楊寧, 王輝, 劉壽柏，王昊，陳惠琴，戴好富，梅文莉*

?

人工誘導(dǎo)海南龍血竭的化學(xué)成分研究

楊寧1, 王輝2, 劉壽柏1，王昊2，陳惠琴2，戴好富2，梅文莉2*

(1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海口 570228；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南省黎藥資源天然產(chǎn)物研究與利用重點實驗室，?？?571101)

為了解人工誘導(dǎo)海南龍血樹()所產(chǎn)血竭的化學(xué)成分，從其乙醇提取物中分離得到10個化合物, 經(jīng)波譜分析分別鑒定為socotrin-4?-ol (1)、homoisosocotrin-4?-ol (2)、()-3-(3,4-dihydroxybenzylidene)-7-hydroxy-chroman-4-one (3)、5-hydroxy-7-methoxy-3-(4?-hydroxybenzyl)-4-chromanone (4)、3-去氧蘇木查耳酮 (5)、蘇木查耳酮 (6)、7,4?-二羥基黃酮 (7)、7,4?-二羥基-8-甲基黃酮 (8)、丁香樹脂醇 (9)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯 (10)?；衔?~10均為首次從人工誘導(dǎo)海南龍血樹所產(chǎn)血竭中分離得到，其中化合物8為新天然產(chǎn)物，化合物3~6為首次從血竭中分離得到。化合物7和8對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有生長抑制作用。

海南龍血樹；人工誘導(dǎo)血竭；化學(xué)成分；抗菌活性

血竭(dragon’s blood)是一種傳統(tǒng)的名貴中藥, 具有活血化瘀、收斂止血、消腫止痛、補血補虛的功效，用于治療外傷出血、跌打損傷、消腫止痛、瘀滯作痛等各類血癥，自古以來廣泛應(yīng)用于世界很多國家。國內(nèi)使用的血竭有進(jìn)口與國產(chǎn)之分，進(jìn)口血竭主要是棕櫚科(Palmacea)黃藤屬()植物果實的樹脂，國產(chǎn)血竭是由龍血樹屬()植物在受到傷害(物理、化學(xué)或生物等因素)后在莖干中分泌的紅色樹脂[1–2]，其基源植物包括劍葉龍血樹()和海南龍血樹()[3]?；谘唢@著的療效，近年來市場需求迅速增長，但是自然界中血竭的形成極其緩慢，需要幾年甚至幾十年，僅依靠采集野生血竭不能滿足市場需求，且國產(chǎn)血竭基源植物劍葉龍血樹和海南龍血樹均為國家二級瀕危保護(hù)植物[4]，植物資源相當(dāng)有限。因此，采用人工誘導(dǎo)的方法，加速血竭的形成，有助于醫(yī)藥用血竭的可持續(xù)利用。但是，目前關(guān)于人工誘導(dǎo)血竭的化學(xué)成分和生物活性研究較少，主要由本課題組前期對人工誘導(dǎo)的海南龍血樹所產(chǎn)血竭的化學(xué)成分和生物活性進(jìn)行了研究[5–7]。本研究采用硅膠柱色譜、反相硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜以及HPLC等手段對人工誘導(dǎo)血竭繼續(xù)進(jìn)行分離純化及其結(jié)構(gòu)鑒定，豐富人工誘導(dǎo)血竭化學(xué)成分的研究基礎(chǔ)，為人工誘導(dǎo)血竭代替野生血竭提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人工誘導(dǎo)血竭是采用輸液法將本課題組自主創(chuàng)新研制的誘導(dǎo)劑ITBB001輸入到2年生海南龍血樹的枝條中，誘導(dǎo)1年后，于2014年11月采集樹干，將其中變紅的部分刮下，曬干，即得到人工誘導(dǎo)血竭(600.0 g)。經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所王軍副研究員鑒定其基源植物為海南龍血樹()，憑證標(biāo)本(BL201411)存放于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所。

