王 靜，程肖蕊，周文霞，張永祥，王淑美

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

快速老化模型小鼠（senescence-accelerated mouse，SAM）由日本京都大學(xué)竹田教授經(jīng)過篩選培育而成，包括快速老化亞系（SAM-prone，SAMP）和抗快速老化亞系（SAM-resistant，SAMR）。SAMP系具有品系特異的病理表型，SAMR系則具有相對正常的生命期，常作為SAMP系的對照。其中SAMP8亞系的特征是中樞學(xué)習(xí)記憶功能隨增齡進行性快速衰退，與SAMR1亞系相比，SAMP8亞系病理特征明顯且穩(wěn)定，對藥物治療具有良好的反應(yīng)。因此，目前SAMP8亞系被認(rèn)為是研究阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）等老化相關(guān)疾病發(fā)生機制及其防治藥物的較為理想的動物模型［1］。

神經(jīng)系統(tǒng)紊亂與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)［2-3］。已有研究表明，SAMP8腦中的神經(jīng)信號傳遞異常。與同月齡SAMR1相比，12月齡SAMP8海馬中M1受體與其阻斷劑哌侖西平（pirenzepine）、N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體與其拮抗劑MK-801、苯二氮類受體與其激動劑氟硝西泮（flunitrazepam）、5-羥色胺1A（5-hydroxytryptamine 1A，5-HT1A）受體與其激動劑8-羥基-2-（雙-n-丙胺基）-四氫萘、蛋白激酶C與其激活劑佛波醇-12，13-二丁酸酯的結(jié)合能力下降；而在皮質(zhì)中，M1受體與其阻斷劑哌侖西平、苯二氮類受體與其激動劑氟硝西泮、5-HT1A受體與其激動劑8-羥基-2-（雙-n-丙胺基）-四氫萘結(jié)合能力增加。在SAMP8海馬神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)和胞膜中，蛋白激酶C與其激活劑佛波醇-12，13-二丁酸酯的結(jié)合能力降低［4］。上述結(jié)果提示，SAMP8腦中谷氨酸能和5-HT能神經(jīng)傳遞發(fā)生異常。對于涉及去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）能、多巴胺（dopamine，DA）能和5-HT能單胺類神經(jīng)遞質(zhì)，本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，SAMP8大腦皮質(zhì)、海馬和下丘腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平多明顯高于同齡SAMR1，且隨增齡明顯增高，提示SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力的衰退可能與其相關(guān)腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化密切相關(guān)［5］。然而對于SAMP8腦中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的晝夜節(jié)律及其增齡性變化尚缺乏系統(tǒng)的研究。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用［6］。為使SAMP8更好地應(yīng)用于老化相關(guān)疾病如AD的發(fā)生機制以及防治藥物研究，本研究采用微透析方法獲得主管學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位海馬的組織間液，利用高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）-電化學(xué)方法測定組織間液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物水平，包括NE、DA及其代謝產(chǎn)物高香草酸（homovanillic acid，HVA）和3，4-二羥基苯乙酸（3，4-dihydroxy phenylacetic acid，DOPAC）、5-HT及其代謝產(chǎn)物5-羥吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA），觀察其晝夜節(jié)律及增齡性變化，這對于揭示AD等老化相關(guān)疾病發(fā)生機制及相關(guān)藥物藥理學(xué)研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和儀器

SAMP8和SAMR1由日本京都大學(xué)引進，雄性，體質(zhì)量29.1～50.9 g，共70只，本研究室繁殖飼養(yǎng)。其中，3月齡SAMR1 6只，6，9，12和15月齡均5只，18月齡7只；3和18月齡SAMP8均5只，6月齡8只，9月齡7只，12和15月齡均6只。

