邵 雪＊，洛文靖＊，王海學(xué)，王慶利，任欣怡，宮新江

（1.國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心，北京 100022；2.上海益諾思生物技術(shù)股份有限公司，上海 201203）

生物制品進(jìn)入機(jī)體后，通常會引起體液和（或）細(xì)胞免疫機(jī)制介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，由免疫應(yīng)答引起的不良反應(yīng)多是體液免疫機(jī)制介導(dǎo)的，因此特異性抗藥抗體（anti-drug antibodies，ADA）一直是評價(jià)該類藥物免疫原性的主要標(biāo)準(zhǔn)［1-2］。ADA可能通過影響治療性蛋白與其靶點(diǎn)之間的藥效學(xué)作用或改變其藥動學(xué)特征而影響藥效，在某些情況下還可能會引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)甚至危及患者生命［3］。各監(jiān)管機(jī)構(gòu)如歐洲藥品管理局、美國食品藥物管理局和中國藥品監(jiān)督管理局高度關(guān)注生物制品導(dǎo)致的ADA產(chǎn)生情況及可能的臨床后果，建議研究者應(yīng)充分考慮產(chǎn)品特點(diǎn)、患者和預(yù)期的臨床目標(biāo)，開發(fā)靈敏度高、特異性強(qiáng)的檢測方法進(jìn)行多層次分析［4］，包括篩選試驗(yàn)、確證試驗(yàn)、滴度試驗(yàn)和（或）中和抗體試驗(yàn)及ADA分型試驗(yàn)等。目前，ADA的檢測主要有直接法和橋連法。在直接法中，藥物捕獲ADA后加入種屬特異性的抗體進(jìn)行檢測。該法存在種屬限制，且無法檢測所有亞類的ADA，尤其不適用于抗體類藥物臨床ADA的檢測。在橋連法中，藥物捕獲ADA后加入標(biāo)記的藥物，對形成的藥物-ADA-藥物復(fù)合物進(jìn)行檢測。橋連法不受種屬限制，可檢測所有亞類的ADA（如IgM和IgG）和除IgG4外大部分亞型而應(yīng)用更廣［5-6］。

橋連法檢測ADA易受多種因素影響，血液循環(huán)中可溶性靶點(diǎn)分子是常見的干擾因素之一。常見的影響ADA檢測的可溶性靶點(diǎn)分子包括：IgE［7］；生長因子如血管生成素［8］、神經(jīng)生長因子［9］和血管內(nèi)皮生長因子［10］；細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α［11-13］、白細(xì)胞介素5（interleukin-5，IL-5）［14］；糖基化可溶性靶點(diǎn)［15］和脫落的細(xì)胞膜蛋白［16］等?？扇苄园悬c(diǎn)分子會引起假陽性或假陰性結(jié)果，進(jìn)而影響藥物免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的評估，因此開發(fā)可降低可溶性靶點(diǎn)分子干擾的ADA檢測方法非常關(guān)鍵。本文討論可溶性靶點(diǎn)分子對橋連法檢測的潛在影響及相應(yīng)的應(yīng)對策略，以期為ADA檢測方法開發(fā)提供一定參考。

1 可溶性靶點(diǎn)分子對橋連法檢測的影響

作為ADA檢測的首選方法，橋連法易受基質(zhì)中多種因素影響，包括類風(fēng)濕因子［17］、高濃度藥物和可溶性靶點(diǎn)分子等。通過試驗(yàn)條件優(yōu)化如增加阻斷劑、樣品預(yù)處理如阿斯巴甜處理［18］或酸化，可減輕類風(fēng)濕因子及過量藥物的影響，提高檢測方法的靈敏度和特異性。但不同疾病基質(zhì)中可溶性靶點(diǎn)分子差異較大，目前仍未形成統(tǒng)一、便捷的解決方式。