1.2 儀器和試劑

Bruker AV-500型超導(dǎo)核磁共振儀(TMS為內(nèi)標(biāo));Autospec-3000質(zhì)譜儀；Agilent Technologies 1260高分析型校液相色譜儀(美國安捷倫公司); Labal- liance PC-4000半制備型高效液相色譜儀(美國蘭博公司)；Laborta 4001 (2 L)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國海道爾夫公司)；Rotavac Valve Tec二級隔膜泵(德國海道爾夫公司)；CA-1111冷卻水循環(huán)裝置(東京理化器械株式會社)；BP221S萬分之一電子秤(北京賽多利斯天平有限公司)；超凈工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；超純水裝置(廈門銳思捷水純化技術(shù)有限公司)。柱層析硅膠(200~300目，60~80目)和薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠)，Sephadex LH-20、RP- 18 (Fuji公司)，常用分析純有機溶劑(廣州化工和天津大茂等)；AR級濃硫酸(博濱嶺化工有限公司);氘代試劑(Merck公司)；色譜溶劑(天津四友和天津康科德等)；其他試劑均為重蒸工業(yè)試劑。

1.3 樣品提取和分離

人工誘導(dǎo)的海南血竭(600.0 g)干燥后粉碎，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇加熱回流提取3次，每次分別加熱回流3、2、1 h，過濾，合并乙醇提取液, 減壓濃縮至無醇味得紅色粗浸膏，將粗浸膏分散于去離子水中成懸濁液，分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，分別減壓濃縮得浸膏。乙酸乙酯萃取物(100.0 g)經(jīng)減壓硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1~1∶10，/, 下同)梯度洗脫，經(jīng)TLC檢測，合并相同部分，得12個組份(Fr.1~Fr.12)。

Fr.8 (9.0 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以甲醇洗脫得10個組份Fr.8A~Fr.8J。Fr.8B (1.77 g)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以乙醇洗脫得2個組份Fr.8B1和Fr.8B2；Fr.8B1 (1.34 g)經(jīng)硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇(100∶1)洗脫得Fr.8B1A~Fr.8B1E；Fr.8B1C (379.7 mg)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以甲醇洗脫，再經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚-乙酸乙酯(7∶3~2∶1)梯度洗脫得化合物10 (4.1 mg); Fr.8B1D (72.4 mg)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜和硅膠色譜柱，再經(jīng)半制備高效液相色譜(C18柱；75%甲醇水；流速4 mL min–1；檢測波長200，254 nm)恒梯度洗脫得到化合物2 (4.0 mg，保留時間4.5 min); Fr.8B1E (26.1 mg)經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)和硅膠色譜柱(石油醚∶氯仿∶丙酮=5∶5∶1)恒梯度洗脫得到化合物1 (2.0 mg)。

Fr.9 (10.7 g)經(jīng)RP-18反相硅膠柱色譜，以甲醇-水(30%~100%)梯度洗脫得到12個組份Fr.9A~ Fr.9L。Fr.9D (369.0 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(甲醇)分離得到7個組份Fr.9D1~Fr.9D7；Fr.9D2 (209.8 mg)經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(2∶1)洗脫得化合物9 (8.5 mg)；Fr.9D3(148.6 mg)經(jīng)硅膠柱色譜，再經(jīng)半制備高效液相色譜(C18柱；40%甲醇水；流速4 mL min–1；檢測波長210，230 nm)恒梯度洗脫得到化合物4 (2.5 mg，保留時間35.5 min); Fr.9D5 (163.1 mg)經(jīng)硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(13∶1~6∶1)梯度洗脫得化合物5 (2.5 mg)、6 (4.4 mg)和7 (2.0 mg)；Fr.9D7 (41.7 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(氯仿∶甲醇=1∶1)和硅膠柱色譜(氯仿∶甲醇=100∶1)洗脫得化合物3 (3.6 mg)。Fr.9E (410.9 mg)經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜(甲醇)和硅膠柱色譜(石油醚∶氯仿∶甲醇=5∶5∶0.1)，再經(jīng)半制備高效液相色譜(C18柱；55%甲醇水；流速4 mL min–1；檢測波長200，220 nm)恒梯度洗脫得到化合物8 (1.4 mg, 保留時間14.8 min)。

