錢 潔，譚佳妮，程海波，沈衛(wèi)星，徐長(zhǎng)亮，劉陶世，孫東東*

1南京中醫(yī)藥大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心 國(guó)家中醫(yī)藥管理局名醫(yī)驗(yàn)方評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)研究室 江蘇省抗腫瘤驗(yàn)方研究與 產(chǎn)業(yè)化工程實(shí)驗(yàn)室；2南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；3江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210023

小檗堿(Berberine)是一種臨床上廣泛使用的天然藥物，屬于季銨型異喹啉類生物堿，其存在于很多中藥中[1-3]，常用于治療由細(xì)菌感染引起的胃腸道疾病。近年報(bào)道發(fā)現(xiàn)，小檗堿在體外具有抗腫瘤活性，其機(jī)制主要集中在抑制腫瘤細(xì)胞增殖和擴(kuò)散、干預(yù)細(xì)胞生長(zhǎng)周期、影響細(xì)胞能量代謝以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等[4]。乳腺癌作為主要在女性中發(fā)病的惡性腫瘤，小檗堿針對(duì)其顯示較好的藥效活性，但是小檗堿與乳腺癌治療相關(guān)的具體作用機(jī)制尚不明晰，亟需補(bǔ)充完善[5]。本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)研究小檗堿對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用，考察小檗堿對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，同時(shí)檢測(cè)腫瘤相關(guān)通路蛋白表達(dá)，為進(jìn)一步闡明小檗堿抗腫瘤機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

小檗堿購自美國(guó)sigma公司(貨號(hào)B3240)，純度為99%。3-MA購自MedChemExpress公司(貨號(hào)HY-19312)。精密稱取10 mg小檗堿粉末溶于二甲基亞砜(DMSO)中，超聲助溶，配制成母液，-20 ℃低溫儲(chǔ)存，臨用前再以培養(yǎng)基配成實(shí)驗(yàn)所需濃度試液，用0.22 μm的過濾器除菌，根據(jù)需求進(jìn)行濃度梯度稀釋。

1.2 細(xì)胞

MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞購自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，培養(yǎng)于含10% FBS，100 U/mL青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，倒置顯微鏡觀察生長(zhǎng)情況。細(xì)胞融合度約90%時(shí)用胰蛋白酶消化傳代或種板，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清(Capricorn scientific 公司，批號(hào)：1705124)；DMEM高糖培養(yǎng)基，胰蛋白酶溶液，青霉素-鏈霉素溶液(上海源培生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：F40403，K40410，E40401)；MTT，DMSO(Sigma公司，批號(hào)：SP1080、SHBH2446V)；細(xì)胞裂解液(Bio-sharp公司，批號(hào)：6503595)；Annexin V-FITC/PI雙染色流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(BD公司，批號(hào)：556547)；MDC法細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：20180109)；LC3A/B、Beclin 1、AKT、mTOR、p-AKT、p-mTOR、Bax、BCL-2及β-actin抗體(CST公司，批號(hào)：12741T、3495T、2920S、2938T、13038T、5536T、4970T)CPA225D萬分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；Pall 超純水系統(tǒng)(美國(guó)Pall公司)；SL16型低速離心機(jī)、FC型酶標(biāo)儀、HER Acell 150i 型二氧化碳培箱(美國(guó)Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；Tanon-5500型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀器(中國(guó)天能科技有限公司)；PowerPacTM Basic型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.4 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

采用MTT法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，PBS漂洗，胰蛋白酶消化后終止消化并離心，培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×105個(gè)/mL接種于96孔板，每孔100 μL，設(shè)5復(fù)孔。24 h細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的小檗堿(0、10、20、40、80、100 μM)，孵育24、48、72 h后，各孔加入 MTT(5 mg/mL)20 μL，孵育箱孵育4 h后棄去上清，每孔加DMSO 150 μL，避光震蕩10 min充分溶解沉淀后，酶標(biāo)儀560 nm處檢測(cè)吸光度。

公式如下：細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(OD對(duì)照組-OD給藥組)/OD對(duì)照組] ×100%。

1.5 觀察細(xì)胞形態(tài)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，調(diào)整濃度為1.0×106 cell /孔，培養(yǎng)箱中37 ℃，5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h，吸取上清，每孔加入2 mL含不同濃度小檗堿的培養(yǎng)基(3%血清，1%雙抗)，對(duì)照組加含 3%胎牛血清的培養(yǎng)基，孵育24 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.6 檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡率

