戴 昱，林秀萍，龐小艷，羅小衛(wèi)， Limbadri Salendra，楊 斌，王俊鋒，周雪峰，劉永宏,3*

1中國科學(xué)院南海海洋研究所廣東省海洋藥物重點實驗室，廣州 510301；2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 3南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣州 510275

紅樹林生態(tài)系統(tǒng)是一個廣泛分布于熱帶和亞熱帶的，由陸地到海洋過渡的特殊的潮間帶生態(tài)系統(tǒng),是四大海洋高生產(chǎn)力生態(tài)系統(tǒng)之一，全世界將近60%～70%的熱帶和亞熱帶海岸線都被紅樹林所覆蓋[1,2]。紅樹林作為一種特殊的植物群落，其獨特的環(huán)境孕育了豐富的微生物資源，而無論是種類還是分布范圍，在大西洋西岸，中國的紅樹林都具有代表性[3]。自從Cribb等[1]首次從紅樹根部分離到真菌后，對于紅樹林真菌的研究逐漸成為研究的熱點。目前已分離鑒定的紅樹林真菌超過200種,是海洋真菌的第二大生態(tài)群落[2,4]。

中山大學(xué)林永成課題組從不同紅樹植物秋茄內(nèi)生真菌中分離到了一系列新穎結(jié)構(gòu)：內(nèi)酯類，環(huán)肽類，呋喃香豆素類，異色酮類，氧雜蒽醌類，萜類，異黃酮類等化合物[5]。本課題組于2016年從一株秋茄內(nèi)生真菌葡萄座腔菌屬分離得到2個新的苯類衍生物[6]；2017年從一株秋茄內(nèi)生真菌擬盤多毛孢屬分離得到10個新的水楊酸衍生物[7]。為了從海洋微生物資源中尋找新穎的活性化合物，本課題組對采自深圳大亞灣紅樹植物秋茄中分離得到的一株內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究，分離得到14個化合物 (圖1)，分別為：對羥基苯甲醛 (1)，2-(4-羥苯基)乙醇 (2)，2-(4-羥苯基)乙酸乙酯 (3)，2-羥基-2-(4′-羥基苯基)乙醇 (4)，2-甲氧基-2-(4′-羥基苯基)乙醇 (5)，苯乙二醇 (6)，2-氨基-3-苯基-1-丙醇 (7)，對羥基苯乙酸甲酯 (8)，2-(2-羥基乙基)苯酚 (9)，3-chlorogentisyl alcohol (10)，4-hydroxymellein (11)，diaporthin (12)，環(huán)(L-苯丙-L-亮)二肽 (13)，環(huán)(D-苯丙-L-異亮)二肽 (14)。

圖1 化合物1～14的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of compounds 1-14

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

供試菌株是從一株分離于深圳大亞灣紅樹植物秋茄樹枝的內(nèi)生真菌菌株。將保藏于4 ℃的菌株接種到MB瓊脂固體平面培養(yǎng)基上，置于28 ℃ 培養(yǎng)箱中活化7天。然后接種到MB 種子培養(yǎng)液(麥芽提取物 15 g，海鹽 2.5 g，水 1 L，pH 7.4～7.8) 中，于28 ℃、178 rpm 條件下?lián)u床活化3天，最后接種至大米培養(yǎng)基(大米200 g，海鹽3 g，水200 mL)中，室溫下靜置發(fā)酵30天，共發(fā)酵 9.6 kg。

1.2 菌株鑒定

首先按照文獻(xiàn)[8]提取真菌菌體總DNA，并分別用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對總DNA中的ITS序列進(jìn)行PCR擴增并測序。其中，該菌株(accession number KcB3-2)與Colletotrichumgloeosporioidesisolate OMC3(NCBI GenBank accession number JF710554),Colletotrichumkahawaeisolate LS8(NCBI GenBank accession number KM520031)以及ColletotrichumignotumCol1(NCBI GenBank accession number JX515292)的相似度為99%，故鑒定為Colletotrichumsp.SCSIO KcB3-2，菌種保存于中國科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室。其ITS序列如下:

