姜秀云，董陽(yáng)，包艷紅，張建寧，方詩(shī)文，金海玲，王寧，馬紅霞*

( 1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長(zhǎng)春130118；3.長(zhǎng)春科技學(xué)院生物食品學(xué)院，長(zhǎng)春130600)

牛結(jié)核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛結(jié)核桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的牛、鹿等多種動(dòng)物及人共患的慢性細(xì)菌性疫病，是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties, OIE)規(guī)定的B類疫病之一。人通過(guò)與患病動(dòng)物的密切接觸[1]及飲用未消毒的乳制品[2]而患病。另外，人結(jié)核分枝桿菌也可傳播給牛和其他動(dòng)物[3-4]，從牛乳[5]和不同動(dòng)物組織[6-7]中可廣泛地分離出結(jié)核分枝桿菌。可見(jiàn)，致病性結(jié)核桿菌可在人和動(dòng)物之間的相互傳播，給結(jié)核病的控制帶來(lái)了相當(dāng)?shù)睦щy。目前，檢測(cè)牛結(jié)核病唯一的方法是OIE指定的牛結(jié)核菌素(Purified Protein Derivative，PPD)變態(tài)反應(yīng)[8]，但是該方法存在較高的非特異性反應(yīng)，由此造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失令許多發(fā)展中國(guó)家難以承擔(dān)。而現(xiàn)有的臨床上唯一應(yīng)用的疫苗——卡介苗(Bacillus of Calmette and Guerin，BCG)又不能用于牛的接種。因此，畜牧業(yè)生產(chǎn)中亟需適于牛結(jié)核病診斷和預(yù)防的新型抗原和疫苗。

MPB70和ESAT-6是結(jié)核分枝桿菌分泌到細(xì)胞外的主要蛋白質(zhì)，MPB70是菌體表面蛋白，但BCG中表達(dá)水平低下或不表達(dá)[9]，ESAT-6是菌體的毒力因子，由RD1區(qū)基因編碼，只存在于致病結(jié)核分枝桿菌中，但不存在于環(huán)境分枝桿菌和BCG中，已被提議作為區(qū)分感染和接種動(dòng)物試驗(yàn)候選抗原[10]。另外，MPB70中存在多個(gè)Th1型細(xì)胞抗原表位[11]，能誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生IFN-γ[12]，ESAT-6能夠引起顯著的體液免疫和細(xì)胞免疫[13]及有效的保護(hù)作用[14]?？梢?jiàn)，MPB70和ESAT-6均是結(jié)核病新型診斷抗原和疫苗的靶點(diǎn)。目前，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注血清學(xué)方法與傳統(tǒng)的細(xì)胞介導(dǎo)免疫技術(shù)相結(jié)合，以提高結(jié)核感染的檢出率，尤其是利用融合蛋白或多重抗原來(lái)提高血清學(xué)診斷的敏感性[15-18]。因此，將MPB70和ESAT-6兩個(gè)特異性抗原基因通過(guò)重疊延伸 ( Splicing by Overlapping Extension，SOE) PCR技術(shù)相融合，并進(jìn)行原核表達(dá)及抗原反應(yīng)性分析，為融合蛋白MPB70-ESAT-6用于牛結(jié)核病的診斷及疫苗研制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因、載體及菌株 pGEM-T-70和pGEM-T-esat-6由吉林省新獸藥研發(fā)與創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；pET28a(+)為Novagen公司產(chǎn)品；T-Vector pMD19購(gòu)于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；EscherichiacoliDH5ɑ、E.coliJM109、E.coliBL21(DE3)為吉林省新獸藥研發(fā)與創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室留存。

1.2 酶與主要試劑BamHⅠ、EcoRⅠ、T4 DNA Ligase、LATaqDNA聚合酶、Pyrobest DNA Polymerase、DNA Markers及DNA凝膠回收試劑盒均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；卡那霉素(Kanamycin，Kan)、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)均Amresco公司產(chǎn)品；異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG)為Invitroge公司產(chǎn)品；Ni-NTA Agarose為QIAGEN公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)為Roche公司產(chǎn)品；牛結(jié)核陽(yáng)性血清采自結(jié)核病變牛；HRP標(biāo)記羊抗牛IgG為北京百奧萊博科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 依據(jù)mpb70、esat-6的堿基序列，利用生物軟件設(shè)計(jì)PCR引物，序列見(jiàn)表1，由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司合成。引物P1-70、P2-esat-6中分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。

表1 引物序列Tab 1 Sequence of Primer

1.4 融合基因的擴(kuò)增 首先利用pGEM-T-70、pGEM-T-esat-6為模板，以P1-70和P2-70、P1-esat-6和P2-esat-6為引物，應(yīng)用Pyrobest DNA Polymerase分別對(duì)mpb70與esat-6基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。再以mpb70和esat-6的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以P1-70-和P2-esat-6為引物，通過(guò)LATaqDNA對(duì)mpb70-esat-6進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物利用凝膠回收純化試劑盒純化。

