倪 敏 ， 章 豪 ，劉婷婷 ， 潘 楊

（1.蘇州科技大學(xué) 江蘇省環(huán)境科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215009；2.蘇州科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 蘇州215009）

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time Flurescent Quantitive Po1ymerase Chain Reaction，qPCR）技術(shù)于1995年由美國(guó)PE公司推出，Heid[1]等首先就其原理及方法進(jìn)行了報(bào)道。該技術(shù)的推行實(shí)現(xiàn)了對(duì)環(huán)境微生物菌種及功能基因進(jìn)行定性和絕對(duì)定量的檢測(cè)，打破了傳統(tǒng)微生物純培養(yǎng)困難、親緣關(guān)系較近菌種無(wú)法區(qū)分鑒別、各進(jìn)化分支菌種分類(lèi)研究止步不前等瓶頸，特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便無(wú)毒害，目前已在動(dòng)植物基因工程[2]、微生物[3]、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4]和環(huán)境領(lǐng)域[5]中得到廣泛應(yīng)用。

活性污泥法作為一種新型的微生物污水處理技術(shù)，在城市污水處理中應(yīng)用廣泛。處理過(guò)程主要依靠生物量豐富的微生物聚集體——“菌膠團(tuán)”，分解污水中的有機(jī)物，并不斷進(jìn)行新陳代謝，達(dá)到連續(xù)處理廢水的目的[6]。相比于物理和化學(xué)處理技術(shù)，基于微生物代謝作用的活性污泥法具有處理效果好、工程造價(jià)相對(duì)較低、運(yùn)行成本低廉等優(yōu)點(diǎn)[7]。污水處理過(guò)程中微生物優(yōu)勢(shì)菌種群落結(jié)構(gòu)的變化及豐度與工藝的穩(wěn)定運(yùn)行密切相關(guān)。qPCR應(yīng)用于檢測(cè)活性污泥微生物的目標(biāo)基因，反映微生物的群落結(jié)構(gòu)或功能。qPCR對(duì)微生物的準(zhǔn)確定量和定性有助于解析污水處理的過(guò)程及機(jī)制，對(duì)反應(yīng)工藝的穩(wěn)定運(yùn)行提供指導(dǎo)。

1 環(huán)境活性污泥樣品的特點(diǎn)

