邢發(fā)萍，楊 柳，韓欣研，石海蓮，黃 菲，吳 輝，吳曉俊

（上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所暨上海市復(fù)方中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201203）

多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）自身免疫性脫髓鞘疾病，其發(fā)病可能與多種因素包括遺傳、環(huán)境和病毒感染等有關(guān)［1-3］。MS的病理特征主要表現(xiàn)為中樞炎癥、脫髓鞘、軸索喪失或損壞和膠質(zhì)細(xì)胞增生等，但其發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，普遍認(rèn)為是在易感基因的基礎(chǔ)上，受到環(huán)境因素的觸發(fā)，并由CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的CNS自身免疫性疾?。?］。近年來(lái)，MS治療藥物以西藥為主，有糖皮質(zhì)激素、β干擾素、芬戈莫德、克拉屈濱、富馬酸二甲酯等［5］。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是目前常用于MS研究的一種經(jīng)典動(dòng)物模型［6］，通過(guò)免疫CNS特異性分子〔髓鞘內(nèi)的少突膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)蛋白或多肽，如髓鞘少突膠質(zhì)糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）、蛋白脂質(zhì)蛋白（proteolipid protein，PLP）等〕誘導(dǎo)EAE，在百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）免疫和致敏后，引起適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致T細(xì)胞和B細(xì)胞活化，遷移到CNS，產(chǎn)生神經(jīng)毒性細(xì)胞因子，隨后激活駐留的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞）誘發(fā)CNS慢性炎癥反應(yīng)，并伴有脫髓鞘，軸突損傷。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根［7］，具有益氣扶正、養(yǎng)陰生津、補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表、托毒生肌等作用，中醫(yī)常用于治療脾肺氣虛證、氣虛自汗證、氣血兩虛證、氣血虧虛之瘡瘍難潰難腐或潰久難斂、痹癥、卒中半身不遂、胸痹等。黃芪主要的化學(xué)成分包括多糖、皂苷和黃酮等，具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗感染、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降血糖和雙向調(diào)節(jié)血壓及多種臟器保護(hù)等作用［8］。中醫(yī)將MS歸于痹證、痿證的范疇，治療應(yīng)以補(bǔ)氣為主［9］。目前，臨床中已有應(yīng)用黃芪注射液聯(lián)合甲潑尼龍治療MS，效果顯著。亦有黃芪提取物（Radix Astragalis extract，RAE）治療EAE的相關(guān)研究，闡述了RAE對(duì)于MOG誘導(dǎo)的EAE小鼠T細(xì)胞增殖及炎癥因子的釋放具有一定的抑制作用［10］，但是否存在其他作用尚不清楚。本研究旨在EAE小鼠模型中，進(jìn)一步從抗炎、抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡角度，探討RAE對(duì)EAE的治療作用機(jī)制，以期為RAE臨床應(yīng)用于MS治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材、試劑和儀器

黃芪飲片購(gòu)自上?？禈蝻嬈荆ㄅ?hào)：180625）。RAE制備方法如下：取黃芪飲片1 kg，加5 L蒸餾水煮沸后，調(diào)至60～80℃，煎煮30 min，雙層紗布過(guò)濾；剩余藥渣加2 L蒸餾水再次煎煮30 min，雙層紗布過(guò)濾；合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，60℃水浴蒸干得到浸膏，于-70℃低溫冷凍干燥成凍干粉，經(jīng)計(jì)算RAE得率R=30.94%〔R=凍干粉（g）/生藥（g）〕；利用紫外分光光度法以葡萄糖、蘆丁、黃芪皂苷Ⅳ為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定RAE中總多糖、總黃酮、總皂苷含量分別為78.02%，9.14%和0.853%。干燥粉末密封于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