1.4 結(jié)構(gòu)鑒定

Socotrin-4?-ol (1) 白色無定型粉末, 分子式C31H30O6; ESIMS: 521.3 [M + Na]+;1H NMR (500 MHz, CD3OD):H4.15 (1H, t,= 7.4 Hz, H-), 2.10 (2H, m, H-),2.42 (2H, m, H-), 4.85 (1H, m, H-2), 2.03 (1H, m, H-3a), 1.93 (1H, m, H-3b), 2.83 (1H, m, H-4a), 2.62 (1H, m, H-4b), 6.80 (1H, s, H-5), 6.20 (1H, s, H-8), 7.20 (2H, d,= 8.7 Hz, H-2?, 6?), 6.75 (2H, d,= 8.7 Hz, H-3?, 5?), 6.34 (1H, d,= 2.2 Hz, H-3??),6.24 (1H, dd,= 8.1, 2.3 Hz, H-5??), 6.79 (1H, d,= 8.0 Hz,H-6??),7.06 (2H, d,= 8.6 Hz, H-2???, 6???), 6.65 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3???, 5???), 3.73 (3H, s, 2??-OMe);13C NMR (125 MHz, CD3OD):C79.0 (C- 2), 31.6 (C-3), 25.8 (C-4), 113.8 (C-10),129.4 (C-5), 126.4 (C-6),154.8 (C-7), 103.8 (C-8), 154.1 (C-9), 134.4 (C-1?),128.3 (C-2?, C-6?), 116.0 (C-3?, 5?),123.2 (C-1??),159.7 (C-2??), 99.7 (C-3??),157.6 (C-4??),107.5 (C-5??), 131.0 (C-6??),138.3 (C-1???),130.1 (C-2???, 6???),115.7 (C-3???, 5???),43.2 (C-), 37.3 (C-), 29.6 (C-), 156.0 (C-4???),55.6 (2??-OMe)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]一致，確定化合物為socotrin-4?-ol。

Homoisosocotrin-4?-ol (2) 白色無定型粉末,分子式C32H32O6; ESIMS: 535.3 [M + Na]+, 511.2 [M - H]–;1HNMR (500 MHz, CD3OD):H4.12 (1H, t,= 7.8 Hz, H-γ), 2.00 (2H, m, H-), 2.38 (2H, m, H-), 4.01 (1H, dd,= 8.9, 1.8 Hz,H-2a), 3.69 (1H, m, H-2b), 2.12 (1H, m, H-3), 2.35 (1H, dd,= 15.9, 9.1 Hz,H-4a), 2.62 (1H, m, H-4b), 6.76 (1H, s, H-5), 6.14 (1H, s, H-8), 2.51 (2H, m, H-9), 6.98 (2H, d,= 8.4 Hz, H-2?, 6?), 6.68 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3?, 5?), 6.34 (1H, d,= 2.3 Hz, H-3??),6.24 (1H, dd,= 8.0, 2.3 Hz, H-5??), 6.79 (1H, d,= 8.0 Hz,H-6??),7.03 (2H, d,= 8.6 Hz, H-2???, 6???), 6.64 (2H, d,= 8.6 Hz, H-3???, 5???), 3.71 (3H, s, 2??-OMe);13C NMR (125 MHz, CD3OD):C70.8 (C-2), 36.0 (C-3), 31.5 (C-4), 113.3 (C-4a),129.8 (C-5), 126.2 (C-6),154.8 (C-7), 103.5 (C-8), 156.0 (C-8a), 38.1 (C-9), 131.9 (C-1?),131.0 (C-2?, C-6?), 116.1 (C-3?, 5?),123.2 (C-1??),159.7 (C-2??), 99.7 (C-3??),157.6 (C-4??),107.5 (C-5??), 131.1 (C-6??),138.3 (C-1???),130.0 (C-2???, 6???),115.7 (C-3???, 5???),154.1 (C-4???),43.2 (C-), 37.3 (C-), 29.6 (C-), 55.6 (2??-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]一致，確定化合物為homoisosocotrin-4?-ol。

