楊慧，孫耀貴，孫娜，尹偉，范闊海，李宏全

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

病毒性心肌炎是由多種病毒感染引起的，以心肌細(xì)胞變性、壞死、間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤和纖維滲出為主要改變的心肌疾病。臨床上豬瘟、豬腦心肌炎病毒、豬丹毒、豬肺疫、炭疽、口蹄疫等多種病毒與細(xì)菌感染仔豬造成了大量死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)使用抗病毒抑制劑、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑來治療病毒性心肌炎，僅能控制病毒復(fù)制、改善血液動力學(xué)，并不能全方位的治療疾病[1]。中藥復(fù)方不僅具有價格低廉、不易產(chǎn)生耐藥性的特點，還可以從根本和整體上調(diào)理機(jī)體。

實驗室根據(jù)臨床經(jīng)驗研發(fā)的板芪口服液是將板藍(lán)根、丹參、黃芪、黃芩等藥材合理配伍而成。單味藥材具有涼血消癰、益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、調(diào)節(jié)免疫等功效，針對病毒性心肌炎也具有良好的治療效果。其中板藍(lán)根具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛及抗病毒的作用[2]；丹參具有涼血消癰之功效，可用于胸痹心痛，其主要成分丹參酮ⅡA具有很好抗病毒作用，并可修復(fù)心肌損傷[3]；黃芪具有抗病毒及調(diào)節(jié)免疫的作用[4]，可以改善急性病毒性心肌炎心肌結(jié)構(gòu)的損傷、抗心律失常和保護(hù)心肌[5-6]；黃芩具有抗病毒、抗炎和調(diào)節(jié)免疫損傷的功效[7]。研究將諸藥合理配伍以期對治療病毒性心肌炎能達(dá)到更好的效果。

研究旨在探討板芪口服液對小鼠急性毒性試驗的安全性，對大鼠長期毒性試驗中大鼠周增重、血液生化及組織病理學(xué)的影響，以及長期毒性試驗2周恢復(fù)期是否具有毒性可逆反應(yīng)和遲發(fā)性反應(yīng)，為臨床提供毒理方面的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 板芪口服液由山西奧信動物藥業(yè)有限責(zé)任公司試生產(chǎn)。規(guī)格為1 g生藥·mL-1，生產(chǎn)批號：20171123。板芪口服液由黃芪、板藍(lán)根、丹參、黃芩等藥材分二次煎煮，合并煎煮液濾過，濃縮至工藝要求密度后濾過灌封。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)條件 SD大鼠，80只，SPF 級，雌雄各半，體重60～90 g，昆明系小鼠60只，SPF 級，雌雄各半，體重18～20 g ，由北京市海淀興旺動物養(yǎng)殖場提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2014-0013。每日自由飲水進(jìn)食，飼養(yǎng)條件良好，符合動物倫理委員會的管理準(zhǔn)則。

1.3 實驗儀器 全自動血液分析儀(海力孚 HF-3800)；AU-400全自動生化分析儀(海力孚 HF-8004)；石蠟包埋機(jī)(KD-BM型，浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠)；全自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2265型，德國徠卡)；攤片機(jī)(德國徠卡)。

1.4 主要試劑 蘇木素染色液、伊紅染色液、中性樹膠、苦味酸均購自 Solarbio 公司。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、血糖(GLU)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、總膽固醇(TCH) 試劑盒購自長春匯力生物技術(shù)有限公。肌酐(CREA)、甘油三酯(TG) 購于南京建成生物工程研究所。

1.5 板芪口服液對小鼠急性毒性試驗 預(yù)試驗將板芪口服液煎至最大藥物濃度。30只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分3組，以最大給藥容積24 h內(nèi)分3次給藥，飼養(yǎng)觀察一周，小鼠健康活潑，無一死亡。

因無法獲得半數(shù)致死量，正式試驗取健康小鼠30只，雌雄各半，稱重，以最大給藥劑量270 g生藥·kg-1灌胃。連續(xù)觀察7 d，并稱重記錄；如有死亡立即剖檢觀察；14 d后處死，尸檢肉眼觀察內(nèi)臟器官有無異常改變。

