張 毅，孟祥雯

（湖北科技學(xué)院醫(yī)藥研究院糖尿病心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 咸寧 437100）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）作為21世紀(jì)發(fā)展最迅速的慢性疾病之一，嚴(yán)重危害人類的身體健康。其主要是由胰島素抵抗或胰島素分泌不足或兩者共同作用而導(dǎo)致血糖持續(xù)升高［1］。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)的數(shù)據(jù)，到2035年，全世界DM患者的數(shù)量將從2013年的3.82億增加到5.92億［2］。DM心肌纖維化（DM myocardial fibrosis，DMMF）作為糖尿病心肌?。╠iabetic cardio myopathy，DCM）最主要的并發(fā)癥，是各種心血管疾病的共同病理特征，主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積，被認(rèn)為是DCM的最初改變。在心肌纖維化過(guò)程中，膠原扮演著重要角色。正常生理?xiàng)l件下，膠原的產(chǎn)生和降解處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而高糖、高脂等病理因素可刺激心肌成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖，膠原過(guò)度積聚，導(dǎo)致間充質(zhì)重塑和結(jié)構(gòu)紊亂，損害心功能，而致心力衰竭［3］。

參與心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的因子很多，其中最重要的因子之一是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）。它主要通過(guò)誘導(dǎo)下游經(jīng)典的Smad通路參與DMMF的發(fā)生發(fā)展。而相關(guān)研究表明，TGF-β1誘導(dǎo)的非經(jīng)典信號(hào)通路如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），NF-κB都在心肌纖維化中發(fā)揮著重要作用［4-5］。

阿格列?。╝logliptin，Alog）屬于二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制劑，是一類新型的口服降糖藥物，被廣泛應(yīng)用于治療2型DM（type 2 DM，DM2）。DPP-4抑制劑主要通過(guò)抑制胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptidase-1，GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽（glucosedependent insulinotropic polypeptide，GIP）的降解，提高內(nèi)源性GLP-1和GIP的水平，促進(jìn)胰島素的產(chǎn)生和釋放，從而改善血糖水平［6］。

目前，世界范圍內(nèi)已上市多種DPP-4抑制劑，如Alog、西格列汀、利格列汀和維格列汀等。靶向DPP-4抑制劑越來(lái)越被認(rèn)為是有前景的抗DM藥物。而在控制血糖的同時(shí)，預(yù)防和降低心血管風(fēng)險(xiǎn)也顯得尤為重要。相關(guān)研究表明，Alog能減輕DM大鼠肝及心肌纖維化程度，改善心功能［7-8］，然而其分子機(jī)制尚不清楚。因此，本研究采用高糖高脂聯(lián)合鏈佐星（streptozocin，STZ）誘導(dǎo)建立DM2大鼠心肌纖維化模型，再給予Alog進(jìn)行治療，探討Alog對(duì)DM2大鼠心肌纖維化的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制，為Alog在DMMF的臨床治療應(yīng)用中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和主要儀器

雄性Sprague Dawley（SD）大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證批號(hào)：SCXK（鄂）2010-0009。苯甲酸Alog片（武田藥品工業(yè)株式會(huì)社大阪工廠）；STZ粉末和小鼠抗人TGF-β1單克隆抗體（SAB5300197）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人膠原Ⅰ型多克隆抗體（ab34710）和兔抗人膠原Ⅲ型多克隆抗體（ab6310）、兔抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體Ⅱ（transforming growth factor-β receptorⅡ，TβRⅡ）多克隆抗體（ab186838）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶1（transforming growth factor activated kinase 1，TAK1）多克隆抗體（#4505）、兔抗人P38-MAPK多克隆抗體（#9212）、兔抗人c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）多克隆抗體（#9252）和小鼠抗人磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）單克隆抗體（#9255s）購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（BL003A）購(gòu)自biosharp公司，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑（G1004）和Masson染色試劑（G1006）購(gòu)自武漢塞維爾公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）購(gòu)自碧云天公司；RIPA裂解液（radio immunprecipitation assay lysis buffer，RIPA）和蛋白酶抑制劑（protease inhibitor cocktail）購(gòu)自美國(guó)CST公司；二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；電化學(xué)發(fā)光（electro-chemiluminescence，ECL）顯影液購(gòu)自武漢愛博泰克公司。BX53-正置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；LP-渦旋振蕩儀（Thermo Scientific公司，美國(guó)）；AL104-電子分析天平（METTLER TOLEDO公司，瑞士）；Universal HoodⅡ-凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國(guó)），5424R-低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)）；Synergy2-酶標(biāo)儀（BioTek公司，美國(guó)）；PowerPac Basic-垂直電泳儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的制備