NE，DA，DOPAC，HVA，5-HT和5-HIAA標(biāo)準(zhǔn)品及辛烷磺酸鈉均購自美國Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、無水亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉和NaCl均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純）購自中國賽默飛世爾科技有限公司；實驗用水為Mili-Q超純水（美國Millipore公司Mili-Q純水機制造）；人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，aCSF）購自石家莊四藥有限公司；3，4-二羥基芐胺（3，4-dihydroxybenzylamine，DHBA）購自美國Sigma公司。Waters e2695液相色譜工作站及電化學(xué)檢測器和SunFireTM C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm，美國Waters公司）；自發(fā)活動箱（400 mm×400 mm×600 mm，上海吉量，JLBehv-LAG-9）；超低溫冰箱（-80℃，海爾公司）；CMA120清醒動物裝置、微注射泵和BAS（2 mm）微透析探針均購自美國BAS公司。

1.2 海馬組織間液樣品采集

小鼠ip給予戊巴比妥鈉70 mg·kg-1，麻醉后開始底座植入手術(shù)。將小鼠俯臥固定于立體定位儀上，調(diào)整齒夾和耳夾使顱骨面水平。剪開顱骨上皮膚和皮下組織，用3%H2O2浸濕的棉簽燒灼止血并充分暴露顱骨表面，調(diào)節(jié)門齒桿使前后囟在同一水平面。以橫縱坐標(biāo)定位前囟，并確定所定位海馬的坐標(biāo)：前囟后2.7 mm，前囟側(cè)3.0 mm，顱骨面下1.5 mm。按上述坐標(biāo)，垂直插入引導(dǎo)管，并以牙科水泥使之固定于顱骨面；手術(shù)完畢后單籠飼養(yǎng)，72 h后透析。

透析前1 d，新的微透析探針（透析膜長度2 mm）浸泡于純水中過夜。將小鼠置自發(fā)活動箱中。用乙醚輕微麻醉，小心取出引導(dǎo)管內(nèi)鋼芯，將探針置入，探針事先通過MF-5366型連接管〔0.025 OD（外徑）×0.005 ID（內(nèi)徑）〕與微量注射泵和收集器的收集針相連，將微量注射泵的流速調(diào)到2 μL·min-1灌流腦脊液代替物（artificial cerebrospinal fluid，aCSF），調(diào)節(jié)收集器的溫度為4℃。從12∶00開始采樣，每隔4 h采集1個樣品，收集24 h，采樣時間點分別為12∶00，16∶00，20∶00，24∶00及次日4∶00和8∶00，每個樣品35 μL，每收集完1個樣品立即加入6 μL高氯酸溶液1.1 mol·L-1并混勻，以防止遞質(zhì)被降解，然后保存于-80℃冰箱。

1.3 海馬組織間液神經(jīng)遞質(zhì)水平的測定

1.3.1 液相色譜條件

電化學(xué)檢測器使用玻璃碳工作電極，固態(tài)Ag/AgCl作為參比電極。檢測電壓為+0.70 V。流動相由檸檬酸85 mmol·L-1，無水乙酸鈉100 mmol·L-1，Na2EDTA 0.2 mmol·L-1，辛烷磺酸鈉 0.9 mmol·L-1，NaCl 2 mmol·L-1，15% 甲醇組成，pH值3.70。柱溫8℃，柱壓+0.70 V，流速1.0 mL·min-1，進樣35 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

用HPLC-電化學(xué)法檢測遞質(zhì)的含量，每次進樣35 μL，以峰面積外標(biāo)法進行定量。首先分別稱取DA 3.79 mg，5-HT 4.25 mg，NE 3.38 mg，DOPAC 3.36 mg，HVA 3.62 mg，5-HIAA 3.82 mg，分別超聲溶解于2 mL aCSF中配制成10 mmol·L-1的貯存液。隨后，從每種遞質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品貯存液中各取100 μL合并，再加 aCSF 400 μL 稀釋至1 mmol·L-1；然后用 aCSF 依次稀釋 50 倍至 20 μmol·L-1，再稀釋20倍至1 μmol·L-1，最后再用aCSF依次2倍倍比稀釋至500，250，125，62.5，31.25，15.6，7.8，3.9和1.9 nmol·L-1。取各倍比稀釋液35 μL，分別加內(nèi)標(biāo)DHBA 4 μL和1.1 mmol·L-1高氯酸 6 μL，混勻后取35 μL進樣。以單胺類神經(jīng)遞質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)DHBA峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，制作NE、DA及其代謝產(chǎn)物HVA和DOPAC、5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及代謝產(chǎn)物水平測定

