2 g樣品進(jìn)行處理，并按照相近峰面積濃度的單點(diǎn)計(jì)算含量。

表3 不同校正方法的含量結(jié)果比較Tab 3 comparison of content results of different correction methods

2.3.8 添加回收試驗(yàn) 精密稱取蒲公英提取物樣品約0.1 g，置15 mL離心管中，加8 mL咖啡酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，加5%甲酸甲醇溶液2 mL，同供試品同樣處理上機(jī)測(cè)試?；厥章试?4%～101%的范圍內(nèi)，滿足準(zhǔn)確度的要求。

表4 咖啡酸添加回收率結(jié)果Tab 4 Results of recovery for caffeic acid

3 討論與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)選擇了超高效液相色譜法對(duì)蒲公英提取物中的咖啡酸進(jìn)行定性和定量測(cè)定。與2015版中國(guó)獸藥典[1]、中國(guó)藥典[2]中蒲公英的檢測(cè)方法和文獻(xiàn)報(bào)道方法相比[3-8]，一是鑒別采用了光譜法，省卻了薄層色譜法鑒別[1-2]繁瑣的操作，節(jié)省了多種如乙酸乙酯、乙酸丁酯等有機(jī)溶劑的使用，保護(hù)了環(huán)境；二是采用了UPLC，定量的色譜圖出峰保留時(shí)間提前至3.5 min左右，運(yùn)行時(shí)間短12 min，流速0.35 mL/min，比文獻(xiàn)HPLC方法[1-8]節(jié)省了大量的流動(dòng)相；三是摒棄了甲醇：磷酸鹽緩沖液等[1-8]作為流動(dòng)相，降低了色譜柱因磷酸鹽易堵的風(fēng)險(xiǎn)。

使用超高效液相色譜-PDA檢測(cè)器，對(duì)蒲公英提取物中的咖啡酸進(jìn)行定性和定量測(cè)定，方法準(zhǔn)確度高，靈敏度好，經(jīng)濟(jì)可行，綠色環(huán)保，并為生產(chǎn)企業(yè)下一步調(diào)整優(yōu)化蒲公英提取物的生產(chǎn)工藝提供快速的檢測(cè)方法。