CTCTACACCCTTTGTGACATACCTATAACTGTT

GCTTCGGCGGGTAGGGTCTCCGTGACCCTCCCGGC

CTCCCGCCCCCGGGCGGGTCGGCGCCCGCCGGAG

GATAACCAAACTCTGATTTAACGACGTTTCTTCTGA

GTGGTACAAGCAAATAATCAAAACTTTTAACAACG

GATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCA

GCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAA

TTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACAGCTGATGTAGGCCCTCAAAGGTAGTGGCGGACCCTCCCGGAGCCTCCTTTGCGTAGTAACTTTACGTCTCGCACTGGGATCCGGAGGGACTCTTGCCGTAAAACCCCCCAATTTTCCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGTCGGAGGAA

1.3 主要儀器與試劑

主要儀器有:AV-500 和AV-700 超導(dǎo)核磁共振儀(德國Bruker 公司)、中壓制備色譜儀(Buchi 公司)、Hitachi Primade 高效液相色譜儀(日本日立公司)、ZYJ-S 型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本東京理化株式會社，EYELAN-1100V-W 型)等;主要試劑有薄層色譜及柱色譜用硅膠(青島海洋化工廠)、分析純化學(xué)試劑(廣州化學(xué)試劑廠和天津富宇精細(xì)化工有限公司)等。

1.4 提取與分離

將固體發(fā)酵培養(yǎng)物切成小塊，加入等體積丙酮，充分?jǐn)嚢?，超聲提?5 min，再浸泡過夜。經(jīng)減壓過濾后，濾液減壓蒸餾至無有機溶劑，水相溶液用乙酸乙酯萃取3遍，蒸干乙酸乙酯相得浸膏；濾渣用乙酸乙酯提取5遍，乙酸乙酯溶液再經(jīng)減壓濃縮得浸膏，合并兩者得粗浸膏；將其分散到甲醇中，然后用石油醚萃取3次，去除石油醚相得到甲醇相，減壓蒸餾最終得總浸膏73.4 g。浸膏用100～200目硅膠拌樣，經(jīng)中壓柱色譜(200～300目硅膠)分離 (二氯甲烷/甲醇100∶0～0∶100)梯度洗脫后經(jīng)TLC分析合并得14個流份。Fr.5經(jīng)ODS中壓反相柱色譜(甲醇/水 10%∶90%～100%∶0)分離得10個子流份，其中Fr.5-5使用半制備HPLC(甲醇/水 30%∶70%，流速 2.5 mL/min)分離得到化合物1(1.9 mg)；Fr.5-7經(jīng)半制備HPLC(甲醇/水 33%∶67%，流速 2.5 mL/min)分離得到化合物8(4.7 mg)，11(11.0 mg)；Fr.5-8經(jīng)半制備HPLC(甲醇/水 38%∶62%)分離得到化合物3(21.9 mg)。Fr.7經(jīng)ODS中壓反相柱色譜 (甲醇/水 10%∶90%～100%∶0)分離得12個子流份,其中Fr.7-3使用半制備HPLC(甲醇/水 17%∶83%，流速 3.0 mL/min)分離得到化合物2(56.8 mg)、5(13.8 mg)、6(33.2 mg)；Fr.7-4使用半制備HPLC(甲醇/水 24%∶76%，流速 2.5 mL/min)分離得到化合物7(11.8 mg)；Fr.7-4使用半制備HPLC(乙腈/水 25%∶75%，流速 3.0 mL/min)分離得到化合物13(3.5 mg)，14(2.5 mg)。Fr.10經(jīng)ODS中壓反相柱色譜 (甲醇/水 10%∶90%～100%∶0，流速 2.5 mL/min) 分離得8個子流份,其中Fr.10-3使用半制備HPLC(甲醇/水 33%∶67%，流速 2.5 mL/min)分離得到化合物12(7.6 mg)。Fr.11經(jīng)ODS中壓反相柱色譜 (甲醇/水 10%∶90%～100%∶0) 分離得14個子流份,其中Fr.11-10使用半制備HPLC(乙腈/水 30%∶70%，流速 2.5 mL/min)分離得到化合物4(3.1 mg)。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無色油狀物;1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:9.71 (1H,s,H-1),7.76 (2H,d,J=9.1 Hz,H-2′,6′),6.87 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3′,5′);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:192.6 (s,C-1),168.1 (s,C-4′),133.6 (d,C-2′,6′),128.9 (s,C-1′),117.6 (d,C-3′,5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]報道基本一致，故鑒定該化合物為對羥基苯甲醛。