環(huán)境活性污泥樣品是指在環(huán)境水處理領(lǐng)域中，使用生物法進(jìn)行脫氮除磷處理所馴化產(chǎn)生的具有功能微生物的污泥，具有以下特點(diǎn)：（1）樣品來(lái)源多樣，有城市生活污水處理廠底泥、垃圾處理堆滲濾液、工業(yè)廢水處理廠、河道底泥、湖泊底泥等；qPCR通用的細(xì)菌引物可以針對(duì)不同來(lái)源的樣品，檢測(cè)相同的菌種，為不同來(lái)源樣品菌種種類(lèi)和豐富度的比較提供可能。（2）成分復(fù)雜，微生物種類(lèi)豐富，原生動(dòng)物、后生動(dòng)物、古菌、原核生物、真核生物并存；qPCR應(yīng)用于微生物種類(lèi)的定性和定量研究需建立在能設(shè)計(jì)特異性引物的前提下，特異性引物的設(shè)計(jì)提高了檢測(cè)的針對(duì)性，避免了純菌檢測(cè)的復(fù)雜性。（3）雜質(zhì)多樣，后續(xù)分析干擾因素較多，腐殖酸、蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、酚類(lèi)、重金屬等各種有機(jī)物無(wú)機(jī)物混合，同時(shí)含有各種酶類(lèi)，其中核酸酶對(duì)基因組的抽提產(chǎn)生較大的干擾，如核糖核酸酶會(huì)降解RNA，對(duì)RNA的抽提得率產(chǎn)生抑制[8]，腐殖酸在基因組中的殘留，容易抑制酶的活性，從而對(duì)qPCR的擴(kuò)增產(chǎn)生抑制，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[9-10]；qPCR前處理過(guò)程的基因組抽提和純化在基因組濃度和質(zhì)量方面有統(tǒng)一的要求，標(biāo)準(zhǔn)的操作過(guò)程減少了樣品雜質(zhì)的異質(zhì)性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。（4）環(huán)境活性污泥樣品的分析主要集中于原核生物的分析，對(duì)特定菌種和特定基因的定性和定量主要通過(guò)制備濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR——絕對(duì)定量，絕對(duì)定量靈敏、準(zhǔn)確、認(rèn)可度高，但對(duì)操作環(huán)境、人員素質(zhì)的要求較高；qPCR絕對(duì)定量彌補(bǔ)了相對(duì)定量及常規(guī)的分子生物學(xué)方法在微生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)方面的不足。（5）原核生物16S rDNA有11個(gè)恒定區(qū)和9或10個(gè)可變區(qū)，保守序列區(qū)域反映了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變序列區(qū)域則能體現(xiàn)物種間的差異[11]。常用的V4或V3-V4可變區(qū)擴(kuò)增子測(cè)序或DGGE變性梯度凝膠電泳對(duì)于親緣關(guān)系較近的物種實(shí)際區(qū)分效果不太理想，qPCR較好的特異性彌補(bǔ)了二者的不足。（6）微生物含量豐富，只有不到十分之一的微生物實(shí)現(xiàn)了純培養(yǎng)，好多微生物菌種無(wú)法實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)，這局限了qPCR引物序列設(shè)計(jì)的特異性，好多菌種的qPCR使用的是該菌種的16S rDNA引物，可能會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，需要進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和完善原核生物功能基因qPCR引物，結(jié)合菌種功能基因代謝學(xué)機(jī)制闡釋工藝處理性能的變化；qPCR的應(yīng)用將微生物種類(lèi)變化、功能基因表達(dá)、微生物代謝組學(xué)研究、酶活分析等與工藝的運(yùn)行和調(diào)控有機(jī)的結(jié)合起來(lái)，為未來(lái)污水處理工藝的優(yōu)化提供微生物生長(zhǎng)方面的新指導(dǎo)。（7）活性污泥樣品qPCR對(duì)基因組模板的純度和質(zhì)量要求較高，選擇合適的基因組抽提方法，進(jìn)行有效的純化，對(duì)活性污泥qPCR結(jié)果準(zhǔn)確性的影響意義深遠(yuǎn)；qPCR自動(dòng)化抽提方法在環(huán)境領(lǐng)域的推廣應(yīng)用降低了對(duì)工科學(xué)生生物學(xué)知識(shí)和生物學(xué)技能的要求，使qPCR的檢測(cè)更加便捷、準(zhǔn)確。

2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在環(huán)境污水生物處理領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 在生物脫氮系統(tǒng)中對(duì)優(yōu)勢(shì)菌及功能基因的分析

