吳浩祥, 袁捷, 肖文靜, 陳錦蘭

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LC-MS導(dǎo)向分離山殼骨中主成分及其生物活性研究

吳浩祥1, 袁捷2*, 肖文靜2, 陳錦蘭2

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院, 廣州 510405; 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院, 廣州 510006)

為了解山殼骨()的化學(xué)成分和生物活性，運(yùn)用LC-MS聯(lián)用技術(shù)分離得到羽扇豆醇(1)和豆甾醇(2)。體外活性評(píng)價(jià)結(jié)果表明，化合物1和2均具有中等的抗MRSA活性，但不具有神經(jīng)保護(hù)作用。這是首次對(duì)山殼骨進(jìn)行化學(xué)成分和生物活性研究，為綜合開發(fā)與利用山殼骨提供科學(xué)依據(jù)。

山殼骨；LC-MS；羽扇豆醇；豆甾醇

爵床科(Acanthaceae)為泛熱帶分布的大科，在我國主要分布于長江以南的各省份，以云南分布最多[1–2]。本科植物種類繁多，《中國植物志》記載我國有68屬300多種，形態(tài)多樣，有喬木、灌木、草本和藤本等；分布范圍廣，森林、荒漠、郊野、甚至紅樹林均有分布，故一直被認(rèn)為屬于研究難度大的科[1–3]。爵床科多種植物可供藥用，其中不少為知名中藥材，如板藍(lán)()、穿心蓮()、尖藥花()、槍刀藥()、九頭獅子草()等；當(dāng)中的穿心蓮更是祛熱解毒、消炎止痛之良藥，對(duì)細(xì)菌性與病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊療效，被譽(yù)為天然抗生素藥物[4]。目前，以穿心蓮為主要原料，已有多個(gè)廣泛應(yīng)用于臨床的中成藥，如穿心蓮內(nèi)酯片、炎琥寧、穿琥寧等[5]。可見，爵床科植物具有明顯藥用價(jià)值，明星藥材“穿心蓮”更是被制作成多種中成藥用于治療多種疾病，且效果顯著。據(jù)此，天然藥物化學(xué)家們對(duì)爵床科植物的研究產(chǎn)生了巨大興趣，并致力于該科植物的化學(xué)成分與生物活性研究。

山殼骨屬()約有60~100種植物，分布于泛熱帶，亞洲約20種，其中我國暫有8種[3]。目前，國內(nèi)對(duì)山殼骨屬植物的化學(xué)成分與生物活性研究尚屬空白，因此對(duì)該屬植物進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分及生物活性研究，發(fā)掘擁有潛在藥理活性的品種，具有重要科學(xué)意義。山殼骨()隸屬山殼骨屬植物，產(chǎn)于廣東(徐聞)、海南(保亭、儋州)、廣西(龍州)、云南(西雙版納)[3]。本研究對(duì)山殼骨的化學(xué)成分與生物活性進(jìn)行研究，運(yùn)用LS- MS聯(lián)用技術(shù)快速分離鑒定山殼骨的主要化學(xué)成分，并對(duì)獲得的化學(xué)成分進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià), 旨在發(fā)掘山殼骨的藥用價(jià)值，彌補(bǔ)山殼骨研究的空白,同時(shí)為綜合開發(fā)與利用山殼骨提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑和耗材

質(zhì)譜：Waters 3100 SQDMS (低分辨ESI)；核磁共振譜：Bruker Avance III 500型核磁共振儀，以氘代試劑殘留溶劑峰為內(nèi)標(biāo)；液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters 2695 LC偶聯(lián)Waters Acquity ELSD、Waters 3100 SQDMS；分析色譜柱型號(hào)：Waters Sunfire?RP C-18，3.5m, 4.6 mm×100 mm；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；垂直超凈工作臺(tái)(上海智城分析儀器制造有限公司)；低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；MK3型酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司)；超低溫冰箱(日本三洋SANYO公司)；FM-500型倒置熒光生物顯微鏡(上海普丹光學(xué)儀器有限公司)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)。