除藥物本身即靶向的可溶性靶點(diǎn)分子外，由于疾病導(dǎo)致的生理差異，在血液中還可能存在從細(xì)胞膜表面脫落的靶點(diǎn)受體、因細(xì)胞裂解而釋放的胞內(nèi)靶點(diǎn)等可溶性靶點(diǎn)分子。可溶性靶點(diǎn)分子產(chǎn)生影響主要包括給藥前體內(nèi)高濃度的可溶性靶點(diǎn)分子可能干擾ADA檢測、與真實(shí)藥前數(shù)據(jù)偏離及對藥物免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的判斷；個體間可溶性靶點(diǎn)分子濃度不同，檢測結(jié)果藥前ADA個體差異大［19］，不利于臨界值的確定［20］。在某些情況下，雖給藥前較低的可溶性靶點(diǎn)分子濃度不會影響ADA檢測，但給藥后靶點(diǎn)受體從細(xì)胞膜脫離水平增加、內(nèi)在負(fù)反饋機(jī)制導(dǎo)致可溶性靶點(diǎn)分子分泌增多、靶點(diǎn)分子與藥物結(jié)合導(dǎo)致清除減慢和濃度增加等原因亦可能干擾ADA檢測［21-22］。

不同試驗(yàn)條件下，可溶性靶點(diǎn)分子的物理化學(xué)特征及其與藥物的相互作用、親和力大小決定了對ADA檢測干擾的程度。基質(zhì)中可溶性靶點(diǎn)形成的二聚體或多聚體直接與捕獲試劑和檢測試劑橋連而出現(xiàn)假陽性信號；而單體靶點(diǎn)分子與ADA競爭結(jié)合捕獲試劑導(dǎo)致假陰性結(jié)果［17］。此外，采用酸解離“藥物-ADA”復(fù)合物的同時會釋放與藥物（如單抗、融合蛋白）結(jié)合的靶點(diǎn)分子［22］，造成基質(zhì)中的靶點(diǎn)濃度迅速升高（可達(dá)數(shù)量級改變，如機(jī)體接受靶向血管內(nèi)皮生長因子的單抗或融合蛋白治療時），反而可能會導(dǎo)致異常的假陽性或假陰性結(jié)果［23］。

2 應(yīng)對可溶性靶點(diǎn)分子干擾的策略

目前，常用于降低可溶性靶點(diǎn)分子干擾的方法包括加入抗可溶性靶點(diǎn)分子抗體或受體、分離ADA、去除可溶性靶點(diǎn)分子、加入凝集素和檢測人可溶性IgG抗體的Fcγ受體I（hsFcγRI）等（各方法優(yōu)缺點(diǎn)及適用條件見表1）。在方法開發(fā)過程中應(yīng)仔細(xì)考慮并權(quán)衡每種策略的優(yōu)缺點(diǎn)及可能存在的風(fēng)險(xiǎn)，選擇易操作、效果顯著、風(fēng)險(xiǎn)較小的策略；若單一策略無法滿足需求，可嘗試將2種或多種策略結(jié)合以達(dá)到目的。

2.1 加入抗可溶性靶點(diǎn)分子抗體

在篩選實(shí)驗(yàn)或確證實(shí)驗(yàn)中加入抗可溶性靶點(diǎn)分子的特異性抗體（商品化產(chǎn)品或自行制備）可降低游離靶分子的干擾。一般情況下，在觀察到有可溶性靶點(diǎn)干擾后可首先嘗試制備多個特異性抗體，通過實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)［21］以篩選出可減輕干擾、不影響ADA檢測的抗體。該方法簡單易操作，通量較高；若在方法學(xué)驗(yàn)證期間即采用該方法，可明顯降低空白個體的背景值差異，有利于臨界值的確定。去除血管生成素、血管內(nèi)皮生長因子和細(xì)胞因子等干擾均可采用該方法。

為降低曲巴尼布（trebananib，AMG-386）ADA檢測中血管生成素造成的干擾，Zhong等［8］在檢測試劑中分別加入3種針對人血管生成素的高親和力單克隆抗體MAb1，MAb2和MAb3。結(jié)果顯示，MAb3可有效抑制血管生成素的干擾。