亞硝酸鹽氧化菌（NOB）、氨氧化菌（AOB）、氨單加氧酶基因（amoA）、nirS（cd1型亞硝酸鹽還原酶基因）、nirK（Cu亞硝酸鹽還原酶基因）、norB（一氧化氮還原酶基因）和nosZ（氧化亞氮還原酶基因）等的數(shù)量和空間分布與微生物硝化反硝化過(guò)程息息相關(guān)，可作為調(diào)控污水脫氮工藝的參數(shù)，qPCR技術(shù)的出現(xiàn)解決了傳統(tǒng)方法步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、易污染等問(wèn)題，廣泛應(yīng)用于生物脫氮工藝微生物種群結(jié)構(gòu)和功能變化研究中。在工藝運(yùn)行性能的機(jī)制解釋方面，Abzazou T等使用gBlocks基因片段方法制備新DNA標(biāo)準(zhǔn)品用于qPCR，采用qPCR方法對(duì)兩個(gè)不同的污水處理廠總細(xì)菌、AOB、NOB含量進(jìn)行定量，結(jié)果表明，兩個(gè)污水處理廠微生物譜存在顯著差異，在營(yíng)養(yǎng)鹽去除的工廠中硝化細(xì)菌群落豐富，與工藝運(yùn)行性能一致[12]。在對(duì)氮的去除起到關(guān)鍵作用的反硝化功能基因的定量方面，LiuWenzhi等人，使用qPCR定量了反硝化菌群nirK和nirS基因的多樣性和豐度，結(jié)合環(huán)境因素及水的物理指標(biāo)，得出長(zhǎng)江湖泊主要受非生物因素的調(diào)控主導(dǎo)氮的去除，而非生物群落的多樣性和豐度[13]。此外，MirenMartínez-Santos等人使用qPCR技術(shù)定量反硝化功能基因 （nir：nirS+nirK），結(jié)合16S rRNA基因代謝結(jié)構(gòu)分析，揭示了硫化物驅(qū)動(dòng)的自養(yǎng)反硝化作用優(yōu)于異養(yǎng)反硝化作用，不完全異養(yǎng)反硝化作用對(duì)受處理和未經(jīng)處理的廢水表層沉積物的影響中占主導(dǎo)地位，處理過(guò)的和未經(jīng)處理的廢水排放改變了河流沉淀物中參與氮和硫循環(huán)的細(xì)菌群落[14]。為了有效地從低碳氮比的廢水中去除氮，Yang Yunlong等通過(guò)使用過(guò)的蘑菇堆肥水解物序批反應(yīng)器提高了氮的去除，qPCR對(duì)活性污泥中的功能基因包括amoA，nirS/K、norB和nosZ進(jìn)行定量，添加蘑菇堆肥水解物后其中大部分基因的表達(dá)升高，由此得出微生物的變化有利于污染物的去除和工藝的穩(wěn)定運(yùn)行[15]。在提高氮的去除率方面，Wang Xiaoyuan等人使用qPCR研究支流加入的有機(jī)質(zhì)負(fù)荷、BOD5/TN和NO2-N/NH4-N的比例通過(guò)厭氧氨氧化菌和反硝化反應(yīng)對(duì)結(jié)合態(tài)氮去除的影響研究，得出通過(guò)調(diào)控加入的支流量提高氮的去除率比較可行[16]。在限制含氮有機(jī)物排放方面，Castellano-Hinojosa A等在開(kāi)展一氧化二氮的排放與硝化脫氮原核生物種群動(dòng)力學(xué)關(guān)系的研究中，使用qPCR對(duì)西班牙南部四個(gè)全規(guī)模的污水處理廠活性污泥中氨氧化細(xì)菌AOB、氨氧化古菌AOA和N2O還原反硝化菌的含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AOA的含量與N2O的排放負(fù)相關(guān)，其不能對(duì)N2O生成產(chǎn)生突出的貢獻(xiàn)，活性污泥中NO3-和NO2-的含量越高AOB的數(shù)量越多[17]。

2.2 在生物除磷系統(tǒng)中對(duì)聚磷菌及聚合磷酸鹽激酶基因（PPK1）標(biāo)記的Accumulibacter各進(jìn)化分支的分析

污水處理的生物除磷系統(tǒng)主要通過(guò)磷酸鹽積累的聚磷菌（PAO）厭氧釋磷、好氧吸磷來(lái)實(shí)現(xiàn)，借助實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)可深入分析微生物的種類(lèi)和含量變化，結(jié)合微生物的代謝特性和功能基因的關(guān)鍵作用，有助于進(jìn)一步深入研究除磷機(jī)理、優(yōu)化除磷工藝。無(wú)論是主流工藝還是側(cè)流分支改進(jìn)工藝，qPCR對(duì)PAO及除磷能力標(biāo)記基因——編碼聚合磷酸鹽激酶的功能基因PPK1的研究從不同角度揭示了工藝除磷性能及運(yùn)行調(diào)控策略。主流的強(qiáng)化生物除磷（EBPR）能夠用于去除含磷濃度很高的廢水，Erik R.等采qPCR方法研究合成廢水和真正廢水培養(yǎng)馴化的全規(guī)模EBPR處理系統(tǒng)中微生物生態(tài)學(xué)特點(diǎn)，以合成廢水為基礎(chǔ)的MMC顯示了對(duì)PAO擴(kuò)增子檢測(cè)效果最好，引起了人們對(duì)使用合成底物開(kāi)展的EBPR研究潛在相關(guān)性的關(guān)注[18]。在側(cè)流工藝中，Md.Shahinoor Islam等利用創(chuàng)新的缺氧-需氧-厭氧側(cè)流處理系統(tǒng)從城市污水中去除生物磷，qPCR檢測(cè)磷酸鹽積累菌PAO豐度和多樣性較高，結(jié)合對(duì)細(xì)菌進(jìn)一步的分析表明，PAO種屬多樣性包括：CandidatusAccumulibacterphosphatis、Tetrasphaera、Rhodocyclus、脫氮聚磷菌（DPAO），研究選擇性強(qiáng)化磷去除比傳統(tǒng)的主流工藝具有優(yōu)勢(shì)[19]。在功能標(biāo)記基因PPK1的研究中，CandidatusAccumulibacter是污水生物除磷系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)聚磷菌，張麗敏等人采用編碼聚合磷酸鹽激酶的功能基因PPK1作為遺傳標(biāo)記，通過(guò)qPCR對(duì)9個(gè)污水處理廠共12個(gè)活性污泥樣品中Accumulibacter的進(jìn)化枝水平的豐度及其菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，得出每個(gè)樣品中Accumulibacter分支多樣化，均含有IIA、IIC、IID分支，生物除磷效果與Accumulibacter的群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，除磷效果不好可能和IID占總Accumulibacter比例較高有關(guān)[20]。此外，Zeng Wei等人采用改進(jìn)后的開(kāi)普敦大學(xué)（MUCT）工藝以低碳氮比（C/N）處理城市污水，采用PPK1作為遺傳標(biāo)記進(jìn)行qPCR檢測(cè)，得到總的 “CandidatusAccumulibacter”及其五個(gè)分支的種類(lèi)和含量，通過(guò)對(duì)五個(gè)分支在“CandidatusAccumulibacter”中的占比接近100%及各含量的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化與工藝性能之間響應(yīng)關(guān)系的分析，揭示亞硝酸鹽途徑反硝化除磷效果好的原因以及在處理碳源有限的廢水時(shí)亞硝酸鹽可作為合適的反硝化除磷的電子受體[21]。在脫氮除磷的混合廢水處理領(lǐng)域，Dobbeleers T等人研究了來(lái)自馬鈴薯工業(yè)厭氧預(yù)處理的好氧亞硝酸鹽顆粒廢水，qPCR分析表明微生物生長(zhǎng)緩慢，尤其是被厭氧處理模式所刺激的積累聚磷酸鹽的聚磷菌PAO，這就解釋了好氧亞硝酸鹽顆粒的除磷效率達(dá)到65.7%的原因，同時(shí)解釋了脫氮能力變化受PAOs生長(zhǎng)的影響[22]。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在環(huán)境污水生物處理領(lǐng)域的應(yīng)用