化合物2紅棕色針狀晶體(甲醇)；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:7.05 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2′,6′),6.75(2H,d,J=9.1 Hz,H-3′,5′),3.72 (2H,t,J=7.0 Hz,H-1),2.75 (2H,t,J=7.0 Hz,H-2);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:156.6 (s,C-4′),131.0 (d,C-2′,6′),130.8 (d,C-3′,5′),116.1 (s,C-1′),64.5 (t,C-2),19.2 (t,C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-(4-羥苯基)乙醇。

化合物3無色油狀物；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.06 (2H,d,J=8.5 Hz,H-4,8),6.74 (2H,d,J=8.5 Hz,H-5,7),4.22 (2H,t,J=7.0 Hz,H-1),2.84 (2H,t,J=7.0 Hz,H-2),2.01 (3H,s,H-10);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:173.0 (s,C-9),157.1 (s,C-6),130.9 (d,C-4,8),129.9 (s,C-3),116.2 (d,C-5,7),66.6 (t,C-1),35.2 (t,C-2),20.8 (q,C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-(4-羥苯基)乙酸乙酯。

化合物4無色無定型粉末；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:7.26 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2′，6′),6.81 (2H,d,J=9.1 Hz,H-3′,5′),4.61 (1H,m,H-2),3.96 (1H,m,H-1b),3.69 (1H,m,H-1a);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:158.5 (s,C-4′),130.3 (d,C-2′,6′),128.5 (d,C-3′,5′) ,116.2 (s,C-1′),78.6 (d,C-2),73.7 (t,C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-羥基-2-(4′-羥基苯基)乙醇。

化合物5無色無定型粉末；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.13 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2′，6′),6.78 (2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),4.17 (1H,m,H-2),3.63 (1H,m,H-1b),3.51 (1H,m,H-1a),3.22 (3H,s,2-OCH3);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:158.4 (s,C-4′),130.8 (s,C-1′),129.3 (d,C-2′,6′),116.2 (d,C-3′,5′),85.9 (d,C-2),67.7 (t,C-1),56.8 (q,2-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12,13]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-甲氧基-2-(4′-羥基苯基)乙醇。

化合物6無色針狀晶體(甲醇)；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.40 (2H,d,J=7.0 Hz,H-2,6),7.36 (2H,m,H-3,5),7.29 (1H,m,H-4),4.72 (1H,dd,J=5.0,7.5 Hz,H-7),3.64 (2H,m,H-8);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:143.2 (s,C-1),129.2 (d,C-3,5),128.5 (s,C-4),127.4 (d,C-2,6),75.9 (d,C-7),68.7 (t,C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報道基本一致，故鑒定該化合物為苯乙二醇。

化合物7棕色油狀物；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.40 (2H,m,H-6,8),7.36 (2H,m,H-5,9),7.21 (1H,t,J=7.0 Hz,H-7),3.86 (1H,quint,J=6.0 Hz,H-2),3.54 (2H,m,H-1),2.87 (2H,m,H-3);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:140.1 (s,C-4),130.4 (d,C-6,8),129.3 (d,C-5,9),127.1 (s,C-7),74.5 (d,C-2),66.6 (t,C-1),41.0 (t,C-3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-氨基-3-苯基-1-丙醇。