1.6 板芪口服液對大鼠長期毒性試驗 將80只大鼠隨機(jī)分為板芪口服液低、中、高劑量組和空白對照組，每組20只，雌雄各半。板芪口服液三個劑量分別為10 、20、40 g生藥/kg體重，分別相當(dāng)于豬臨床推薦量的20、40、80倍，對照組灌服等體積蒸餾水，給藥容積為1 mL·100 g-1體重，連續(xù)給藥30天。每周稱重一次，按新的體重調(diào)整給藥量。停藥后24 h每組取14只大鼠，雌雄各半，進(jìn)行血液學(xué)、血液生化指標(biāo)檢測，并進(jìn)行系統(tǒng)尸檢及主要臟器病理組織學(xué)檢查。各組剩余大鼠停藥后繼續(xù)觀察2周，同法進(jìn)行上述指標(biāo)的測定和檢查。在整個試驗階段每天觀察大鼠精神狀態(tài)、行為、活動、毛色、二便等一般體征。

1.7 長期毒性試驗主要臟器解剖及組織學(xué)觀察 分別于末次給藥后24 h和停藥后第15 d，對試驗大鼠進(jìn)行系統(tǒng)解剖，肉眼觀察看有無異常變化。并制作心、肝、脾、肺、腎、睪丸、卵巢、甲狀腺、淋巴結(jié)、腎上腺、胸腺、十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸的組織切片，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，看有無異常變化。

1.8 統(tǒng)計方法 統(tǒng)計方法采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 板芪口服液對小鼠急性毒性試驗 小鼠給藥后，連續(xù)觀察7 d，全部存活，行為及活動正常，未見不良反應(yīng)。體重增長(表1)。

表1 板芪口服液對小鼠體重的影響 Tab 1 Effect of Banqi(Oral liquid)on the body weight of mice

給藥觀察14 d內(nèi)，無動物死亡。剖檢，肉眼觀察無病理變化。小鼠最大給藥劑量為270 g生藥·kg-1，相當(dāng)于豬臨床推薦劑量(0.5 g生藥·kg-1)的540倍，說明板芪口服液安全評價為無毒。

2.2 板芪口服液對大鼠長期毒性試驗 由表2、3可知，各給藥組雌性和雄性大鼠平均周增重與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。末次給藥后24 h及停藥后15 d，各給藥組大鼠的血液學(xué)指標(biāo)和血液生化指標(biāo)與空白對照組相比無顯著性差異，結(jié)果見表4、表5。

表2 板芪口服液對雌性大鼠平均周增重的影響Tab 2 Effect of Banqi oral liquid on the average weight gain of female rats

同行數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，右上角字母相同表示差異性不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

表3 板芪口服液對雄性大鼠平均周增重的影響Tab 3 Effect of Banqi oral liquid on the average weight gain of male rats

表4 板芪口服液對大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響Tab 4 Effects of Banqi oral liquid on hematological indexes in rats

表5 板芪口服液對大鼠血液生化指標(biāo)的影響Tab 5 Effect of Banqi oral liquid on blood biochemical indexes in rats

2.3 臟器病理解剖及組織學(xué)檢查 末次給藥后24 h及停藥后15 d，對板芪口服液高劑量組大鼠進(jìn)行系統(tǒng)尸檢及HE染色，并與空白對照組進(jìn)行比較。由圖1可見(1)心肌纖維平行排列，胞漿染色均勻，胞核清晰呈橢圓形。(2)肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，以中央靜脈為中心，肝細(xì)胞索和肝血竇向周圍呈放射狀排列，胞漿豐富。(3)脾臟中白髓動脈周圍淋巴鞘和脾小體邊界清楚，紅髓中脾血竇和脾索結(jié)構(gòu)清晰。(4)肺泡組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)清晰，肺泡無塌陷及破裂，肺泡充盈適度，肺泡囊管壁結(jié)構(gòu)完整。(5)腎臟中腎小體結(jié)構(gòu)完整，腎小球位于小體中央且結(jié)構(gòu)完整。

由圖2可見，(1)睪丸曲精細(xì)管排列整齊，管腔中無脫落的細(xì)胞，支持細(xì)胞正常。(2)卵巢內(nèi)可見卵巢上皮細(xì)胞和卵泡細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則。(3)甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)清晰，以扁平細(xì)胞為主，濾泡間結(jié)締組織少，血管豐富。(4)淋巴結(jié)皮質(zhì)內(nèi)淋巴小結(jié)輪廓清晰，生發(fā)中心明顯，副皮質(zhì)較寬。(5)腎上腺皮質(zhì)與髓質(zhì)分界明顯。皮質(zhì)部球狀帶、束狀帶、網(wǎng)狀帶的細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。(6)胸腺皮髓界限清楚，小葉明顯，皮質(zhì)部成熟的淋巴細(xì)胞較多，髓質(zhì)部可見明顯的胸腺小體。由圖3可見，十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸、直腸腸絨毛上皮完整，固有層無損傷，黏膜下層、肌層未見病變。