同樣，克服膜蛋白CD20對奧法木單抗（全人源抗CD20單克隆抗體）ADA檢測的干擾時，Chen等［16］在確證試驗(yàn)中采用了其100 mg·L-1與相同濃度的利妥昔單抗（另一抗CD20人鼠嵌合單克隆抗體）的混合溶液與樣品共同孵育，可排除假陽性結(jié)果。奧法木單抗和利妥昔單抗雖與CD20結(jié)合位點(diǎn)不同，但二者的結(jié)合位點(diǎn)在空間上位置接近。由于暴露于細(xì)胞微泡表面的CD20空間體積較小，利妥昔單抗與CD20結(jié)合后產(chǎn)生的空間位阻，可阻礙奧法木單抗與CD20結(jié)合，進(jìn)而抑制CD20對奧法木單抗ADA檢測的干擾。此外，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，加入利妥昔單抗不會影響正常ADA的檢測。Mikulskis等［21］亦采用加入抗游離血管內(nèi)皮生長因子抗體，去除雷珠單抗ADA檢測中游離血管內(nèi)皮生長因子的干擾；加入IL-5的特異性結(jié)合抗體50 mg·L-1，可有效降低IL-5造成的ADA檢測時的假陽性信號，去除IL-5的干擾［14］。

若采用上述方法，抗可溶性靶點(diǎn)分子抗體設(shè)計(jì)需注意其結(jié)構(gòu)序列應(yīng)與藥物骨架不同、或與藥物不存在或較少存在同源性序列，否則會造成ADA與抗可溶性靶點(diǎn)分子抗體的交叉反應(yīng)。在模擬真實(shí)樣品情況確定檢測方法后，一定要用該法檢測真正樣品（臨床前或臨床），以評估該法是否會影響ADA檢測［24］。

2.2 加入可溶性靶點(diǎn)受體

考慮藥物的作用機(jī)制，若藥物通過與靶點(diǎn)結(jié)合而抑制靶點(diǎn)與其受體結(jié)合，可采用向基質(zhì)中加入過量的可溶性受體以排除干擾。通常，靶點(diǎn)與其受體親和力較高，因此加入受體可有效抑制可溶性靶點(diǎn)干擾。

有研究表明，ADA檢測實(shí)驗(yàn)中陽性信號值隨加入受體濃度的升高而降低，但不能完全抑制可溶性靶點(diǎn)的影響；而引入弱酸性環(huán)境后，低濃度的受體即可完全抑制可溶性靶點(diǎn)的影響［24］。去除抗IgE抗體ADA檢測中IgE的干擾可考慮加入IgE的受體。

但該法可能出現(xiàn)的問題是，即使加入極其過量的可溶性受體也無法減輕干擾。造成以上情況的原因可能有以下幾點(diǎn)：①受體的制備技術(shù)限制，體外無法生產(chǎn)出和天然受體完全相同的重組受體，導(dǎo)致無法和可溶性靶點(diǎn)有效結(jié)合。如天然受體在細(xì)胞表面表達(dá)，體外生產(chǎn)的重組可溶性胞外區(qū)結(jié)構(gòu)可能與其天然結(jié)構(gòu)不同；②藥物與靶標(biāo)的親和力極高，靶標(biāo)很難與可能低親和力的可溶性受體結(jié)合［21］。除此之外，還應(yīng)結(jié)合受體生產(chǎn)量是否可滿足樣品檢測的需求、受體生產(chǎn)的成本進(jìn)行考慮采用該法的必要性。

表1 排除可溶性靶點(diǎn)干擾各方法優(yōu)缺點(diǎn)及適用條件

2.3 分離ADA

若不能獲得滿足要求的針對可溶性靶點(diǎn)分子的抗體或受體，可嘗試將樣品中的ADA預(yù)先從基質(zhì)中分離純化出來，再用于檢測。該法無需大量的、針對可溶性靶點(diǎn)分子的高親和力抗體或受體，可應(yīng)用于大部分試驗(yàn)。但預(yù)處理過程可能導(dǎo)致ADA部分丟失；由于增加了樣品預(yù)處理步驟，操作過程較為復(fù)雜，試驗(yàn)通量較小。此外，該法可能需特殊的儀器及耗材。

酸化-磁珠提?。╞ead extraction and acid dissociation，BEAD）法可較好分離ADA［25］。其主要通過樣品進(jìn)行酸化處理釋放所有ADA后加入大量含生物素標(biāo)記的藥物捕獲ADA達(dá)到目的。