分別給予大鼠4周高糖（10%）和高脂（20%）的飲食，單次ip給予STZ 55 mg·kg-1制備DM2大鼠模型。正常對(duì)照組大鼠飼喂正常飼料，ip給予等量檸檬酸緩沖液。檢測(cè)空腹血糖≥16.7 mmol·L-1即為DM2造模成功。將DM2大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（n=10）、Alog藥物對(duì)照（Alog）組（n=10）、模型（DM2）組（n=10）和Alog治療（DM2+Alog）組（n=10）。Alog（每天5 mg·kg-1）通過(guò)ig給藥，正常對(duì)照組和DM2組給予等量生理鹽水。自高糖高脂喂養(yǎng)起，16周后處死大鼠［9］，取各組心尖組織置于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，用于HE和Masson染色及免疫組化分析，左心室組織于液氮中冷凍后置-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HE染色觀察大鼠心肌組織病理變化

各組心肌組織固定后，進(jìn)行脫水、石蠟包埋，然后切片。將組織切片于60℃烤箱烘干1 h，然后脫蠟至水，蘇木素染液浸染5 min，蒸餾水洗，1%鹽酸乙醇分化6 s，蒸餾水洗，0.6%氨水返藍(lán)10 s，蒸餾水洗，伊紅染液浸染5 min，蒸餾水洗，脫水透明后采用中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化并拍照。

1.4 Masson染色觀察大鼠心肌組織膠原纖維沉積

各組心肌組織固定后，脫水，石蠟包埋。待蠟塊充分凝固后切片，60℃烘干1 h后，脫蠟至水，進(jìn)行Masson染色。

用配制好的鐵蘇木素染液浸染5 min，蒸餾水沖洗，酸性乙醇分化10 s，蒸餾水洗，藍(lán)化液浸染3 min，蒸餾水洗，麗春紅染液浸染5 min，弱酸1 min，磷鉬酸1 min，苯胺藍(lán)1 min，弱酸1 min，然后脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察心肌組織膠原纖維沉積部位為藍(lán)色，正常心肌組織為紅色。

1.5 免疫組化法檢測(cè)大鼠心肌組織中膠原Ⅰ型和膠原Ⅲ型蛋白表達(dá)

各組大鼠心尖組織固定、脫水、石蠟包埋，然后切片，60℃烘干1 h后，脫蠟至水，加抗原修復(fù)液進(jìn)行微波抗原修復(fù)后，PBS洗3次，每次5 min，用3%H2O2避光封閉25 min后，PBS洗3次，每次5 min，滴加3%BSA室溫封閉30 min，瀝干多余BSA液體，滴加1∶100比例稀釋的一抗，于濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。PBS洗3次，每次5 min，滴加1∶100比例稀釋的羊抗兔IgG室溫孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加DAB染色液顯色，鏡下觀察陽(yáng)性細(xì)胞被染色后，水洗終止反應(yīng)，然后將片子放入蘇木素染液復(fù)染2～3 min，水洗1 min，1%鹽酸乙醇分化5 s，水洗2 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、風(fēng)干后中性樹膠封片。于普通光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織中膠原蛋白表達(dá)，陽(yáng)性區(qū)域呈深棕色。

1.6 Western印跡法檢測(cè)大鼠心肌組織中相關(guān)蛋白表達(dá)

取各組心肌組織30 mg，分別加含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，于冰浴條件下勻漿，再置于冰上裂解30 min后，在4℃條件下以12 000×g離心10 min，取上清轉(zhuǎn)移到新的EP管內(nèi)，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。然后將蛋白樣品與上樣緩沖液（3×）按2∶1體積比混合均勻后，95℃變性5 min。之后進(jìn)行SDSPAGE蛋白電泳，在冰浴條件下250 mA，3 h轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用TBST洗膜3次，然后用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，用1∶1000比例配制的一抗在4℃搖床上孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，用1∶10 000比例配制的二抗室溫?fù)u床上孵育1 h，TBST洗膜3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，使用ImageJ軟件進(jìn)行半定量分析，以目的條帶吸光度值與內(nèi)參條帶吸光度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Alog對(duì)2型糖尿病模型大鼠心肌組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)完整、排列規(guī)則、整齊；DM2組大鼠心肌細(xì)胞肥大且排列紊亂、松散，心肌間充質(zhì)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增殖；與DM2組大鼠比較，給與Alog治療后的大鼠心肌細(xì)胞肥大有所改善，纖維排列趨于整齊（圖1）。