1.5 mpb70-esat-6的克隆和序列分析 將mpb70-esat-6和T-Vector pMD19用Solution I連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD-70-esat-6，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)E.coliJM109中，振蕩培養(yǎng)1 h，于固體LB培養(yǎng)基(100 mg/L Amp)中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化菌于液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，進(jìn)行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切，重組質(zhì)粒由吉林省庫(kù)美生物科技有限公司予以測(cè)序。

1.6 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 以BamHⅠ、EcoRⅠ酶切pMD-70-esat-6和pET28a(+)，回收產(chǎn)物通過(guò)T4 DNA Ligase連接，構(gòu)建pET-70-esat-6。轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，于LB(50mg/L Kan)固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)化菌經(jīng)液體LB培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒并酶切分析。

1.7 mpb70-esat-6的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將重組菌接種于含Kan的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)至OD600nm≥0.65，用1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，而后每小時(shí)留存少量菌液，共誘導(dǎo)7 h。將留存的菌液OD600nm調(diào)至0.65，吸菌液1.0 mL，離心后，于菌體中加雙蒸水80 μL。加上樣緩沖液，煮沸處理后，進(jìn)行SDS-PAGE。

1.8 MPB70-ESAT-6表達(dá)形式分析 將表達(dá)菌株接種于200 mL液體LB中培養(yǎng)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)4 h后，離心收集菌體。超聲破碎后，離心分離上清與沉淀，對(duì)上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE。

1.9 MPB70-ESAT-6的反應(yīng)性分析 采用Western blotting分析MPB70-ESAT-6的反應(yīng)性。誘導(dǎo)后的表達(dá)菌→超聲破碎→裂解液上清→Ni-NTA Agarose柱純化→SDS-PAGE→轉(zhuǎn)膜→BSA封閉后，再依次進(jìn)行如下反應(yīng)：牛結(jié)核陽(yáng)性血清→HRP標(biāo)記羊抗牛IgG→聯(lián)苯胺反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.1 融合基因擴(kuò)增產(chǎn)物mpb70、esat-6及mpb70-esat-6 擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。圖中可見(jiàn)mpb70、esat-6和mpb70-esat-6 DNA片段分別是545 bp、341 bp、841 bp，與預(yù)期大小相一致。

1-3: 分別為mpb70、esat-6和mpb70-esat-6 基因的 PCR產(chǎn)物; M: DNA Marker1-3: PCR products of mpb70, esta-6 and mpb70-esat-6 genes, respectively; M: DNA Marker /DL2000 圖1 mpb70, esat-6和mpb70-esat-6的PCR擴(kuò)增Fig 1 PCR amplification of mpb70,esat-6 and mpb70-esat-6 genes

2.2 mpb70-esat-6的克隆與鑒定 mpb70-esat-6與載體pMD19連接，獲得了pMD-70-esat-6， 經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切后，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。圖中可見(jiàn)約2690 bp的pMD19和841 bp的mpb70-esat-6。序列測(cè)定后分析顯示，mpb70-esat-6 融合基因的大小為841 bp，與預(yù)期大小一致，而且沒(méi)有堿基的插入、缺失及替換現(xiàn)象，成功地得到了牛結(jié)核桿菌mpb70-esat-6融合基因。

2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 mpb70-esat-6和載體pET28a(+)連接，構(gòu)建了pET-70-esat-6，經(jīng)BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，獲得了約5300 bp的pET28a(+)和841 bp的mpb70-esat-6(圖3)。

2.4 SDS-PAGE分析E.coliBL21(DE3)中的pET-70-esat-6經(jīng)IPTG誘導(dǎo)各時(shí)間的表達(dá)結(jié)果如圖4所示。圖中可見(jiàn)mpb70-esat-6得到了表達(dá)，MPB70-ESAT-6的相對(duì)分子量約為27.2 ku，誘導(dǎo)后表達(dá)量明顯增加，4 h后達(dá)到最高，在超聲裂解液的上清和沉淀中均存在，說(shuō)明MPB70-ESAT-6以可溶性和包涵體兩種形式獲得了表達(dá)，這種可溶性表達(dá)有利于后續(xù)的純化。而pET28a(+)E.coliBL21(DE3)中則沒(méi)有見(jiàn)到該蛋白的表達(dá)。

2.5 MPB70-ESAT-6的反應(yīng)性分析 mpb70-esat-6融合基因表達(dá)的MPB70-ESAT-6融合蛋白Western blotting分析結(jié)果見(jiàn)圖5，圖中27 ku 處存在一條明顯的蛋白印跡帶，表明表達(dá)的MPB70-ESAT-6能夠與牛結(jié)核陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，且有著良好的反應(yīng)性。