()-3-(3,4-Dihydroxybenzylidene)-7-hydroxy-chroman-4-one (3) 黃色針狀結(jié)晶(甲醇), 分子式C16H12O5; ESIMS: 307.2 [M + Na]+, 283.1 [M - H]–;1H NMR (500 MHz, CD3OD):H5.34 (2H, s, H-2), 6.28 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.50 (1H, dd,= 2.2, 8.7 Hz, H-6), 6.75 (1H, dd,= 1.7, 8.2 Hz, H-6?), 6.80 (1H, d,= 1.7 Hz, H-2?), 6.83 (1H, d,= 8.2 Hz, H-5?), 7.62 (1H, s, H-9), 7.77 (1H, d,= 8.7 Hz, H-5);13C NMR (125 MHz, CD3OD):C69.1 (C-2), 127.6 (C-3), 183.0 (C-4), 115.9 (C-4a), 130.7 (C-5), 112.2 (C-6), 166.7 (C-7), 103.6 (C-8), 164.8 (C-8a), 138.5 (C-9), 129.5 (C-1?), 118.3 (C-2?), 146.6 (C-3?), 148.8 (C-4?), 116.6 (C-5?), 124.6 (C-6?)。根據(jù)HMBC譜和文獻(xiàn)[9], 確定化合物為()-3-(3,4-dihydroxybenzy- lidene)-7-hydroxy-chroman-4-one。

5-hydroxy-7-methoxy-3-(4?-hydroxybenzyl)-4-chromanone (4) 白色無定型粉末, 分子式C16H12O5; ESIMS: 323.2 [M + Na]+, 299.0 [M -H]–;1H NMR (500 MHz, CD3OD):H4.17 (1H, dd,= 3.3, 11.3 Hz, H-2a), 4.01 (1H, dd,= 5.6, 11.3 Hz, H-2b), 2.58 (1H, m, H-3), 5.88 (1H, d,= 2.1 Hz, H- 6), 6.00 (1H, d,= 2.1 Hz, H-8), 2.99 (1H, m, H-9a), 2.58 (1H, m, H-9b), 7.03 (2H, d,= 8.5 Hz, H-2?, 6?), 6.70 (2H, d,= 8.5 Hz, H-3?, 5?);13C NMR (125 MHz, CD3OD):C69.6 (C-2), 50.0 (C-3), 193.8 (C-4), 103.0 (C-4a), 167.3 (C-5), 97.3 (C-6), 164.6 (C-7), 94.9 (C-8), 166.5 (C-8a), 33.6 (C-9), 130.7 (C-1?), 131.1 (C-2?, 6?), 116.3 (C-3?, 5?), 157.1 (C-4?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道基本一致, 確定化合物為5-hydroxy- 7-methoxy-3-(4?-hydroxybenzyl)-4-chromanone。

3-去氧蘇木查耳酮(5) 黃色無定型粉末, 分子式C16H14O4; ESIMS: 293.3 [M + Na]+, 269.1 [M - H]–;1H NMR (500 MHz, CD3OD):H7.39 (1H, d,= 15.7 Hz, H-2), 7.54 (1H, d,= 15.7 Hz, H-3), 6.49 (1H, d,= 2.1 Hz, H-3?), 6.43 (1H, dd,= 2.1, 8.5 Hz, H-5?), 7.56 (1H, d,= 8.5 Hz, H-6?), 7.49 (2H, dd,= 8.6 Hz, H-2, 6), 6.80 (2H, dd,= 8.6 Hz, H-3, 5), 3.87 (3H, s, 2?-OCH3);13C NMR (125 MHz, CD3OD):C125.1 (C-2), 144.2 (C-3), 193.1 (C-1), 121.8 (C-1?), 162.5 (C-2?), 100.1 (C-3?), 164.6 (C-4?), 108.9 (C-5?), 133.7 (C-6?), 128.0 (C-1), 131.4 (C-2, 6), 116.9 (C-3, 5), 161.2 (C-4), 56.1 (2?-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道一致，故確定化合物為3-去氧蘇木查耳酮。