小鼠髓鞘少突膠質(zhì)糖蛋白35-55（myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG35-55，上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，批號(hào)：9001）；弗氏完全佐劑（美國(guó)Sigma公司）；百日咳毒素（德國(guó)Merk公司）；滅活H37RA結(jié)核分枝桿菌（tuberculosis mycobacterium，TB，美國(guó)BD生物公司）；兔抗小鼠NF-κB、磷酸化NF-κB（phospho-NF-κB，p-NF-κB）、磷酸化NF-κB抑制蛋白α（phospho-IκBα，p-IκBα）、磷酸化蛋白激酶B（phospho-Akt，p-Akt）、磷脂酰肌醇三激酶（phosphatidy linositol-3-kinase，PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇三激酶（phospho-PI3K，p-PI3K）、Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶3和GAPDH單克隆抗體（一抗）以及小鼠抗小鼠NF-κB抑制蛋白 α（NF-κB inhibitor alpha，IκBα）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）單克隆抗體（一抗）和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（二抗）（均美國(guó)CST公司）；兔抗小鼠鈣離子結(jié)合銜接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）單克隆抗體（一抗）（美國(guó)GeneTex公司）；FITC-抗小鼠CD4抗體（美國(guó)BD生物公司）；APC-抗小鼠CD11b抗體和FITC-抗小鼠CD11c抗體（美國(guó)eBioscience）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海翊圣生物科技公司）。

勻漿機(jī)（TL-48E，上海凈信科技公司），水平電泳儀（Power Pac200，美國(guó)Bio-Rad公司），酶標(biāo)儀（VARIOSKAN FLASH，美國(guó)Thermo公司），流式細(xì)胞儀（Guava easycyte HT，德國(guó)Millipore公司），全自動(dòng)紫外與可見(jiàn)分析裝置-凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 5200，上海天能科技有限公司），制冰機(jī)（SIMF140AY65，日本Sanyo公司），高速離心機(jī)（5415R，德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 動(dòng)物、動(dòng)物分組、EAE模型制備和神經(jīng)功能評(píng)分

健康雌性C57BL/6小鼠40只，5周齡，體質(zhì)量15～16 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬2018-09002）。于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)動(dòng)物房，每籠4只，晝夜各12 h，24～26℃，相對(duì)濕度40%～60%，自由飲水?dāng)z食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

將小鼠隨機(jī)分為5組（n=8）：正常對(duì)照組，模型組（EAE），模型+RAE 125，250和500 mg·kg-1組。RAE組于造模前2 d ig給予不同劑量RAE，每日1次，共給藥23 d。正常對(duì)照組和模型組ig給予等量蒸餾水。

EAE造模方法如下：每只小鼠sc注射含H37RA TB 400 μg和MOG35-55300 μg的100 μL弗氏完全佐劑（三者混勻，渦旋乳化至白色乳濁液狀，分3點(diǎn)背部sc注射）。造模當(dāng)日，每只小鼠ip給予PTX 300 ng，隔日給予相同劑量的PTX。每日同時(shí)間給藥1次并觀察小鼠發(fā)病情況，同時(shí)采用雙盲法記錄神經(jīng)功能評(píng)分及體質(zhì)量變化。神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下［11］：0分，無(wú)發(fā)病跡象；0.5分，尾尖點(diǎn)地；1分，尾部下垂或輕度步履蹣跚；1.5分，尾巴完全拖地，步態(tài)不穩(wěn)；2分，雙后肢無(wú)力，或一肢癱瘓，被動(dòng)翻身后可恢復(fù)；3分，雙后肢癱瘓，被動(dòng)翻身后不可恢復(fù)，但給予刺激后可挪動(dòng)；4分，雙后肢癱瘓，前肢癱瘓或肌力減弱伴尿便失禁；5分，死亡。

1.3 樣本收集和組織病理評(píng)分

造模第21天取各組小鼠5只ip給予1%戊巴比妥鈉麻醉，冰上取小鼠脊髓組織于滅菌EP管中，液氮速凍后-80℃冰箱保存。取脾組織于滅菌PBS中，分離脾細(xì)胞用于后續(xù)流式檢測(cè)CD4+、CD11b+、CD11c+細(xì)胞百分比。另取每組小鼠3只，4%多聚甲醛心臟灌流，取脊髓，于4%多聚甲醛中4℃固定2 d，蔗糖梯度脫水后分別進(jìn)行HE染色和勞克堅(jiān)勞藍(lán)（luxol fast blue，LFB）染色。光鏡下觀察組織病理變化并進(jìn)行評(píng)分［12］①HE評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)炎癥細(xì)胞；1分，少量炎癥細(xì)胞；2分，血管周圍組織浸潤(rùn)；3分，大量炎性浸潤(rùn)。②LFB評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)脫髓鞘；1分，罕見(jiàn)脫髓鞘；2分，少數(shù)脫髓鞘；3分，大面積脫髓鞘。