1-2: pMD-70-esat-6的酶切產(chǎn)物; M: DNA Marker DL20001-2: Products of pMD-70-esat-6 digested by enzyme; M: DNA Marker DL2000圖2 重組質(zhì)粒pMD-70-esat-6的酶切鑒定Fig 2 Restriction analysis map of pMD-70-esat-6

M1: DNA Marker DL2000; 1: pET-70-esat-6; 2: pET-70-esat-6的酶切產(chǎn)物; M2: λ DNA digested with Hind ⅢM1: DNA Marker DL2000; 1: pET-70-esat-6; 2: Products of pET-70-esat-6 digested by enzyme; M2: λ DNA digested with Hind Ⅲ圖3 原核表達(dá)質(zhì)粒的酶切鑒定Fig 3 Restriction analysis map of pET-70-esat-6

1: pET-28a(+)在E.coli BL21中誘導(dǎo)7 h;2-9: 分別是pET-70-esat-6在E.coli BL21中誘導(dǎo)0～7 h; M: 蛋白質(zhì)Marker; 10: pET-70-esat-6在E.coli BL21中誘導(dǎo)后裂解的沉淀;11: pET-70-esat-6在E.coli BL21中誘導(dǎo)后裂解的上清1: pET-28a(+) expression result in E.coli BL21 with IPTG induced 7 h, as control; 2-9: pET-70-esat-6 expression results in E.coli BL21 with IPTG induced 0～7 h, respectively; M: Protein Marker;10: Cleavage liquid precipitate of pET-70-esat-6 in E.coli BL21 with IPTG induced; 11: Cleavage liquid supernatant of pET-70-esat-6 in E.coli BL21 with IPTG induced圖4 mpb70-esat-6 在E.coli BL21中的表達(dá)Fig 4 mpb70-esat-6 fusion gene recombinant expression plasmid expressed by prokaryotic expression vector in E.coli BL21

1-3: MPB70-ESAT-6; M: 蛋白質(zhì)Marker1-3: MPB70-ESAT-6; M: Protein Marker圖5 MPB70-ESAT-6 的Western blotting分析Fig 5 Western blotting analysis of the MPB70-ESAT-6 fusion protein

3 討 論

迄今為止，動(dòng)物結(jié)核病一直在采取檢疫-隔離-淘汰的防制策略，但始終未能從根本上得以控制。究其原因，一方面是存在結(jié)核動(dòng)物的漏檢情況，另一方面尚無(wú)實(shí)用的疫苗。因此，新型、安全、高效結(jié)核病疫苗和敏感、特異檢測(cè)抗原的研制，以及簡(jiǎn)便、快速、易行診斷方法的建立則一直倍受注目。

在結(jié)核病免疫學(xué)診斷研究中，有報(bào)道指出，牛結(jié)核桿菌MPB70、MPB83、MPB63、ESAT-6和CFP10等可能是結(jié)核病血清學(xué)診斷最為有用的抗原[19]。MPB70、MPB83、ESAT-6、CFP10四種抗原在多重ELISA分析中的敏感性為74.2%，特異性為94.9%[15]，MPB70檢測(cè)的陽(yáng)性血清抗體效價(jià)有50%達(dá)1∶64000[16]。MPB83/MPB70融合蛋白對(duì)自然感染的結(jié)核牛血清檢測(cè)的敏感性為63%，特異性為98%[17]。p22(主要是MPB70和MPB83的復(fù)合物)ELISA對(duì)赤鹿檢測(cè)的敏感性和特異性分別為99.02%和70.1%[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，與ESAT-6相比，PE/PPE肽-ESAT-6融合蛋白的免疫應(yīng)答增強(qiáng)，攻毒后，能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分泌IL-2+/IFN-γ+，且脾臟中的菌落形成單位低于ESAT-6[20]。ESAT-6 與IgG1 Fcγ的融合能夠靶向APC的FcγR，從而增強(qiáng)免疫原性[21]?？梢?jiàn)，融合蛋白或多重抗原在結(jié)核病的診斷和疫苗的研究中有著良好的應(yīng)用前景。

本研究利用45個(gè)核苷酸Linker將牛結(jié)核桿菌mpb70和esat-6兩個(gè)保護(hù)性抗原基因融合，通過(guò)(Gly4Ser)3的柔性肽將MPB70和ESAT-6連接并隔離，以防兩個(gè)蛋白在空間結(jié)構(gòu)折疊時(shí)產(chǎn)生干擾。本研究成功地獲得了mpb70-esat-6融合基因，序列分析表明堿基序列準(zhǔn)確無(wú)誤。由此構(gòu)建了mpb70-esat-6的原核表達(dá)重組質(zhì)粒，并在E.coli中表達(dá)了MPB70-ESAT-6，且具有良好的抗原反應(yīng)性，為進(jìn)一步研究MPB70-ESAT-6作為牛結(jié)核病的診斷抗原和亞單位疫苗奠定了基礎(chǔ)。