蘇木查耳酮(6) 黃色無定型粉末, 分子式C16H14O5; ESIMS: 309.3 [M + Na]+, 285.1 [M - H]–;1H NMR (500 MHz, CD3OD):H7.34 (1H, d,= 15.6 Hz, H-2), 7.47 (1H, d,= 15.6 Hz, H-3), 6.49 (1H, d,= 2.1 Hz, H-3?), 6.43 (1H, dd,= 2.1, 8.5 Hz, H-5?), 7.55 (1H, d,= 8.5 Hz, H-6?), 7.08 (1H, d,= 1.9 Hz, H-2), 6.77 (2H, d,= 8.2 Hz, H-5), 6.96 (1H, dd,= 1.9, 8.2 Hz, H-6), 3.87 (3H, s, 2?-OCH3);13C NMR (125 MHz, CD3OD):C125.1 (C-2), 144.6 (C-3), 193.1 (C-1), 121.8 (C-1?), 162.5 (C-2?), 100.1 (C-3?), 164.6 (C-4?), 108.9 (C-5?), 133.7 (C-6?), 128.6 (C-1), 115.2 (C-2), 146.8 (C-3), 149.6 (C-4), 116.6 (C-5), 123.3 (C-6), 56.1 (2?-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道一致，故確定化合物為蘇木查耳酮。

7,4?-二羥基黃酮 (7) 黃色無定型粉末, 分子式C15H10O4; ESIMS: 277.2 [M + Na]+, 531.3 [2M + Na]+;1H NMR (500 MHz, DMSO-d):H7.89 (2H, d,= 8.8 Hz, H-2?, 6?), 7.83 (1H, d,= 8.7 Hz, H-5), 6.94 (1H, d,= 2.2 Hz, H-8), 6.90 (2H, d,= 8.8 Hz, H-3?, 5?), 6.87 (1H, dd,= 8.7, 2.2 Hz, H-6), 6.70 (1H, s, H-3);13C NMR (125 MHz, DMSO-d):C162.5 (C-2), 104.4 (C-3), 176.3 (C-4), 126.4 (C-5), 114.9 (C-6), 162.4 (C-7), 102.5 (C-8), 157.4 (C-9), 115.9 (C-10), 121.8 (C-1'), 128.1 (C-2?, 6?), 115.9 (C-3?, 5?), 160.7 (C-4?)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道一致，故確定化合物為7,4?-二羥基黃酮。

7,4?-二羥基-8-甲基黃酮 (8) 黃色無定型粉末，根據(jù)HR-ESI-MS中的分子離子峰(269.080 8 [M + H]+, C16H13O4計算值269.081 4)，結(jié)合13C NMR (DEPT)得出其分子式為C16H12O4。通過1H和13C NMR譜數(shù)據(jù)可以推斷該化合物為黃酮類化合物。1H NMR譜圖顯示該化合物有1個AA?BB?偶合系統(tǒng)[H7.85 (2H, d,= 8.8 Hz, H-2?, 6?), 6.89 (2H, d,= 8.8 Hz, H-3?, 5?)]，表明該化合物B環(huán)為1個對羥基取代的苯環(huán)；1個AB偶合系統(tǒng)[H7.75 (1H, d,= 8.8 Hz, H-5), 6.84 (1H, d,= 8.8 Hz, H-6)]，可以推斷出A環(huán)為1個四取代的苯環(huán)。根據(jù)HMBC相關(guān)信號顯示(圖1)，A環(huán)上的質(zhì)子信號H6.84 (H-6)與C113.1(C-8), 116.1 (C-4a)的相關(guān)，質(zhì)子信號H7.75 (H-5)與C180.8 (C-4)，157.8 (C-7)和164.9 (C-8a)的相關(guān)以及甲基信號H2.36 (-CH3)與C113.1 (C-8)，157.8 (C-7)和164.9 (C-8a)相關(guān)，表明甲基與C-8相連, 其中1個羥基位于C-7位上。綜上所述該化合物鑒定為7,4?-二羥基-8-甲基黃酮。通過HSQC和HMBC譜(圖1)分析, 歸屬了該化合物的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)。1H NMR (500 MHz, CD3OD):H7.85 (2H, d,= 8.8 Hz, H-2?, 6?), 7.75 (1H, d,= 8.8 Hz, H-5), 6.89 (2H, d,= 8.8 Hz, H-3?, 5?), 6.84 (1H, d,= 8.8 Hz, H-6), 6.61 (1H, s, H-3), 2.36 (3H, s, 8-CH3);13C NMR (125 MHz, CD3OD):C165.8 (C-2), 104.3 (C-3), 180.8 (C-4), 116.1 (C-4a), 124.2 (C-5), 116.2 (C-6), 157.8 (C-7), 113.1 (C-8), 164.9 (C-8a), 123.6 (C-1?), 129.3 (C-2?, 6?), 117.3 (C-3?, 5?), 163.3 (C-4?)。