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；Greiss NO試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；MTT噻唑蘭(美國Sigma公司)；叔丁基過氧化氫(t-BHP)(成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司)；200~300、300~400目柱層析硅膠均為青島海洋化工廠生產(chǎn)；TLC預(yù)制薄層板: HSGF254為德國Merck公司生產(chǎn)；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech AB、Uppsala、Sweden); MCI樹脂：CHP20P (75~150m), Mitsubishi Chemical Corporation生產(chǎn)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國CORNING公司)；胎牛血清(FBS) (澳大利亞Gibco公司)；青-鏈霉素(P/S)(Thermo公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(德國Biological Industries公司)；DMSO溶液(美國Sigma公司); HPLC分析用乙腈(Merck公司); 實(shí)驗(yàn)用水由美國Millipore公司純水、超純水系統(tǒng)提供；其他有機(jī)溶劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；TLC顯色劑為5%香蘭素乙醇液。

1.2 材料

山殼骨()全株15 kg, 2018年4月，采集于廣東省揭陽市，標(biāo)本號(hào)為20180401。

1.3 細(xì)胞株

神經(jīng)細(xì)胞株：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y；購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

細(xì)菌細(xì)胞株：金黃色葡萄球菌CMCC26003、大腸桿菌ATCC8739和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MASA JCSC4474；購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

1.4 LC-MS分析條件

分析儀器：Waters 2695-2998-2424-3100SQDMS;色譜柱：Waters Sunfire?RP C18, 3.5m, 4.6 mm×100 mm；HPLC梯度：色譜乙腈-0.005%三氟乙酸/去離子水-0.005%三氟乙酸梯度洗脫，起始濃度5%色譜乙腈-0.005%三氟乙酸，結(jié)束濃度95%色譜乙腈-0.005%三氟乙酸；運(yùn)行時(shí)間25 min；流速：1 mL min–1。

1.5 LC-MS導(dǎo)向分離

山殼骨(15 kg)，粉碎后用95%工業(yè)酒精室溫浸泡3次，每次5 d，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味。將得到的總浸膏用水懸浮，然后用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮萃取液，得到水部分(205 g)和乙酸乙酯部分(85 g)。

運(yùn)用LS-MS聯(lián)用技術(shù)，對(duì)獲得的水部分(205 g)和乙酸乙酯部分(85 g)進(jìn)行分析。水部分化合物的保留時(shí)間集中在0~2 min，提示為大極性類化合物(圖1: A)。質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，保留時(shí)間R=1.91 min的化合物分子量為180，推導(dǎo)為葡萄糖；而保留時(shí)間R≈ 1.29 min的化合物分子量在質(zhì)譜上響應(yīng)不明顯，結(jié)合其大極性特點(diǎn)，推導(dǎo)為無機(jī)鹽類成分。據(jù)此，本研究將不對(duì)山殼骨提取物水部分進(jìn)行深入研究。

乙酸乙酯部分主要化合物的保留時(shí)間集中在26.14 min (圖1: B)。隨后對(duì)保留時(shí)間R=26.14 min的色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜分析，該色譜峰存在著2個(gè)分子量(426、412)，揭示其包含2個(gè)化合物。據(jù)此，本研究選擇對(duì)山殼骨提取物乙酸乙酯部分進(jìn)行深入研究，分離鑒定R=26.14 min的主要化合物。選用MCI柱層析處理乙酸乙酯部分，以乙醇-水(50%、70%、95%乙醇)為流動(dòng)相梯度洗脫，富集R=26.14 min的化合物，根據(jù)其弱極性特征，該類化合物將富集在95%乙醇的洗脫組分中(組分A)。

隨后，采用硅膠柱層析(200~300目)對(duì)組分A進(jìn)行處理，正己烷:乙酸乙酯[10∶1~1∶1, (/, 下同)]梯度洗脫，薄層色譜(TLC)檢測合并，獲得子組分A1~A3。子組分A2經(jīng)凝膠柱層析處理，氯仿∶甲醇(1∶1)洗脫，得到組分B2A~B2C；接下來對(duì)得到的子組分B2B再進(jìn)行硅膠(300~400目)柱層析處理，正己烷∶乙酸乙酯(10∶1~1∶1)洗脫，最后獲得化合物1 (18 g)和2 (15 g)(圖2)。