分別用25、50、100 μM濃度的小檗堿處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組(DMSO，終濃度<0.05% (v/v))，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，胰酶消化后，收集細(xì)胞。用緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106 個(gè)/mL，吸取100 μL的細(xì)胞至試管中，加入Annexin V試劑和PI各5 μL，避光孵育15 min后，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 干預(yù)細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，胰酶消化后接種于6孔板中，調(diào)整濃度為1.0×106 cell /孔，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄上清，分別給予25、50、100 μM濃度的小檗堿刺激24 h。吸棄含藥上清，用Wash Buffer洗兩次，加入MDC染色工作液溫室避光孵育15～45 min后，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.8 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

分別用25、50、100 μM小檗堿處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組。用Western及IP裂解液裂解細(xì)胞，BCA試劑盒測(cè)定樣品蛋白含量，并變性。應(yīng)用8%～12% SDS-PAGE電泳后，采用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜方法，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入相應(yīng)的一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日，用PBST洗膜3次，再加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。ECL發(fā)光顯影、凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。利用應(yīng)用Gel Analysis軟件分析蛋白條帶光密度，并通過與相應(yīng)內(nèi)參β-actin條帶的密度做比較，測(cè)定樣品中目的蛋白的相對(duì)含量。

1.9 調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬相關(guān)通路蛋白表達(dá)

AKT-mTOR通路與細(xì)胞自噬密切相關(guān)，采用Western blot方法檢測(cè)小檗堿作用于MDA-MB-231細(xì)胞24 h后對(duì)AKT及mTOR蛋白磷酸化的影響。

1.10 自噬與AKT-mTOR通路相關(guān)機(jī)制的驗(yàn)證

在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，加入3 mM PI3K-AKT信號(hào)通路抑制劑3-Methyladenine (3-MA)后，再加入50 μM小檗堿，孵育24 h 后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。提取細(xì)胞蛋白，觀察加入3-MA后，小檗堿對(duì)細(xì)胞自噬及凋亡相關(guān)蛋白的影響。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 SPSS 12.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x±s) 表示，以P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小檗堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率的影響

MTT結(jié)果表明，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖受到不同程度的抑制，并與小檗堿的給藥劑量及時(shí)間成正相關(guān)。小檗堿對(duì)乳腺癌細(xì)胞在24、48、72 h的IC50值分別為:52.15 ± 3.87、49.28 ± 4.19和44.63 ± 3.26(見表1)。

表1 小檗堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率的影響

2.2 小檗堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)的影響

觀察結(jié)果顯示，正常的MDA-MB-231細(xì)胞呈梭形，伸展，貼壁。而小檗堿給藥組細(xì)胞呈現(xiàn)出不規(guī)則的形態(tài)，細(xì)胞膜明顯皺縮，細(xì)胞質(zhì)高度濃縮，細(xì)胞外出現(xiàn)類似碎片，細(xì)胞間距變大。隨著小檗堿給藥濃度的增加，細(xì)胞的貼壁能力明細(xì)下降(見圖1)。

圖1 小檗堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)的影響(20×)Fig.1 Effect of berberine on the morphology of MDA-MB-231 cells (20×)

2.3 小檗堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小檗堿給藥24 h后細(xì)胞的總凋亡率分別為21.4% ± 3.43% (25 μM)、31.2% ± 5.22% (50 μM)和80.6% ± 6.45% (100 μM)，與空白對(duì)照組(0.1% ± 0.1%)相比較，有顯著性差異(P< 0.05)，提示小檗堿具有明顯的誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用(見圖2)。

圖2 小檗堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of berberine on apoptosis of MDA-MB-231 cells

2.4 小檗堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞自噬的影響

MDC是自噬泡特異性的熒光標(biāo)記物，結(jié)果顯示，小檗堿各給藥組細(xì)胞內(nèi)MDC綠色熒光增強(qiáng)，且隨著處理濃度增加，熒光強(qiáng)度也逐漸增加。提示小檗堿可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬泡的形成(見圖3)。

圖3 小檗堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞自噬的影響(20×)Fig.3 Effect of berberine on autophagy of MDA-MB-231 cells (20×)

2.5 小檗堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

LC3蛋白存在LC3A及LC3B兩種形式，結(jié)果表明，當(dāng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞給予小檗堿后，細(xì)胞內(nèi)LC3A蛋白表達(dá)減少，而LC3B蛋白表達(dá)增多。隨著小檗堿給藥濃度的增加，LC3B/LC3A表達(dá)量比也增加。同時(shí)自噬正調(diào)節(jié)因子Beclin 1表達(dá)也呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)(見圖4)。

圖4 小檗堿對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of berberine on the expression of autophagy-related proteins in MDA-MB-231 cells