圖1 化合物8的關(guān)鍵HMBC信號

丁香樹脂醇 (9) 白色無定型粉末, 分子式C22H26O8; ESIMS: 441.3 [M + Na]+, 417.1 [M - H]–;1H NMR (500 MHz, CD3OD):H3.11 (2H, m, H-8, 8′), 3.81 (12H, s, 4×OCH3), 4.23 (2H, m, H-9a, 9′a), 3.85 (2H, m, H-9b, 9′b), 4.69 (2H, d,= 4.4 Hz, H-7, 7′), 6.63 (4H, s, H-2, 6, 2′, 6′);13C NMR (125 MHz, CD3OD):C55.5 (C-8, 8′), 56.8 (4×OCH3), 72.8 (C-9, 9′), 87.6 (C-7, 7′), 104.4 (C-2, 2′, 6, 6′), 133.1 (C-1, 1′), 136.2 (C-4, 4′), 149.3 (C-3, 3′, 5, 5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報道一致，故確定化合物為丁香樹脂醇。

鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯 (10) 黃色油狀物, 分子式C24H38O4; ESIMS: 413.5 [M + Na]+,389.1 [M - H]–;1H NMR (CDCl3, 500 MHz):H7.72 (2H, m, H-3, 6), 7.54 (2H, m, H-4, 5), 4.23 (2H, t,= 6.0 Hz, H-1′), 1.69 (2H, m, H-2′), 1.43 (2H, m, H-1″), 1.38 (2H, m, H-3′), 1.33 (2H, m, H-4′), 1.31 (2H, m, H-5′), 0.91 (3H, t,= 7.4 Hz, H-2″), 0.90 (3H, t,= 7.3 Hz, H-6′)，13C NMR (125 MHz, CDCl3):C167.9 (COO-), 132.6 (C-1,2), 131.0 (C-4,5), 128.9 (C- 3,6), 68.3 (C-1′), 38.9 (C-2′), 30.5 (C-3′), 29.1 (C-4′), 23.1 (C-5′), 14.2 (C-6′), 23.9 (C-1″), 11.1 (C-2″)。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致，故確定化合物為鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯。

1.5 抑菌活性測試

采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法[15]測定化合物1~10的抗菌活性。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin- resistant, MRSA)在NA培養(yǎng)基(牛肉膏3.0 g、瓊脂20.0 g、蛋白胨10.0 g和NaCl 5.0 g，pH為7.0~7.2)上培養(yǎng)。將MRSA分別制成一定濃度的菌懸液(105~107cfu mL–1), 用棉簽均勻涂布于供試無菌平板，制成含菌平板。將化合物1~10和萬古霉素分別配成濃度為1 mg mL–1的溶液，取10L分別滴加于直徑為6 mm的滅菌濾紙片上，待溶劑揮干后將濾紙片置于含菌平板上, 每個樣品平行3次，以萬古霉素為陽性對照, 37℃恒溫條件下培養(yǎng)。24 h后測量并記錄抑菌圈直徑。結(jié)果表明，化合物7和8對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有生長抑制作用，其抑菌圈直徑分別為12.0 和13.0 mm, 陽性對照萬古霉素的抑菌圈直徑均為21.0 mm。

采用微量稀釋法[16]，進(jìn)一步測定了化合物7和8對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長抑制活性, 其MIC值分別為61.52和7.29mol L–1，萬古霉素的MIC為0.67mol L–1。