1.6 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H2.36 (1H, m, H-19), 4.56 (1H, s, Ha-29), 4.68 (1H, s, Hb-29), 1.67 (3H, s, H-30);13C NMR (125 MHz, CDCl3):C38.6 (C-1), 27.3 (C-2), 78.9 (C-3), 40.0 (C-4), 55.2 (C-5), 18.0 (C-6), 34.2 (C-7), 40.8 (C-8), 50.4 (C-9), 37.1 (C-10), 20.88 (C-11), 25.0 (C-12), 38.0 (C-13), 42.8 (C-14), 27.9 (C-15), 35.5 (C-16), 42.9 (C-17), 48.2 (C-18), 47.9 (C-19), 151.0 (C-20), 29.7 (C-21), 38.8 (C-22), 27.3 (C-23), 15.4 (C-24), 15.9 (C-25), 16.1 (C-26), 14.5 (C-27), 18.2 (C-28), 109.3 (C-29), 19.2 (C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的一致，故鑒定為羽扇豆醇。

化合物2 白色粉末;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H0.68 (3H, s, H-18), 1.01 (3H, s, H-19), 0.93 (3H, d,= 6.7 Hz, H-21), 0.80 (3H, d,= 6.7 Hz, H- 27), 0.82 (3H, t,= 7.2 Hz, H-29), 0.84 (3H, d,=6.7 Hz, H-26), 5.35 (1H, m, H-6), 5.14 (1H, dd,= 15.1, 8.7 Hz, H-22), 5.02 (1H, dd,= 15.1, 8.7 Hz, H- 23), 3.53 (1H, m, H-3);13C NMR (125 MHz, CDCl3):C37.4 (C-1), 29.2 (C-2), 71.8 (C-3), 42.4 (C-4), 140.7 (C-5), 121.7 (C-6), 31.7 (C-7), 32.0 (C-8), 50.2 (C-9), 36.6 (C-10), 21.2 (C-11), 39.9 (C-12), 42.4 (C-13), 56.9 (C-14), 24.4 (C-15), 29.2 (C-16), 56.7 (C-17), 11.8 (C-18), 18.7 (C-19), 39.9 (C-20), 19.0 (C-21), 138.3 (C-22), 129.2 (C-23), 51.4 (C-24), 32.0 (C-25), 21.0 (C-26 ), 21.2 (C-27), 21.3 (C-28), 12.4 (C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]報(bào)道的一致，故鑒定為豆甾醇。

圖2 化合物1和2的結(jié)構(gòu)

1.7 生物活性篩選

體外神經(jīng)保護(hù)活性篩選 將SH-SY5Y細(xì)胞以6×109L–1的密度接種于經(jīng)多聚賴氨酸包被過的培養(yǎng)皿中，加入含有10% FBS和1% P/S的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天全量換液1次，隔天傳代，并在顯微鏡下觀察。將SH- SY5Y細(xì)胞以6×105L–1的密度接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中，每孔100L。將細(xì)胞分為0 (正常組)、50、100和200mol L–1的t-BHP組，每組6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí)，吸凈培養(yǎng)基，加入含有相應(yīng)濃度t-BHP的培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3、6、12和24 h，觀察SH- SY5Y細(xì)胞衰老情況。將SH-SY5Y細(xì)胞以6×109L–1的密度接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中，每孔100L。將細(xì)胞分為正常組、模型組、給藥組(含有25、50、100和200g mL–1大葉紫金牛酚的模型組)，每組6個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 觀察化合物1、2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞衰老的保護(hù)情況。MTT法檢測各組SH-SY5Y細(xì)胞的存活率。

體外抗MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)活性篩選 本實(shí)驗(yàn)使用96孔板梯度稀釋技術(shù)，測定化合物的最低抑菌濃度。首先將7.5 mL的指示劑溶液(100g mL–1的刃天青水溶液)與5 mL的待測菌溶液(1.25×106cfu mL–1)混勻，并向第1至第8列的所有測試孔中各加入100L混合菌液。然后將20L待測樣品的DMSO溶液和80L混合菌液加入到第1列的各個(gè)板孔中，均勻混合后取出100L的溶液轉(zhuǎn)移到第2列相應(yīng)的板孔中，并用同樣的方法倍增稀釋到第8列。最后，將加好樣品的孔板放入到恒溫培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)10~12 h。菌液變紅色為無抑菌活性，藍(lán)色為有抑菌活性，菌液維持藍(lán)色的最低稀釋濃度被認(rèn)為是待測化合物的最低抑菌濃度,每個(gè)樣品做2組并重復(fù)測定3次。陽性對(duì)照為萬古霉素(vancomycin)。