BEAD法不僅可有效降低可溶性靶點(diǎn)分子及基質(zhì)中其他物質(zhì)的干擾，也可提高方法的靈敏度和藥物耐受程度。但由于多次引入酸化步驟，可能導(dǎo)致ADA降解、結(jié)構(gòu)改變或ADA分離不完全，使ADA檢測信號值低于真實(shí)值。因此，在方法學(xué)開發(fā)階段需確認(rèn)該法對于ADA檢測無影響后，再用于樣本檢測。類似地，根據(jù)藥物及靶點(diǎn)特征，選擇熱解離處理樣品，然后采用磁珠分離ADA即熱解離-磁珠純化（bead-extraction and heat-dissociation，BEHD）法，也可排除可溶性靶點(diǎn)分子的干擾［26］。

先經(jīng)過親和捕獲ADA，然后采用橋連接法進(jìn)行分析［27］，即將樣品與加入生物素標(biāo)記的藥物在包被鏈霉親和素板上過夜孵育，隨后經(jīng)酸化處理將捕獲的ADA解離后進(jìn)行橋連試驗(yàn)檢測也可有效減弱可溶性靶點(diǎn)分子的干擾。

另外，Zoghbi等［23］亦開發(fā)了一種可克服可溶性靶點(diǎn)分子干擾的方法，即預(yù)沉淀-酸化法。首先，向樣本中加過量藥物，使基質(zhì)中全部游離的ADA與藥物形成復(fù)合物；其次，加入聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）沉淀ADA-藥物復(fù)合物將ADA全部分離出來；然后，酸化處理釋放ADA，在高親和力板中孵育檢測。采用該法可有效去除游離腫瘤壞死因子α的干擾［11］。但需注意的是，PEG濃度越高，分子質(zhì)量越小的物質(zhì)越易沉淀。因此，摸索加入的PEG濃度非常重要。此外，不同批號的PEG沉淀效果可能不同，試驗(yàn)中需注意試劑批次引起的檢測誤差。最后，在臨床樣本檢測中需考慮相同批號PEG存量的問題。

2.4 去除可溶性靶點(diǎn)分子

除了從樣品中分離ADA，還可通過固相提取去除可溶性靶點(diǎn)分子以消除干擾。其基本原理是將樣本與包被了特異性結(jié)合可溶性靶點(diǎn)的單抗或配體的磁珠或板共孵育后，離心去除磁珠或從板吸出溶液即可去除可溶性靶點(diǎn)。Dai等［9］采用該法有效去除了呋拉奴單抗（fulranumab）ADA檢測時神經(jīng)生長因子的干擾。但此法通用性廣而通量較低，ADA可能會部分丟失。

2.5 加入凝集素（抑制糖基化可溶性靶點(diǎn)干擾）

凝集素可特異性地結(jié)合糖基化復(fù)合物的糖基，因此加凝集素后能抑制糖基化可溶性靶點(diǎn)造成的ADA 檢測干擾。Carrasco-Triguero 等［15］向已加CA125的混合血清中分別加入麥胚凝集素、植物血凝素E及植物血凝素M。結(jié)果顯示，麥胚凝集素500 mg·L-1可明顯降低游離CA125導(dǎo)致的高信號值，顯著改善內(nèi)源性CA125的干擾。需注意的是，由于凝集素可與人免疫球蛋白的糖基結(jié)合，需評估加入凝集素是否會同時干擾真實(shí)的ADA檢測。此外，他們采用表面等離子體共振技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)麥胚凝集素不會與人IgG及3A5 TDC抗體部分結(jié)合［15］。因此，可考慮選擇麥胚凝集素去除游離CA125的干擾。

2.6 采用Pro329Gly修飾hsFc γRI檢測

若抗體藥物的Fc結(jié)構(gòu)域含Pro329Gly修飾，可利用該修飾位點(diǎn)設(shè)計(jì)ADA檢測方法，避免基質(zhì)中可溶性靶點(diǎn)分子和過量藥物的干擾。試驗(yàn)原理簡述如下：首先加過量藥物，使基質(zhì)中全部游離的ADA與藥物形成復(fù)合物；隨后采用生物素標(biāo)記的抗Pro329Gly的抗體捕獲ADA-藥物復(fù)合物；加地高辛標(biāo)記的hsFcγRI進(jìn)行檢測［28-29］。與常規(guī)橋連試驗(yàn)相比，該法可特異性地檢測ADA，有效避免可溶性靶點(diǎn)分子的干擾；對于天然抗體的檢測靈敏度較好，有利于評估給藥后的ADA產(chǎn)生。但該法需對抗體Fc進(jìn)行Pro329Gly修飾，僅能檢測IgG1抗體，不能檢測其余ADA亞型，因此適用范圍極小。