1.4 流式細(xì)胞法測(cè)定脾組織CD4+，CD11b+和CD11c+細(xì)胞百分比

分離脾細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞密度為2×1010L-1，而后將樣品平均分為3份，每管50 μL細(xì)胞懸液，進(jìn)行流式染色。方法如下：每個(gè)樣品加染色緩沖液（PBS+2%胎牛血清）1 mL，吹打混勻后離心（4℃，159×g，5 min）棄上清，按抗體說(shuō)明書(shū)推薦量，室溫下分別加FITC-抗小鼠CD4抗體、APC-抗小鼠CD11b抗體、FITC-抗小鼠CD11c抗體，4℃孵育30 min，后加染色緩沖液1 mL吹打混勻后離心（4℃，159×g，5 min）棄上清，重復(fù)2次后，加染色緩沖液650 μL重懸細(xì)胞，96孔板每個(gè)樣品設(shè)3復(fù)孔，每孔加200 μL細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.5 Western印跡法測(cè)定脊髓組織NF- κB信號(hào)通路、Pl3K/Akt信號(hào)通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

從-80℃冰箱取出脊髓樣品，每個(gè)樣品加300 μL蛋白裂解液，勻漿后離心（4℃，13 523×g，15 min），吸取上清液。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，取30 μg樣品上樣，10%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)至PDVF膜。5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加一抗（1∶1000）4℃孵育過(guò)夜；次日，PBST洗滌3次（每次10 min）后，加二抗（1∶5000）室溫孵育1 h，PBST洗滌3次（每次10 min）；最后，用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色。運(yùn)用TanonImage分析蛋白條帶積分吸光度，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度比值表示其相對(duì)表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芪提取物對(duì)EAE模型小鼠臨床評(píng)分及體質(zhì)量的影響

Fig.1 Effect of Radix Astragali extract（RAE）on clinical score and body mass of experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）model mice.EAE model was induced by sc injection of myelin oligodendrocyte glycoprotein（MOG35-55）emulsified in compelete Freund adjuvant with H37RA Mycobacterium Tuberculosis.Meanwhile，Pertussis toxin（PTX）was ip given immediately and again 48 h later.RAE was ig administered two days prior to immunization and continued for 23 d.Mice were monitored daily for clinical score and body mass.A：changes in clinical scores；B：changes in body mass；C：mean clinical scores from the 12th-21stday.D：mean body mass at the 1st，2ndand 3rdweeks.x± s，n=8. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

神經(jīng)功能評(píng)分及體質(zhì)量變化結(jié)果（圖1）顯示，與正常對(duì)照組相比，EAE模型組在造模第12天起開(kāi)始相繼發(fā)病，可見(jiàn)小鼠精神萎靡，飲食活動(dòng)減少，并逐漸出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷癥狀，表現(xiàn)為尾尖拖地或全尾癱瘓，步履蹣跚，單側(cè)或雙側(cè)后肢癱瘓，前肢癱瘓甚至全身癱瘓，在給藥第1，2和3周小鼠的平均體質(zhì)量與正常對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與EAE模型組相比，RAE各給藥組在給藥第12～21天平均臨床評(píng)分顯著低于EAE組平均臨床評(píng)分（P＜0.05，P＜0.01），給藥第1，2和3周模型+RAE 500 mg·kg-1組的平均體質(zhì)量顯著高于EAE模型組（P＜0.05，P＜0.01），給藥第3周模型+RAE 125 mg·kg-1組的平均體質(zhì)量顯著高于EAE模型組（P＜0.01），提示黃芪提取物可有效降低EAE小鼠的臨床評(píng)分，減少小鼠體質(zhì)量的降低。

2.2 黃芪提取物對(duì)EAE模型小鼠脊髓組織病理變化的影響

Fig.2 Effect of RAE on inflammatory infiltration and demyelination of spinal cord in EAE mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A：HE and Luxol fast blue（LFB）staining，the arrows show infiltration of inflammatory cells and the areas of demyelination in the parenchymal tissues of spinal cords；B：pathological score based on the HE and LFB staining.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