2.6 小檗堿對(duì)調(diào)節(jié)MDA-MB-231細(xì)胞自噬相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明，小檗堿抑制細(xì)胞內(nèi)

AKT和mTOR蛋白的磷酸化水平，p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR比值降低(見圖5)。

圖5 小檗堿對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of berberine on the regulation of protein expression in autophagy-associated pathway

2.7 3-MA對(duì)細(xì)胞增殖、自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

MTT結(jié)果表明，3-MA可抑制小檗堿給藥后出現(xiàn)的細(xì)胞活力降低的現(xiàn)象(圖 6A)；Western-blot結(jié)果顯示，3-MA顯著抑制了LC3B/LC3A比值增大的趨勢(shì)(圖 6B、C)，提示3-MA可抑制由小檗堿引起的細(xì)胞自噬的產(chǎn)生。此外，3-MA具有抑制小檗堿引起的凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)增高、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低的現(xiàn)象(圖 6D)。說明AKT介導(dǎo)的細(xì)胞自噬是小檗堿誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的原因之一。

圖6 3-MA對(duì)小檗堿引起的細(xì)胞自噬及凋亡的影響Fig.6 Effect of 3-MA on autophagy and apoptosis induced by berberine

3 討論

自噬是把雙刃劍，其與細(xì)胞凋亡在不同的條件下相互協(xié)調(diào)、相互影響，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著重要的調(diào)節(jié)作用[6]。在癌癥形成的早期階段，自噬具有抑制腫瘤增殖的作用。但同時(shí)，自噬也可使癌細(xì)胞適應(yīng)不利的代謝應(yīng)激(如缺氧、低營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)等)從而使腫瘤細(xì)胞存活[6-8]。因此，在癌癥早期，抗腫瘤藥通過激活細(xì)胞自噬可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。本實(shí)驗(yàn)通過MDC染色，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)小檗堿可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞自噬泡的形成。同時(shí)，Annexin V-PI染色結(jié)果顯示，小檗堿具有明顯的誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡作用,提示小檗堿可能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。

LC3和Beclin 1是自噬體經(jīng)典的標(biāo)志蛋白。LC3包括LC3A及LC3B兩種形式，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的LC3A會(huì)轉(zhuǎn)變成自噬體膜上的LC3B蛋白，從引起LC3B蛋白表達(dá)增加[9]。而Beclin 1是一個(gè)重要的抑癌蛋白，Beclin 1的單等位基因缺失會(huì)造成自發(fā)性癌癥發(fā)病率的提升[10]，本實(shí)驗(yàn)通過Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，給藥后的乳腺癌細(xì)胞中LC3B/LC3A蛋白表達(dá)的比值及自噬正調(diào)節(jié)因子Beclin 1的表達(dá)與小檗堿濃度成正相關(guān)，表明小檗堿可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞自噬的發(fā)生。AKT-mTOR (mammalian target of rapamycin)通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡的重要通路[11]，研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者存在mTOR蛋白過度激活的現(xiàn)象[12,13]。此外，mTOR是細(xì)胞自噬在啟動(dòng)過程中的關(guān)鍵靶點(diǎn)通路[14,15]，活化后可發(fā)揮抑制細(xì)胞自噬的作用。在本實(shí)驗(yàn)中，Western Blot結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞在給予不同濃度的小檗堿后，細(xì)胞內(nèi)AKT及mTOR蛋白的磷酸化水平受到不同程度的抑制，說明小檗堿通過抑制細(xì)胞中AKT-mTOR通路，從而發(fā)揮誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生自噬的作用。

課題組長(zhǎng)期以來對(duì)國(guó)醫(yī)大師周仲瑛臨床防治腫瘤的系列驗(yàn)方消癌解毒方開展研究，其中應(yīng)用于乳腺癌的方中主要有天葵子、八月札、白毛夏枯草、漏蘆、柴胡以及天冬等藥味，天葵子作為君藥，生物堿是其含有的一類主要成分[2]，且課題組在前期的實(shí)驗(yàn)也已從中分離得到小檗堿[3]。本研究表明，通過抑制AKT-mTOR通路，誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬以及凋亡過程，是小檗堿發(fā)揮體外抑制乳腺癌細(xì)胞增殖效應(yīng)的一個(gè)重要路徑，所以說實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步闡釋小檗堿的抗腫瘤分子機(jī)制提供了重要依據(jù)，同時(shí)為揭示抗腫瘤中藥天葵子的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，以及復(fù)方抗腫瘤的臨床應(yīng)用與轉(zhuǎn)化提供有效參考。