2.7 兩種策略結(jié)合法

以上介紹方法均為單一策略。若單一策略效果并不理想，可同時引入2種策略。一般不建議同時引入超過2種方法來排除干擾，防止過多處理步驟造成ADA損失形成假陰性結(jié)果及引入過多人為因素而影響結(jié)果。

Chen等［22］發(fā)現(xiàn)，在加入抗可溶性靶點(diǎn)抗體HuAb2和HuSR蛋白（靶點(diǎn)受體胞外區(qū)與人IgG Fc融合蛋白）后，可抑制藥物REGN-X靶點(diǎn)的干擾。但HuAb2具有與REGN-X相同的人IgG4恒定區(qū)，HuSR具有人IgG Fc。因此，患者血清中任何針對REGN-X的IgG4恒定區(qū)或Fc的ADA均可能與HuAb2或HuSR結(jié)合，也會干擾針對REGN-X CDR區(qū)ADA的檢測。因此，將HuSR的人Fc和HuAb2的人IgG4恒定區(qū)變?yōu)樾∈笙鄳?yīng)序列，進(jìn)一步有效降低了臨床樣本中靶點(diǎn)干擾。同時在加入2種靶點(diǎn)阻斷劑后，當(dāng)檢測體系為pH8.3的條件下，可更好地促進(jìn)靶點(diǎn)與阻斷劑結(jié)合，完全抑制REGN-X靶點(diǎn)干擾。

3 結(jié)語

綜上，可溶性靶點(diǎn)分子的存在會影響藥物ADA的檢測及結(jié)果判斷，進(jìn)一步影響對藥物藥動學(xué)、有效性及安全性的評估?？扇苄园悬c(diǎn)分子對生物制品ADA檢測的干擾受多種因素影響，包括藥物及靶點(diǎn)的物理化學(xué)特點(diǎn)、藥物與靶點(diǎn)的相互作用、藥物的作用機(jī)制、選擇的實(shí)驗(yàn)方法等。在不同的病理狀態(tài)及給藥情況下，機(jī)體內(nèi)可溶性靶點(diǎn)分子的水平經(jīng)常會發(fā)生變化。因此，鑒定和評估可溶性靶點(diǎn)對ADA檢測的影響，并開發(fā)可減輕可溶性靶點(diǎn)分子干擾的分析方法非常重要，也頗具挑戰(zhàn)?；陲L(fēng)險(xiǎn)評估，在ADA方法開發(fā)初期，應(yīng)根據(jù)藥物的作用機(jī)制、靶點(diǎn)的生物學(xué)特點(diǎn)、給藥后的生理代償?shù)忍崆霸u估相關(guān)可溶性靶點(diǎn)對檢測的可能干擾。若可溶性靶點(diǎn)干擾大，應(yīng)充分參考靶點(diǎn)及藥物作用特性，嘗試多種方法，以選擇最方便經(jīng)濟(jì)可靠的方法去除可溶性靶點(diǎn)干擾，同時不影響真實(shí)ADA檢測。在選擇特定方法后，應(yīng)用真實(shí)樣本檢測以進(jìn)行進(jìn)一步佐證。需注意的是，即使是相同靶點(diǎn)的藥物，可溶性靶點(diǎn)分子對其ADA檢測的影響可能是不同的。因此，一種藥物的去除方法應(yīng)經(jīng)完全評估后才能應(yīng)用于另一藥物的ADA檢測?？傊?，可溶性靶點(diǎn)分子對生物制品ADA檢測面臨較多挑戰(zhàn)，應(yīng)根據(jù)藥物及可溶性靶點(diǎn)特性制定相應(yīng)的應(yīng)對策略。