化合物8黃色油狀物；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:7.10 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),6.75 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),3.68 (3H,s,H-9),3.54 (2H,s,H-7 );13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:174.6 (s,C-8),157.6 (s,C-4),131.3 (d,C-2,6),126.3 (s,C-1),116.3 (d,C-3,5),52.4 (q,C-9),40.9 (t,C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報道基本一致，故鑒定該化合物為對羥基苯乙酸甲酯。

化合物9黃色油狀物；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:7.07 (1H,dd,J=1.4,7.7 Hz,H-5),7.03 (1H,td,J=1.4,7.7 Hz,H-3),6.75 (1H,m,H-6),6.74 (1H,m,H-4),3.75 (2H,t,J=7.0 Hz,H-8),2.84 (2H,t,J=7.0 Hz,H-7);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:156.7 (s,C-1)，131.9 (d,C-3),128.5 (d,C-5),126.6 (s,C-2),120.5 (d,C-4),116.1 (C-6),63.2 (t,C-8),35.1 (t,C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報道基本一致，故鑒定該化合物為2-(2-羥基乙基)苯酚。

化合物10紅色無定型粉末；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:6.74 (1H,d,J=2.5 Hz,H-6 ),6.69 (2H,d,J=2.5 Hz,H-4),4.63 (2H,s,H-7);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:151.6 (s,C-2),144.3 (s,C-5),131.9 (s,C-3),121.9 (s,C-1),115.5 (d,C-4),114.6 (d,C-6),61.2 (d,C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報道基本一致，故鑒定該化合物為3-Chlorogentisyl alcohol。

化合物11無色針狀晶體(甲醇)；1H NMR (500 MHz,CD3OD)δ:7.58 (1H,t,J=8.0 Hz,H-6),7.08 (1H,d,J=7.5 Hz,H-5),6.94 (1H,t,J=8.5 Hz,H-7),4.56 (1H,m,H-3),4.55 (1H,m,H-4),1.47 (3H,d,J=6.0 Hz,3-CH3);13C NMR (125 MHz,CD3OD)δ:170.2 (s,C-1),162.9 (s,C-8),144.1 (s,C-4a),137.8 (d,C-6),117.8 (d,C-7),117.7 (d,C-5),108.0 (s,C-8a),81.6 (d,C-3),69.5 (d,C-4),18.2 (q,3-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報道基本一致，故鑒定該化合物為4-Hydroxymellein。

化合物12白色針狀晶體(甲醇)；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:6.45 (1H,d,J=2.1 Hz,H-7),6.33 (1H,d,J=2.1 Hz,H-4),6.28 (1H,s,H-5),4.19 (1H,m,H-10),3.90 (3H,s,H-12),2.58 (2H,m,H-9),1.57 (3H,d,J=6.3 Hz,H-11);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:168.7 (s,C-1),165.1 (s,C-6),162.6 (s,C-8),156.4 (s,C-3),143.6 (s,C-4a),106.5 (d,C-4),104.8 (d,C-5),101.1 (d,C-7),100.5 (s,C-8a),66.2 (d,C-10),56.2 (q,C-12),43.8 (t,C-9),23.3 (q,C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報道基本一致，故鑒定該化合物為Diaporthin。