各時間點濃度的測定：取各時間點采集的樣品35 μL，加1.1 mmol·L-1高氯酸6 μL混勻。測定時向混合液中加內(nèi)標(biāo)DHBA 4 μL，混勻后取35 μL進樣。遞質(zhì)的濃度用遞質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值從上述相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品曲線計算獲得。

12∶00至次日8∶00遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物時間-濃度曲線下面積（area under curve，AUC）計算：計算海馬組織間液中NE、DA及其代謝產(chǎn)物HVA和DOPAC、5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA 12∶00至次日8∶00時間-濃度AUC，表示海馬組織間液遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物晝夜總含量，分析SAMR1和SAMP8海馬組織間液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)增齡性變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用HPLC-電化學(xué)法檢測NE，DA，HVA，DOPAC，5-HT和5-HIAA標(biāo)準(zhǔn)品1.9，3.9，7.8，15.6，31.25，62.5，125，250和500 nmol·L-1溶液峰面積，以峰面積與內(nèi)標(biāo)DHBA峰面積的比值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，制作其標(biāo)準(zhǔn)曲線。NE：y=0.005694x+0.01428（R2=0.9965，P＜0.01）；DA：y=0.008431x+0.001449（R2=0.9959，P＜0.01）；DOPAC：y=0.005029x+0.003377（R2=0.9989，P＜0.01）；HVA：y=0.008840x+0.001874（R2=0.9956，P＜0.01）；5-HT：y=0.003838x+0.03145（R2=0.9988，P＜0.01）；5-HIAA：y=0.001490x+0.01020（R2=0.9994，P＜0.01）。

2.2 SAMR1和SAMP8海馬組織間液中NE水平的變化

2.2.1 晝夜節(jié)律變化

結(jié)果表明（圖1），12∶00至次日8∶00，SAMP8海馬組織間液中NE濃度的變化，除3月齡與SAMR1一致外，6～18月齡與SAMR1均不一致，其中6和18月齡晝夜節(jié)律變化差異更為明顯。6月齡：16∶00 SAMP8 NE濃度明顯低于SAMR1（P＜0.01），隨后逐漸升高，至次日 4∶00～8∶00 SAMP8 明顯高于SAMR1（P＜0.01）。18月齡：12∶00～16∶00 SAMP8 NE濃度高于SAMR1（P＜0.05），20∶00低于SAMR1（P＜0.01），隨后逐漸升高，至次日4∶00又升高于SAMR1（P＜0.01）。

Fig.1 Changes in norepinephrine（NE）concentration in hippocampal interstitial fluid of male senescenceaccelerated prone 8 mice（SAMP8）and SAM resistance 1（SAMR1）detected by HPLC-ECD.A-F：3，6，9，12，15 and 18 months of old，respectively.±s，n=5-7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with SAMR1 of the same time.

2.2.2 增齡變化

結(jié)果表明（圖2），12∶00至次日8∶00，3～18月齡SAMP8海馬組織間液中NE總含量變化趨勢與SAMR1一致，均為3和6月齡較高，隨后隨增齡降低。SAMP8與SAMR1的差異為15月齡SAMP8低于SAMR1（P＜0.05），18月齡SAMP8高于SAMR1（P＜0.05）。

Fig.2 Changes in NE total content in hippocampal interstitial fluid of male SAMP8 and SAMR1 with aging detected by HPLC-ECD.AUC：area under curve.±s，n=5-7.＊P＜0.05，compared with SAMR1 of the same age.