2 結(jié)果和討論

2.1 體外神經(jīng)保護(hù)活性評(píng)價(jià)

現(xiàn)代研究表明神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)是防治神經(jīng)退行性疾病，如老年性癡呆、重癥抑郁癥、帕金森癥和中風(fēng)等疾病的重要機(jī)制[7–10]。評(píng)價(jià)并篩選出具有顯著神經(jīng)保護(hù)活性的化合物，對(duì)開發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病藥物至關(guān)重要。因此，本研究通過探討化合物1、2是否可以延緩SH-SY5Y細(xì)胞衰老，評(píng)價(jià)化合物1、2是否具有神經(jīng)保護(hù)作用。試驗(yàn)結(jié)果表明, 化合物1、2與模型組相比，不能延緩SH-SY5Y細(xì)胞衰老，因此在SH-SY5Y模型下，化合物1、2不具有神經(jīng)保護(hù)作用。

2.2 體外抗MRSA活性評(píng)價(jià)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant，MRSA)被稱為“超級(jí)細(xì)菌”, 已成為全球院內(nèi)感染的首要致病菌，與HBV、HIV并列成為世界范圍的三大難題[11–15]。MRSA具有多重耐藥性，對(duì)-內(nèi)酰胺等幾乎所有臨床常用抗生素表現(xiàn)出耐藥性；萬古霉素曾一度被認(rèn)為是治療MRSA感染的首選抗生素，但該抗生素毒副作用大，長期大劑量使用對(duì)腎臟損害嚴(yán)重，容易造成耳聾[16–19]。因此，尋找新的能抑制MRSA的抗生素迫在眉捷。

本研究評(píng)價(jià)了化合物1、2對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸桿菌ATCC8739)、革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌CMCC26003)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA JCSC4474)的抑制活性。從表1可知，化合物1、2均對(duì)MRSA JCSC4474表現(xiàn)出中等抑制活性，MIC值為50g mL–1。

表1 化合物1和2的體外抑菌活性

本研究首次對(duì)爵床科山殼骨植物進(jìn)行化學(xué)成分和生物活性研究，運(yùn)用LC-MS聯(lián)用技術(shù)快速分離山殼骨中主要化學(xué)成分，并使用核磁共振波譜技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，鑒定為羽扇豆醇(1)和豆甾醇 (2)。同時(shí)本研究評(píng)價(jià)了化合物的體外神經(jīng)保護(hù)以及抗MRSA活性，試驗(yàn)結(jié)果揭示這些化合物具有中等抗MRSA活性但不具有神經(jīng)保護(hù)作用，為綜合開發(fā)與利用山殼骨提供科學(xué)依據(jù)。

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LC-MS Guided Isolation of Chemical Constituents fromand Their Biological Activities

WU Hao-xiang1, YUAN Jie2*, XIAO Wen-jing2, CHEN Jin-lan2

(1.The First Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405, China; 2. Mathematical Engineering Academy of Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

In order to study the chemical constituents fromand their biological activities, two main compounds were isolated from the EaOAc fraction and identified as lupeol (1) and stigmasterol (2) by using LC-MS guided isolation.activity screening, all these compounds showed moderate anti-MRSA activities but no neuroprotective effects. This is the first report about the chemical constituents fromand their biological activities, which would provide scientific basis to the development and utilization of.

; LC-MS; Lupeol; Stigmasterol

10.11926/jtsb.4020

2018-11-22

2018-12-20

廣東省中藥新藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放運(yùn)行費(fèi)(2017B030314096)資助

This work was supported by the Open Operation Cost of Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Development and Research of Chinese Medicine (Grant No. 2017B030314096).

吳浩祥，男，博士，研究方向?yàn)橹兴幮滤幯邪l(fā)。E-mail: gzwhx2010@163.com

E-mail: yuanjie@gzucm.edu.cn