化合物13黃色無定型粉末；1H NMR (700 MHz,CD3OD)δ:7.33 (2H,m,Phe-H-3′,5′),7.29 (1H,t,J=7.0 Hz,Phe-H-4′),7.22 (2H,d,J=7.0 Hz,Phe-H-2′,6′),4.33 (1H,t,J=4.9 Hz,Phe-H-2),3.69 (1H,m,Leu-H-2),3.32(1H,dd,J=4.2,14.0 Hz,Phe-H-3a),2.98 (1H,m,Phe-H-3b),1.46 (1H,m,Leu-H-4),0.89 (1H,m,Leu-H-3a),0.76 (3H,d,J=6.3 Hz,Leu-H-5),0.71 (3H,d,J=6.3 Hz,Leu-H-6),0.07 (1H,m,H-3b);13C NMR (175 MHz,CD3OD)δ:170.6 (s,Leu-C-1),168.9 (s,Phe-C-1),136.7 (s,Phe-C-1′),131.8 (d,Phe-C-2′,6′),129.6 (d,Phe-C-3′,5′),128.5 (d,Phe-C-4′),57.4 (d,Phe-C-2),54.1 (d,Leu-C-2),45.2 (t,Leu-C-3),40.2 (t,Phe-C-3),24.6 (d,Leu-C-4),23.4 (q,Leu-C-5),21.4 (q,Leu-C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)(L-苯丙-L-亮)二肽。

化合物14無色針狀晶體(甲醇)；1H NMR (700 MHz,CD3Cl)δ:7.36 (2H,t,J=7.7 Hz,Phe-H-3′,5′),7.30 (1H,t,J=7.7 Hz,Phe-H-4′),7.23 (2H,d,J=7.0 Hz,Phe-H-2′,6′),5.91 (1H,s,Phe-NH),5.79 (1H,s,Ile -NH),4.25 (1H,m,Phe-H-2),3.93 (1H,m,Ile-H-2),3.45 (1H,dd,J=3.5,7.0 Hz,Phe-H-3a),2.92 (1H,dd,J=2.8,7.0 Hz,Phe-H-3a),2.03 (1H,m,Ile-H-3),1.30 (1H,m,Ile-H-4a),1.10 (1H,m,Ile-H-4b),0.99 (3H,d,J=7.0 Hz,Ile-H-6),0.90 (3H,m,Ile-H-5) ;13C NMR (175 MHz,CD3Cl)δ:167.1 (s,Phe-C-1),166.7 (s,Ile-C-1),135.5 (s,Phe-C-1′),129.7 (d,Phe-C-3′,5′),129.3 (d,Phe-C-2′,6′),127.7 (d,Phe-C-4′),60.2 (d,Phe-C-2),56.2 (d,Ile-C-2),40.5 (t,Phe-C-3),38.2 (d,Ile-C-3),23.7 (t,Ile-C-4),15.4 (q,Ile-C-6),11.9 (q,Ile-C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報道基本一致，故鑒定該化合物為環(huán)(D-苯丙-L-異亮)二肽。

化合物1～14的核磁及其它相關(guān)詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費下載( www.trcw.ac.cn)。

3 結(jié)論

此次研究從紅樹植物秋茄內(nèi)生真菌Colletotrichumsp.SCSIO KcB3-2的次級代謝產(chǎn)物中共分離得到14個次級代謝產(chǎn)物，包括苯環(huán)衍生物(1～12)和環(huán)二肽類化合物(13～14)，3～14均為首次從紅樹植物秋茄內(nèi)生真菌中分離得到。文獻(xiàn)報道顯示3-chlorogentisyl alcohol(10)對耐甲氧西林以及多藥耐藥Staphylococcusaureus(MRSA，MDRSA)具有顯著的抗菌活性，其MIC(最低抑菌濃度)為12.5 μM，并且表現(xiàn)了顯著的抗氧化活性(DPPH 自由基清除能力)，其IC50值為7.0 μM[18]。4-hydroxymellein(11)對Cladosporiumcladosporioides，C.sphaerospermum和S.aureus表現(xiàn)了一定的抑菌活性，其MIC值分別為 5.00,10.0,8.0 μg/mL[23,24]。真菌是紅樹林微生物資源多樣性的主要類群，也是海洋天然產(chǎn)物以及新藥研發(fā)的重要源泉。本研究豐富了紅樹植物內(nèi)生真菌化學(xué)多樣性，為進(jìn)一步對紅樹林內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物研究提供了參考。