表1所列為國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口基因組提取試劑盒抽提的基因組濃度和質(zhì)量；其中國(guó)產(chǎn)試劑盒使用的是天根生化科技有限公司的土壤基因組DNA提取試劑盒、DP336，按照試劑盒的使用說(shuō)明抽提500 mg厭氧氨氧化反應(yīng)器活性污泥，設(shè)立A1、A2、A3三組平行；進(jìn)口試劑盒使用的是美國(guó)MP公司的Fast DNA Spin kit for soil、MP-116560，按照試劑盒的使用說(shuō)明抽提500 mg厭氧氨氧化反應(yīng)器活性污泥，設(shè)立B1、B2、B3三組平行。

表2所列為手動(dòng)抽提和自動(dòng)抽提基因組濃度和質(zhì)量；其中手動(dòng)抽提體系是500 mg城市污水處理廠氧化溝工藝濃縮池活性污泥，按照美國(guó)MP公司的Fast DNA Spin kit for soil、MP-116560試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，設(shè)立C1、C2、C3三組平行；自動(dòng)抽提的體系是350 mg城市污水處理廠氧化溝工藝濃縮池活性污泥+800 μL裂解液+100 μL洗脫液根據(jù)德國(guó)耶拿細(xì)菌基因組抽提試劑盒的操作步驟，使用德國(guó)耶拿InnuPure C16儀器中的DNAexteralLysisC1601程序進(jìn)行自動(dòng)抽提，設(shè)立D1、D2、D3三組平行。

表1 國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口基因組提取試劑盒抽提的基因組濃度和質(zhì)量