2.3 SAMP8和SAMR1海馬組織間液中DA及其代謝產(chǎn)物水平的變化

2.3.1 晝夜節(jié)律變化

結(jié)果表明（圖3），DA晝夜節(jié)律：12∶00至次日8∶00，3～12月齡SAMP8 DA晝夜節(jié)律變化與同月齡SAMR1均不一致，幾乎相反。DOPAC晝夜節(jié)律：除15和18月齡其濃度低于檢測限，3～12月齡SAMP8 DOPAC濃度與同月齡SAMR1晝夜節(jié)律變化亦不一致；特別是3和9月齡，SAMP8與SAMR1幾乎相反。HVA晝夜節(jié)律：3，6，9和18月齡SAMP8 HVA濃度變化與同月齡SAMR1均不一致，12和15月齡晝夜節(jié)律變化相似。

2.3.2 增齡變化

結(jié)果表明（圖4），3～12月齡SAMP8 DA總含量隨增齡變化趨勢與SAMR1相似，差別是SAMP8 3月齡高于SAMR1（P＜0.05），6月齡低于SAMR1（P＜0.05）。SAMP8 DOPAC總含量的增齡變化趨勢與SAMR1一致，差別是12月齡SAMP8低于SAMR1（P＜0.05）。SAMP8 HVA總含量的增齡變化趨勢除3月齡外基本一致，差別是3和12月齡高于SAMR1（P＜0.01），18月齡低于SAMR1（P＜0.05）。

Fig.3 Changes in concentrations of dopamine(DA),3,4-dihydroxy phenylacetic acid(DOPAC)and homovanillic acid(HVA)in hippocampal interstitial fluid of male SAMP8 and SAMR1 detected by HPLC-ECD.A-D:DA of 3,6,9 and 12 months old,respectively;E-H:DOPAC of 3,6,9 and 12 months old,respectively;I-N:HVA of 3,6,9,12,15 and 18 months old,respectively.±s,n=5-7.＊P＜0.05,＊＊P＜0.01,compared with SAMR1 of the same time.

Fig.4 Changes in total contents of DA（A），DOPAC（B）and HVA（C）in hippocampal interstitial fluid of male SAMP8 and SAMR1 with aging detected by HPLC-ECD.±s，n=5-7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with SAMR1 of the same age.

2.4 SAMP8和SAMR1海馬組織間液中5-HT及其代謝產(chǎn)物水平

2.4.1 晝夜節(jié)律變化

結(jié)果表明（圖5），5-HT晝夜節(jié)律：12∶00至次日8∶00，SAMP8 5-HT晝夜變化除12月齡與SAMR1一致外，其余月齡均不一致，特別是9，15和18月齡與SAMR1幾乎相反；5-HIAA晝夜節(jié)律：3～15月齡SAMP8 5-HIAA濃度變化與同月齡SAMR1均不一致，特別是3，6和9月齡幾乎相反。

2.4.2 增齡變化

結(jié)果表明（圖6），3～18月齡SAMP8 5-HT總含量增齡變化趨勢，除18月齡外（P＜0.05），與SAMR1基本一致；3～15月齡SAMP8 5-HIAA總含量增齡變化趨勢，除6月齡外，與SAMR1基本一致，差別是6，9，12和15月齡SAMP8高于SAMR1（P＜0.05）。

Fig.5 Changes in concentrations of serotonin（5-HT）and 5-hydroxyindoleacetic acid（5-HIAA）in hippocampal interstitial fluid of male SAMP8 and SAMR1 detected by HPLC-ECD.A-F：5-HT of 3，6，9，12，15 and 18 months old，respectively；G-K：5-HIAA of 3，6，9，12 and 15 months old，respectively.±s，n=5-7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with SAMR1 of the same time.

Fig.6 Changes in total contents of 5-HT（A）and 5-HIAA（B）in hippocampal interstitial fluid of male SAMP8 and SAMR1 with aging detected by HPLC-ECD.±s，n=5-7.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with SAMR1 of the same age.