HE染色和LFB染色及病理評(píng)分結(jié)果（圖2）顯示，與正常對(duì)照組相比，EAE模型組脊髓組織白質(zhì)區(qū)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及大面積的髓鞘脫失，與此相對(duì)應(yīng)，其病理學(xué)評(píng)分顯著高于對(duì)照（P＜0.01）。與EAE模型組相比，模型+RAE 125 mg·kg-1組基本無(wú)炎癥浸潤(rùn)及脫髓鞘情況（P＜0.01）。模型+RAE 250和500 mg·kg-1組均有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘，但與EAE模型組相比明顯得到改善（P＜0.05），提示RAE給藥可改善EAE小鼠脊髓組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及脫髓鞘現(xiàn)象。

2.3 黃芪提取物對(duì)EAE模型小鼠脾CD4+，CD11b+和CD11c+細(xì)胞百分比的影響

Fig.3 Effect of RAE on percentages of CD4+，CD11b+and CD11c+cells in spleen of EAE model mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A：flow cytometry assay of CD4+，CD11b+and CD11c+cells；B：percentages of CD4+，CD11b+and CD11c+cells.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

流式檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，與正常對(duì)照組相比，EAE 模型組脾CD4+，CD11b+和 CD11c+細(xì)胞百分比均增加（P＜0.01）。與模型組相比，RAE各組均可降低脾CD4+，CD11b+和CD11c+細(xì)胞百分比（P＜0.01），提示RAE對(duì)外周免疫細(xì)胞具有一定的調(diào)節(jié)作用。

2.4 黃芪提取物對(duì)EAE模型小鼠脊髓組織NF- κB和Pl3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白及Bax，Bcl-2，活化胱天蛋白酶3和lba1蛋白表達(dá)的影響

Fig.4 Effect of RAE on expression of NF- κB，phosphatidylinositide 3-OH kinase/protein kinase B（Pl3K/Akt） signaling pathway related proteins and Bax，Bcl-2，cleaved-caspase 3 and ionized calcium binding adapter molecule 1（lba1）proteins in spinal cord of EAE model mice by Western blotting.See Fig.1 for the mouse treatment.IA：integrated absorbance.C was the semiquantatitive results of A and B.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜ 0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Western印跡結(jié)果（圖4）顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組NF-κB信號(hào)通路蛋白NF-κB和IκBα磷酸化水平及Iba1、Bax和活化胱天蛋白酶3等蛋白表達(dá)水平均顯著增加（P＜0.01），而PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白PI3K和Akt磷酸化水平及Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比值顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，RAE 125 mg·kg-1對(duì)上述蛋白表達(dá)的變化均可明顯逆轉(zhuǎn)（P＜0.05，P＜0.01），RAE 250可顯著降低p-IκBα/IκBα 和 Bcl-2/Bax的蛋白表達(dá)比值（P＜0.05）；RAE 500 mg·kg-1可顯著降低p-Akt/Akt的蛋白表達(dá)比值。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，與EAE模型組相比，RAE各給藥組的臨床評(píng)分顯著降低，脊髓組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失也顯著減少，尤其是模型+RAE 125 mg·kg-1組基本無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和髓鞘脫失的現(xiàn)象，提示RAE可有效改善EAE小鼠的臨床癥狀，抑制EAE小鼠的神經(jīng)損傷。

CD4+T細(xì)胞在MS發(fā)病機(jī)制中占有核心地位［13］。在被抗原提呈細(xì)胞激活后，CD4+T細(xì)胞通過(guò)血腦屏障進(jìn)入CNS，與靶抗原結(jié)合，分泌促炎癥細(xì)胞因子，進(jìn)而激活小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，擴(kuò)大CNS炎癥反應(yīng)，使補(bǔ)體激活或釋放蛋白水解酶和脂解酶，最終導(dǎo)致髓鞘破壞，軸索損失。CD11b和CD11c為Ⅰ型跨膜糖蛋白，兩者均參與并間接活CD4+T細(xì)胞從而調(diào)控免疫應(yīng)答的發(fā)生［14］。CD11b高表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面，主要用于標(biāo)記巨噬細(xì)胞，在MS中巨噬細(xì)胞激活后將會(huì)分泌大量促炎細(xì)胞因子，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)從而導(dǎo)致斑塊狀脫髓鞘和軸索損傷［15］。CD11c主要用于標(biāo)記樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC），在MS中DC細(xì)胞的主要功能是獲取并加工抗原，上調(diào)協(xié)同刺激分子，隨后將抗原提呈給初始T細(xì)胞，從而激活免疫反應(yīng)［16］。本研究結(jié)果顯示，EAE模型小鼠脾CD4+，CD11b+，CD11c+細(xì)胞百分比顯著上調(diào)，RAE可顯著抑制CD4+T細(xì)胞、CD11c+DC細(xì)胞和CD11b+巨噬細(xì)胞的百分比，提示RAE可能通過(guò)抑制外周免疫細(xì)胞的激活，從而抑制炎癥反應(yīng)。