圖1 大鼠主要臟器組織切片(HE×400)Fig 1 The main organs of rats histopathology (HE×400)

圖2 大鼠臟器組織病理學(xué)(HE×400)Fig 2 The organs of rats histopathology (HE×400)

圖3 大鼠腸道組織切片(HE×100)Fig 3 Intestinal histopathology in rats (HE×100)

3 討論與結(jié)論

試驗根據(jù)獸藥研究技術(shù)指導(dǎo)原則[8]探究板芪口服液的安全性。初步預(yù)試驗中將板芪口服液濃縮至最大濃度6 g/mL，此時藥物無沉淀且恰好能通過12號灌胃針。小鼠24 h內(nèi)經(jīng)口多次給藥達(dá)最大容積，一般0.8～1 mL，觀察小鼠一周，除第1天小鼠灌胃后出現(xiàn)短暫不適，活動減少以外，未見動物中毒與死亡。因受小鼠給藥容積與藥物濃度的限制，無法測定LD50，因此，以最大給藥量(MTD)進(jìn)行試驗[9]。本試驗小鼠最大給藥劑量為270 g生藥·kg-1體重，相當(dāng)于豬臨床推薦劑量(0.5 g生藥·kg-1體重)的540倍，急性毒性試驗中安全評價為無毒。

長期毒性試驗是通過臨床表現(xiàn)、血液學(xué)、血清生化、病理組織切片來考察灌胃藥物對大鼠持續(xù)給藥的毒性。血液學(xué)指標(biāo)反映機(jī)體內(nèi)環(huán)境及造血功能的變化，血清生化指標(biāo)檢驗機(jī)體生理成分、代謝情況及重要器官的功能狀態(tài)，其中腎功能及肝功能的變化是考察藥物是否存在蓄積毒性。本試驗結(jié)果顯示板芪口服液各劑量組血液學(xué)與血清生化結(jié)果均在正常參考值范圍內(nèi)，與空白組相比無顯著差異。長期毒性試驗2周恢復(fù)期結(jié)果表明板芪口服液沒有出現(xiàn)毒性可逆反應(yīng)和遲發(fā)性反應(yīng)。板芪口服液治療的靶器官為心臟，從病理切片來看高劑量組并未對大鼠心臟造成傷害，對其它主要臟器、免疫器官、生殖器官及腸道也未造成損害，由此說明板芪口服液安全無毒，可用于臨床試驗。

另一方面，由于中醫(yī)辨證施治的靈活性導(dǎo)致臨床用藥的千差萬別，使得防治病毒性心肌炎病的單味有效藥物篩選較為困難，且單味中藥組成成分復(fù)雜，有效成分的確定和分離提取困難，嚴(yán)重影響藥物的開發(fā)與應(yīng)用。多數(shù)單味中藥的實驗研究是通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素水平[10]、氧化應(yīng)激損傷及影響NF-kB信號通路[11]，起到治療病毒性心肌炎的作用。而中藥復(fù)方制劑則是從降低心肌酶水平，改善心肌細(xì)胞的病理損傷，調(diào)節(jié)免疫等方面進(jìn)行。馬麗等[12]發(fā)現(xiàn)益心康能夠降低心肌酶水平，減輕細(xì)胞病變，保護(hù)心肌。何偉等[13]認(rèn)為益氣活血中藥復(fù)方可從細(xì)胞免疫、體液免疫及紅細(xì)胞免疫等方面起到雙向調(diào)節(jié)作用。中醫(yī)藥整體調(diào)節(jié)治療的優(yōu)勢，是西醫(yī)單一化學(xué)合成藥及中藥單體成分難以達(dá)到的。同時，中藥復(fù)方因制備較為簡單，價格低廉，藥物毒性低，安全性高，在臨床上受到廣泛關(guān)注。實驗室研發(fā)的板芪口服液根據(jù)臨床經(jīng)驗組方改進(jìn)，將具有涼血消癰、益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、調(diào)節(jié)免疫，尤其對治療病毒性心肌炎有良好作用的單味藥材科學(xué)配伍，經(jīng)過毒理試驗證明其安全性，為之后的藥理及臨床試驗奠定基礎(chǔ)。