3 討論

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)中NE與焦慮抑郁相關(guān)，5-HT與情緒相關(guān)，DA能神經(jīng)系統(tǒng)則在快感與行為動機方面起著極其重要的作用［7］，因此一直受到科學(xué)研究的關(guān)注。在人體以及嚙齒類動物的大腦內(nèi)5-HT，DA和NE含量的研究很多，同時也出現(xiàn)了不少難以解釋的矛盾性結(jié)果。如在人體，5-HT和NE含量在皮質(zhì)、海馬、基底神經(jīng)節(jié)和腦干部位隨增齡保持穩(wěn)定［8-11］。也有報道稱，因從尸檢大腦得到的單胺檢測結(jié)果易受死亡時間、解剖時間間隔等影響［12-13］。在腦區(qū)5-HT能神經(jīng)元5-HT水平隨增齡變化報道不一，有的報道不變［3，14-15］，有的報道下降［16-17］，也有報道增加［18-19］。在嚙齒類動物，Godefroy等［20］以3，10和27月齡SD大鼠為研究對象，檢測皮質(zhì)和紋狀體部位DA及其代謝產(chǎn)物增齡性變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，軀體運動皮質(zhì)部位DA水平隨增齡性增加，顳葉皮質(zhì)部位則降低。前邊緣皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)和顳葉皮質(zhì)部位HVA水平隨增齡性降低，3-甲氧酪胺（3-methoxytyramine，3-MT）在前邊緣皮質(zhì)、梨狀皮質(zhì)、扣帶回區(qū)域和顳葉皮質(zhì)部位增加。紋狀體部位DA和HVA水平降低，但3-MT水平不變。3和27月齡大鼠皮質(zhì)區(qū)域NE增加。DA代謝產(chǎn)物HVA和3-MT水平的變化表明，DA的釋放在某些皮質(zhì)區(qū)域隨增齡增加。由此提示，單胺及其代謝產(chǎn)物在大鼠皮質(zhì)區(qū)域并未完全呈年齡依賴性降低變化，但卻是一個復(fù)雜的、區(qū)域特定性的變化。本研究結(jié)果表明，SAMP8海馬組織間液中NE、DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC和HVA、5-HT及其代謝產(chǎn)物5-HIAA水平的晝夜節(jié)律發(fā)生紊亂，增齡性變化與SAMR1基本相似，與上述研究結(jié)果不完全一致，可能原因是研究部位不同［20］。如有研究報道，年老大鼠和年輕大鼠相比，前額皮質(zhì)和隔膜部位3，4-二羥苯基乙二醇（3，4-dihydroxyphenylglycol，MHPG）和MHPG/NE比例降低；隔膜部位DA和DOPAC水平增加，但DOPAC/DA比例降低。紋狀體部位MHPG/NE比例增加，DOPAC水平增加，海馬和丘腦部位5-HIAA水平增加，表明在衰老早期大腦單胺神經(jīng)系統(tǒng)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)隨部位選擇性改變［21］。

已有多項研究結(jié)果表明，AD患者5-HT能、DA能和NE能系統(tǒng)發(fā)生異常改變，并導(dǎo)致記憶力減退、抑郁和注意力不集中［22-24］。β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）/早老素1（presenilin 1，PS1）轉(zhuǎn)基因小鼠是家族型AD的動物模型，Von Linstow等［25］以6，12，18和24月齡B6C3 WT小鼠及14和18月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對象，通過HPLC方法檢測新皮質(zhì)區(qū)域、海馬、紋狀體、腦干和小腦部位5-HT，DA和NE含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WT小鼠隨增齡單胺水平無變化，但18月齡轉(zhuǎn)基因小鼠與WT小鼠相比，單胺水平呈區(qū)域特定性的改變，新皮質(zhì)區(qū)域5-HT，DA和NE分別下降了30%，47%和32%；腦干部位5-HT增加了18%。新皮質(zhì)區(qū)域，14月齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠與其WT小鼠相比，無顯著性差異。同時發(fā)現(xiàn)，5-HT，DA和NE增齡性變化無顯著性差異［25］。SAMP8是研究散發(fā)型AD發(fā)病機制的一個良好模型［1］，為揭示其中樞學(xué)習(xí)記憶功能障礙的機制，本研究團隊前期檢測了腦組織裂解液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平，發(fā)現(xiàn)SAMP8多明顯高于同齡SAMR1，且隨增齡明顯增高［5］。除此之外，目前尚未見對SAMP8腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平進行細(xì)致研究的報道。本研究系統(tǒng)研究了SAM小鼠海馬組織間液中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物水平的晝夜節(jié)律及增齡性變化，為該模型小鼠的進一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。