小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS中的一種巨噬細(xì)胞，在免疫防御體系中扮演了極其重要的角色。病理狀態(tài)下，異常激活的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎癥因子和介質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)展和小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，引發(fā)炎癥的聯(lián)級(jí)反應(yīng)造成神經(jīng)毒性，Iba1為小膠質(zhì)細(xì)胞激活的標(biāo)志物［17-18］。NF-κB在神經(jīng)炎癥性疾病進(jìn)程中扮演重要的角色。目前普遍認(rèn)為，膠質(zhì)細(xì)胞的激活，血腦屏障的破壞及外周免疫細(xì)胞進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)都是神經(jīng)炎癥的表現(xiàn)，過(guò)度的神經(jīng)炎癥反應(yīng)將會(huì)加重神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變。本研究結(jié)果顯示，EAE模型小鼠CNS NF-κB信號(hào)通路蛋白磷酸化水平和Iba1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，RAE 125 mg·kg-1可顯著下調(diào)該模型小鼠脊髓組織NF-κB信號(hào)通路蛋白磷酸化水平和Iba1蛋白的表達(dá)，提示RAE可能通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而抑制CNS的過(guò)度炎癥反應(yīng)。

PI3K/Akt信號(hào)通路是一條重要的細(xì)胞存活信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞凋亡的過(guò)程。Akt是原癌基因c-akt的表達(dá)產(chǎn)物，它的激活受PI3K調(diào)控，為神經(jīng)元存活、神經(jīng)新生、軸突以及樹(shù)突形成、突觸結(jié)構(gòu)形成和突觸間信息傳遞所必需［19］。PI3K/Akt信號(hào)通路激活可抑制線粒體Bcl-2家族相關(guān)蛋白（Bax和Bad）表達(dá)，減少細(xì)胞色素c細(xì)胞漿釋放，阻滯其結(jié)合細(xì)胞質(zhì)中的凋亡蛋白激活因子，減弱胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制因線粒體功能及結(jié)構(gòu)發(fā)生障礙導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。線粒體完整性受Bcl-2家族蛋白調(diào)控，包括蛋白Bcl-2，Bax等。Bax是重要促細(xì)胞凋亡基因，Bcl-2是關(guān)鍵抑制凋亡基因，而B(niǎo)ax/Bcl-2比例具有決定細(xì)胞凋亡強(qiáng)弱的作用。胱天蛋白酶3是胱天蛋白酶家族在凋亡過(guò)程中重要的蛋白酶，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)因子，可直接誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡［20］。本研究結(jié)果顯示，RAE 125 mg·kg-1可顯著上調(diào)EAE小鼠脊髓組織PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白磷酸化水平，顯著下調(diào)促凋亡蛋白Bax和活化胱天蛋白酶3的表達(dá)，Bcl-2/Bax的比值也顯著增加，提示RAE可能通過(guò)促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路的激活、抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡從而達(dá)到一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

由于RAE中主要的化學(xué)成分為黃芪多糖，既有免疫增強(qiáng)作用，同時(shí)也存在免疫抑制作用，能雙向調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的功能［21］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RAE 125 mg·kg-1對(duì)EAE模型小鼠神經(jīng)炎癥的改善作用似乎優(yōu)于RAE 250和500 mg·kg-1，可能是由于RAE中黃芪多糖成分含量較高，對(duì)免疫系統(tǒng)具有雙向調(diào)節(jié)的作用所致，具體原因需進(jìn)一步探討。

綜上所述，RAE可有效緩解EAE模型小鼠的發(fā)病癥狀，減少CNS的炎癥浸潤(rùn)和脫髓鞘，其作用機(jī)制可能與降低周邊炎癥細(xì)胞激活、抑制CNS神經(jīng)炎癥及減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡相關(guān)。