表2 手動(dòng)抽提和自動(dòng)抽提基因組濃度和質(zhì)量

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用在環(huán)境污水處理領(lǐng)域主要是絕對(duì)定量，實(shí)驗(yàn)流程包括：基因組的抽提、純化、引物的設(shè)計(jì)合成、標(biāo)準(zhǔn)品制備、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和樣品上機(jī)分析等，從各個(gè)流程根據(jù)環(huán)境活性污泥樣品的特點(diǎn)和研究的目標(biāo)現(xiàn)提供以下幾點(diǎn)應(yīng)用建議：（1）根據(jù)表1所示，對(duì)比國(guó)產(chǎn)試劑盒（天根生化科技有限公司的土壤基因組DNA提取試劑盒、DP336）和進(jìn)口試劑盒（美國(guó)MP公司的Fast DNA Spin kit for soil、MP-116560）的OD260/230、OD260/280、基因組濃度的平均值可知，進(jìn)口的試劑盒三者平均值皆高于國(guó)產(chǎn)試劑盒，說(shuō)明進(jìn)口試劑盒抽提的基因組濃度和質(zhì)量較高，進(jìn)口試劑盒成本雖略高于國(guó)產(chǎn)試劑盒，在條件允許的前提下，抽提基因組最好選擇進(jìn)口的試劑盒，以便滿足后續(xù)的qPCR實(shí)驗(yàn)對(duì)基因組質(zhì)量和濃度的要求。（2）表2中顯示了來(lái)源于城市污水處理廠氧化溝工藝濃縮池的活性污泥，使用手動(dòng)抽提和自動(dòng)抽提的方法測(cè)得最后的OD260/230、OD260/280、基因組濃度等數(shù)值，對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)自動(dòng)抽提的OD260/230、OD260/280平均值都高于手動(dòng)抽提的結(jié)果，說(shuō)明自動(dòng)抽提的基因組質(zhì)量較好；基因組濃度低于手動(dòng)抽提，這與實(shí)驗(yàn)前所用的污泥量較少和自動(dòng)體系抽提純化過(guò)程較嚴(yán)格損耗稍多有關(guān)，但是自動(dòng)抽提的基因組濃度能夠滿足qPCR分析；與此同時(shí)，自動(dòng)抽提基因組只需實(shí)驗(yàn)人員將樣品研磨充分后連同試劑盒一起裝機(jī)，選定好程序，歷時(shí)超過(guò)50 min，即可拿出抽提好的基因組，無(wú)需經(jīng)過(guò)純化步驟，抽提的濃度和質(zhì)量可應(yīng)用于qPCR實(shí)驗(yàn)；比手動(dòng)抽提耗時(shí)短、門(mén)檻要求低，對(duì)環(huán)境領(lǐng)域的工科學(xué)生具有較普遍的適用性。在未來(lái)環(huán)境實(shí)驗(yàn)室設(shè)備配置方面，可考慮自動(dòng)化的基因組抽提儀器，如德國(guó)耶拿InnuPure C16儀器。（3）qPCR對(duì)基因組質(zhì)量的要求較高，除了OD260/280、OD260/230數(shù)值方面的評(píng)估，實(shí)驗(yàn)前可設(shè)計(jì)特異性的引物，進(jìn)行普通的PCR，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳圖條帶是否明亮單一，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件體系，找到qPCR較好的退火溫度和延伸時(shí)間，降低qPCR預(yù)實(shí)驗(yàn)的成本，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。（4）標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法常規(guī)的有兩種：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品[23]和基因組純化產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品[24]，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品比較穩(wěn)定、制備復(fù)雜，基因組純化產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品制備簡(jiǎn)單、適用性有限，常見(jiàn)典型菌種的qPCR分析可使用基因組純化產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品，比如AOB、NOB、總細(xì)菌等。

4 結(jié)語(yǔ)

qPCR技術(shù)作為一種生物監(jiān)測(cè)方法越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于污水處理生物脫氮除磷領(lǐng)域微生物的檢測(cè)，未來(lái)的研究重點(diǎn)和方向是在qPCR技術(shù)對(duì)微生物種類(lèi)和豐度檢測(cè)的基礎(chǔ)上建立工藝運(yùn)行性能與微生物種群結(jié)構(gòu)變化之間的動(dòng)態(tài)響應(yīng)關(guān)系，為工藝的穩(wěn)定運(yùn)行及優(yōu)化調(diào)控提供指導(dǎo)。應(yīng)對(duì)的策略和發(fā)展趨勢(shì)是從qPCR技術(shù)前處理到上機(jī)及數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)，建立系統(tǒng)的操作規(guī)程，推廣應(yīng)用自動(dòng)化的基因組抽提體系，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作難度，使qPCR技術(shù)在環(huán)境污水處理領(lǐng)域得以推廣?；谖⑸锞N純培養(yǎng)及新引物設(shè)計(jì)的難題，qPCR技術(shù)主要適用于公開(kāi)發(fā)表文獻(xiàn)中報(bào)道的有引物的菌種或菌種的功能基因，解決和簡(jiǎn)化新菌種或功能基因引物序列設(shè)計(jì)的問(wèn)題，尋求合適的內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量，是未來(lái)qPCR技術(shù)得以推廣使用更好地為生物脫氮除磷工藝服務(wù)的努力新方向。