2 結(jié)果和討論

本研究采用多種分離手段和技術(shù)，從人工誘導(dǎo)的海南血竭中分離鑒定了10個化合物，分別為soco- trin-4?-ol (1)、homoisosocotrin-4?-ol (2)、()-3-(3,4- dihydroxybenzylidene)-7-hydroxy-chroman-4-one (3)、 5-hydroxy-7-methoxy-3-(4?-hydroxybenzyl)-4-chro-manone (4)、3-deoxysappanch-alcone (5)、sappan- chalcone (6)、7,4?-二羥基黃酮 (7)、7,4?-二羥基-8-甲基黃酮(8)、丁香樹脂醇 (9)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯 (10)。采用濾紙片瓊脂擴(kuò)散法測定化合物1~10的抗菌活性，結(jié)果表明，化合物7和8對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有生長抑制作用, 其MIC值分別為61.52和7.29mol L–1。

化合物1和2已從龍血樹屬植物所產(chǎn)血竭中分離鑒定[8]，化合物7從劍葉龍血樹所產(chǎn)血竭中分離鑒定[12]?；衔?~6為首次從人工血竭中分離鑒定，但是其基本骨架與天然血竭保持一致，只是其取代基發(fā)生了變化，這進(jìn)一步說明通過輸液法誘導(dǎo)的人工血竭化學(xué)成分與天然血竭基本一致。

[1] GUPTA D, BLEAKLEY B, GUPTA R K. Dragon’s blood: Botany, chemistry and therapeutic uses [J]. J Ethnopharmacol, 2008, 115(3): 361–380. doi: 10.1016/j.jep.2007.10.018

[2] HE L, WANG Z H, TU P F, et al. Advances in study on chemical constituents and pharmacological activities in plants ofVand. ex L. [J]. Chin Trad Herb Drugs, 2004, 35(2): 221–228. doi: 10.3321/j. issn:0253-2670.2004.02.043何蘭, 王竹紅, 屠鵬飛, 等. 龍血樹屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2004, 35(2): 221–228. doi: 10.3321/j.issn:0253- 2670.2004.02.043

[3] LUO Y, WANG H, ZHAO Y X, et al. Cytotoxic and antibacterial flavonoids from dragon’s blood of[J]. Planta Med, 2011, 77(18): 2053–2056. doi: 10.1055/s-0031-1280086

[4] ZHENG D J, YUN Y, WU Y J, et al. Geographical distribution of wildin China and its relationship with hydrothermal factors [J]. J Trop Subtrop Bot, 2012, 20(4): 326–332. doi: 10.3969/ j.issn.1005-3395.2012.04.002鄭道君, 云勇, 吳宇佳, 等. 海南龍血樹野生資源分布及其與水熱關(guān)系的分析[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報, 2012, 20(4): 326–332. doi: 10.3969/j.issn.1005-3395.2012.04.002

[5] JIANG H M, WANG H, WANG J, et al. Antibacterial components from artificially induced dragon’s blood of[J]. China J Chin Mat Med, 2015, 40(20): 4002–4006. 蔣和梅, 王輝, 王軍, 等. 人工誘導(dǎo)海南龍血樹所產(chǎn)血竭的抗菌活性成分研究[J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(20): 4002–4006.

[6] WANG H, JIANG H M, LI F X, et al. Flavonoids from artificially induced dragon’s blood of[J]. Fitoterapia, 2017, 121: 1–5. doi: 10.1016/j.fitote.2017.06.019.

[7] LI F X, WANG H, GAI C J, et al. Three new flavanoids from artifi- cially induced dragon’s blood of[J]. J Asian Nat Prod Res, 2018, 20(1): 55–61. doi: 10286020.2017.1322583.

[8] MASAOUD M, HIMMELREICH U, RIPPERGER H, et al. New biflavonoids from dragon’s blood of[J]. Planta Med, 1995, 61(4): 341–344. doi:10.1055/s-2006-958096.

[9] CHEN Y P, LIU L, ZHOU Y H, et al. Chemical constituents from sappan lignum [J]. J Chin Pharm Sci, 2008, 17(1): 82–86.

[10] MUTANYATTA J, MATAPA B G, SHUSHU D D, et al. Homoiso- flavonoids and xanthones from the tubers of wild andregeneratedand cytotoxic activities of some of the homoisoflavonoids [J]. Phytochemistry, 2003, 62(5): 797–804. doi: 10.1016/S0031-9422(02)00622-2.