2.2 Alog改善2型糖尿病模型大鼠心肌組織膠原的沉積

Masson染色結(jié)果顯示（圖2A和B），正常對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞間充質(zhì)中膠原纖維較少且分布均勻；DM2組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，膠原纖維明顯增加且主要在血管周圍沉積，為正常對(duì)照組的2.1倍（P＜0.05）；DM2+Alog組較DM2組心肌細(xì)胞排列趨于整齊，間充質(zhì)纖維化減少52%，幾乎恢復(fù)至正常水平（P＜0.05）。

Fig.1 Pathological changes in myocardial tissue of type 2 diabetic rats by HE staining.Rats were injected with streptozocin（STZ）55 mg·kg-1for one time，and then were ig given alogliptin（Alog）5 mg·kg-1per day for another twelve weeks.Arrow shows the pathological change of myocardial tissue.

Fig.2 Pathological changes in myocardial tissue of type 2 diabetic rats by Masson staining.See Fig.1 for the rat treatment.IA：integrated absorbtion.B：semi-quantitative results of A.±s，n=4-7.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM2 group.Arrows show the collagen accumulation of myocardial tissue.

2.3 Alog降低2型糖尿病模型大鼠心肌組織中膠原Ⅰ型和膠原Ⅲ型的表達(dá)

Fig.3 Effect of Alog on protein expression of collagenⅠand collagenⅢin myocardial tissue of type 2 diabetic rats by immunohistochemistry（lHC）.See Fig.1 for the rat treatment.A and C：protein expression of CollagenⅠand collagen Ⅲwere detected by immunohistochemistry；B and D：semi-quantitative result of A and C，respectively.±s，n=5-10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM2 group.Arrows show the protein expression of collagenⅠand Ⅲ.

免疫組化法檢測(cè)大鼠心肌組織中膠原表達(dá)（圖3），箭頭指示位置的棕色為膠原表達(dá)，較正常對(duì)照組相比，DM2組大鼠心肌組織中膠原Ⅰ型和膠原Ⅲ型表達(dá)明顯增多，分別約為正常對(duì)照組的5.2倍和1.4倍（P＜0.05）；Alog治療后大鼠心肌組織中膠原Ⅰ型、膠原Ⅲ型表達(dá)量顯著性降低，分別降低71%和28%（P＜0.05），說(shuō)明Alog能降低心肌組織中膠原的表達(dá)，減輕心肌纖維化。

2.4 Alog對(duì)2型糖尿病模型大鼠心肌組織膠原Ⅰ型、膠原Ⅲ型和TGF- β1蛋白表達(dá)的影響

Western印跡法檢測(cè)膠原Ⅰ型、膠原Ⅲ型和TGF-β1蛋白表達(dá)（圖4）。與正常對(duì)照組相比，DM2組大鼠心肌膠原Ⅰ型、膠原Ⅲ型及TGF-β1蛋白表達(dá)水平顯著提高，分別為正常對(duì)照組的1.6，1.7和1.8倍（P＜0.05），而Alog能夠下調(diào)大鼠心肌組織中膠原Ⅰ型、膠原Ⅲ型及TGF-β1蛋白表達(dá)，分別比DM2組降低19%，34%和45%（P＜0.05）。

2.5 Alog對(duì)2型糖尿病模型大鼠心肌組織T βRⅡ，TAK1，P38-MAPK和p-JNK的影響

Fig.4 Effect of Alog on protein expressions of collagenⅠ，collagen Ⅲ and transforming growth factor- β1（TGF- β1）in myocardial tissue of type 2 diabetic rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B：semi-quantitative results of A.±s，n=4.＊P＜0.05，compared with normal control group，#P＜0.05，compared with DM2 group.

Fig.5 Effect of Alog on protein expression of transforming growth factor- β receptorⅡ（T βRⅡ），transforming growth factor activated kinase 1（TAK1），P38 mitogen-activated protein kinase（P38-MAPK）and phosphorylation of c-jun N-terminal kinase（p-JNK）in myocardial tissue of type 2 diabetic rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B and D：semi-quantitative results of A and C.±s，n=4.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM2 group.