[11] ESCOBAR-RAMOS A, LOBATO-GARCíA C E, ZAMILPA A, et al. Homoisoflavonoids and chalcones isolated fromL., with spasmolytic activity [J]. Molecules, 2017, 22 (9): 1405. doi: 10.3390/molecules22091405.

[12] TU P F, TAO J, HU Y Q, et al. Flavones from the wood[J]. Chin J Nat Med, 2003, 1(1): 27–29. 屠鵬飛, 陶晶, 胡迎慶, 等. 龍血竭黃酮類成分研究[J]. 中國天然藥物, 2003, 1(1): 27–29.

[13] ZHAO L J, WANG Y W, LI Z F, et al. Isolation and identification of chemical constituents from[J]. Chin Trad Herb Drugs, 2018, 49(3): 544–548. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2018.03.006.趙蘭君, 王玉偉, 李志峰, 等. 小花清風(fēng)藤化學(xué)成分的分離與鑒定[J]. 中草藥, 2018, 49(3): 544–548. doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2018.03.006.

[14] HUANG M X, CAI Y J, LIU S B, et al. Study on the chemical constituents ofbranches and leaves and its anti- tumor activity[J]. China Pharm, 2017, 28(7): 895–898. doi: 10. 6039/j.issn.1001-0408.2017.07.09.黃茂莘, 蔡楊靖, 劉壽柏, 等. 憂遁草枝葉的化學(xué)成分及體外抗腫瘤活性研究[J]. 中國藥房, 2017, 28(7): 895–898. doi: 10.6039/j.issn. 1001-0408.2017.07.09.

[15] XU S Y, BIAN R L, CHEN X. Experimental Methodology of Pharma- cology [M]. 3rd ed. Beijing: People’s Sanitation Press, 1982: 1–651.徐叔云, 卞如濂, 陳修. 藥理實驗方法學(xué)[M]. 第3版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1982: 1–651.

[16] SUN F H, LONG N N, WANG X M, et al.antibacterial activity of geraniol against methicillin-resistant[J]. Chin J Antibiot, 2018, 43(7): 921–926. 孫豐慧, 龍娜娜, 王雪梅, 等. 香葉醇體外抗MRSA活性研究 [J].中國抗生素雜志, 2018, 43(7): 921–926.

Chemical Constituents from Artificially Induced Dragon’s Blood of

YANG Ning1, WANG Hui2, LIU Shou-bai1, WANG Hao2, CHEN Hui-qin2, DAI Hao-fu2, MEI Wen-li2*

(1.Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University,Haikou 570228, China; 2. Hainan Key Laboratory for Research and Development of Natural Products from Li Folk Medicine, Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101, China)

In order to understand the chemical constituents ofartificially induced dragon’s blood of, ten compounds were isolated from the ethanol extractOn the basis of spectral data, their structures were indentified as socotrin-4?-ol (1), homoisosocotrin-4?-ol (2), ()-3-(3,4-dihydroxybenzylidene)-7-hydroxy- chroman-4-one (3), 5-hydroxy-7-methoxy-3-(4?-hydroxybenzyl)-4-chromanone (4), 3-deoxysappa-nchalcone (5), sappanchalcone (6), 7,4?-dihydroxyflavone (7), 7,4?-dihydroxy-8-methylflavone (8), syringares-inol (9) and bis (2-ethylhexyl) phthalate (10). All compounds were isolated from artificially induced dragon’s blood offor the first time, compound 8 was a new natural product, compounds 3-6 were isolated from dragon’s blood for the first time. The compounds 7 and 8 had inhibitory activities against methicillin-resistant(MRSA).

; Artificially induced dragon’s blood; Chemical constituent; Antibacterial activity

10.11926/jtsb.3974

2018-07-19

2018-09-29

海南自然科學(xué)基金創(chuàng)新研究團(tuán)隊項目(2017CXTD020)；國家自然科學(xué)基金項目(31400297)；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費項目(17CXTD-15, 1630052016008)資助

This work was supported by the Innovative Research Team of Natural Science Foundation of Hainan Province (Grant No. 2017CXTD020), the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31400297), and the Project for Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences (Grant No. 17CXTD-15, 1630052016008).

楊寧(1994~ )，男，碩士研究生，從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail: 382041873@qq.com

E-mail: meiwenli@itbb.org.cn