為進(jìn)一步研究Alog對(duì)DM2模型大鼠心肌纖維化的作用是否與TGF-β1誘導(dǎo)的非Smad依賴的P38-MAPK信號(hào)通路有關(guān)，采用Western印跡法檢測(cè)大鼠心肌組織中的TβRⅡ，TAK1，P38-MAPK及p-JNK的表達(dá)水平。與正常對(duì)照組相比，DM2組的TβRⅡ，TAK1，P38-MAPK和p-JNK表達(dá)顯著上升，分別為正常對(duì)照組的1.9，2.0，1.8和1.5倍（P＜0.05）（圖5）。與DM2組相比，Alog治療組TβRⅡ，TAK1，P38-MAPK和p-JNK表達(dá)明顯降低，分別降低38%，34%，39%和35%（P＜0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，高糖高脂聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的DM2模型大鼠中，心肌細(xì)胞發(fā)生明顯紊亂現(xiàn)象，膠原纖維大量累積，提示DM2模型大鼠MF模型的成功構(gòu)建。給予Alog治療后DM2模型大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)一定程度的恢復(fù)，且膠原表達(dá)顯著性降低，說(shuō)明Alog能對(duì)DM2模型大鼠心肌纖維化起到一定的調(diào)控作用。同時(shí)蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，DM2組大鼠心肌細(xì)胞中TGF-β1及TβRⅡ的表達(dá)增加，同時(shí)p-JNK、P38-MAPK及其上游激酶TAK1的表達(dá)也顯著增加；給予Alog治療后大鼠心肌組織中TGF-β1及 TβRⅡ的表達(dá)顯著降低，p-JNK，P38-MAPK和TAK1的表達(dá)也有不同程度的降低，Alog對(duì)DM2肌大鼠心肌纖維化起到一定的治療作用，而Alog的抗纖維化作用可能與非Smad依賴的TGF-β1/P38-MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

DMMF作為多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同特征主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖及膠原蛋白過(guò)度沉積。在正常生理情況下，心肌膠原的合成和降解受復(fù)雜的生長(zhǎng)因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，維持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。TGF-β1作為心肌纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因子之一，可通過(guò)經(jīng)典的TGF-β1/Smad信號(hào)通路及非Smad依賴信號(hào)通路參與DMMF的發(fā)生發(fā)展。在非Smad依賴的信號(hào)通路中，MAPK信號(hào)通路。主要包括JNK，ERK和P383大類。MAPK通過(guò)下游這3大類家族成員參與并影響成纖維細(xì)胞的增殖、遷移、分化以及ECM的沉積等，在纖維化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著促纖維化的作用［10］。本研究結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了TGF-β1介導(dǎo)的P38-MAPK信號(hào)通路參與DMMF進(jìn)程。而Alog作為新一代DPP-4抑制劑降糖藥物，多篇文獻(xiàn)已報(bào)道Alog可改善DM狀態(tài)下心肌損傷，緩解心肌纖維化［8，11-12］。同樣，本研究結(jié)果顯示，Alog能改善DM2大鼠心肌纖維化，且這種調(diào)節(jié)與TGF-β1介導(dǎo)的P38-MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

目前，Alog對(duì)心肌纖維化的保護(hù)機(jī)制研究主要集中在經(jīng)典的TGF-β1/Smads信號(hào)通路，對(duì)于非Smad依賴的信號(hào)通路鮮有報(bào)道。因此，本研究結(jié)果可為Alog抗心肌纖維化提供新的理論依據(jù)。同時(shí)鑒于目前尚無(wú)有效抗纖維化策略的現(xiàn)狀，心肌纖維化相關(guān)的其他信號(hào)通路的研究既可為心肌纖維化的發(fā)生機(jī)制提供新的理論支持，也可為心肌纖維化的藥物治療提供新的靶點(diǎn)。由于本研究只在大鼠DM2模型中探討了Alog通過(guò)P38-MAPK信號(hào)通路對(duì)心肌纖維化的調(diào)控機(jī)制，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)存在一定的局限性。今后應(yīng)在細(xì)胞水平上進(jìn)一步深入闡述Alog的抗心肌纖維化機(jī)制。