劉路寬, 楊開(kāi)廣, 梁 振, 張麗華*, 張玉奎

(1. 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國(guó)科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 大連理工大學(xué), 精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116024)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是從原發(fā)腫瘤組織脫落并侵襲進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細(xì)胞。CTCs能夠通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至其他組織上并發(fā)展為轉(zhuǎn)移灶,這是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑之一[1]。研究表明,血液中CTCs的數(shù)量與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),因此在臨床中可用于腫瘤的早期診斷,以及監(jiān)測(cè)患者的療效和復(fù)發(fā)情況[2]。同時(shí),由于CTCs攜帶原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶信息,因此深入分析CTCs中的蛋白質(zhì)、核酸等信息可以指導(dǎo)腫瘤患者用藥,檢測(cè)抗藥性,以及調(diào)整治療方案等[3]。因此,實(shí)現(xiàn)對(duì)血液中CTCs的捕獲與檢測(cè)具有十分重要的生物學(xué)和臨床意義。然而,CTCs不僅在血液中含量極少,而且受血細(xì)胞等干擾極其嚴(yán)重,因此實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的高選擇性捕獲極具挑戰(zhàn)[4,5]。

為了有效捕獲血液中的CTCs,現(xiàn)有方法從原理上可以分為3類:基于CTCs和血細(xì)胞尺寸、密度等差異的生物物理方法;依靠抗體與CTCs細(xì)胞表面抗原特異性親和的生物親和方法;模擬抗體-抗原原理的人工抗體方法。本文對(duì)上述方法進(jìn)行了綜述,并從捕獲效率、捕獲純度和釋放活性保持等方面進(jìn)行了討論。此外,還對(duì)CTCs捕獲方法的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

圖 1 (a)微濾膜、(b)微濾芯片、(c)基于慣性聚焦技術(shù)的具有迷宮結(jié)構(gòu)的微流控芯片和 (d)基于聲波技術(shù)的微通道用于捕獲CTCs的示意圖[7,8,12,21]Fig. 1 Schematic diagrams of (a) microfiltration membrane, (b) microfiltration chip, (c) microfluidic chip with labyrinth structure based on inertial focusing technology and (d) microchannels based on acoustic technology for capturing (circulating tumor cells) CTCs[7,8,12,21] WBCs: white blood cells; RBCs: red blood cells; IDTs: interdigital transducer electrodes.

1 基于生物物理原理的CTCs捕獲方法

基于生物物理原理的捕獲方法是指利用CTCs與其他細(xì)胞在大小、密度、質(zhì)量、電極性和聲感性等的差異,采用過(guò)濾、離心、電泳、慣性聚焦、聲波等方式實(shí)現(xiàn)分離。由于該方法不依賴于細(xì)胞表面的特異性抗原,被稱為“無(wú)標(biāo)記”方法。根據(jù)不同的生物物理性質(zhì),常用的方法主要可以分為以下幾種。

1.1 基于尺寸的捕獲

CTCs捕獲的最大干擾成分是紅細(xì)胞和白細(xì)胞等血細(xì)胞。紅細(xì)胞的直徑約為7.0～8.5 μm;白細(xì)胞的直徑約為5.2～13.2 μm。一般來(lái)講,CTCs的尺寸比血細(xì)胞大,例如乳腺癌細(xì)胞的直徑約為13.1 μm;結(jié)直腸癌和前列腺癌細(xì)胞的直徑約為11 μm;黑素瘤細(xì)胞的直徑約為9～19 μm[6]。因此,采用微過(guò)濾技術(shù),通過(guò)精確設(shè)定濾膜的孔徑,能夠?yàn)V過(guò)血細(xì)胞,而將CTCs捕獲。目前過(guò)濾膜的加工方式主要包括徑跡刻蝕技術(shù)和光刻影印技術(shù)。徑跡刻蝕技術(shù)是通過(guò)正電荷轟擊或化學(xué)刻蝕在聚碳酸酯膜上獲得直徑約為8 μm的孔。然而,該方法獲得的孔徑尺寸大小和分布不均勻,會(huì)導(dǎo)致膜孔堵塞和樣品損失。針對(duì)此問(wèn)題,Zheng等[7]采用光刻影印技術(shù)研制了一種新型的過(guò)濾膜(見(jiàn)圖1a)。該膜的孔徑為10 μm,孔徑大小和分布均勻,CTCs的捕獲效率達(dá)到90%。被捕獲的細(xì)胞可被無(wú)損釋放,并用于后續(xù)基因組分析。此外,為了特異性捕獲成簇出現(xiàn)的CTCs, Sarioglu等[8]近期發(fā)展了一種基于微流控技術(shù)的三維微過(guò)濾芯片。如圖1b所示,單獨(dú)的CTCs能夠從2個(gè)三角形柱中間通過(guò),而成簇的CTCs則被三角形柱截留。

雖然基于細(xì)胞尺寸大小的CTCs捕獲方法操作方便,對(duì)細(xì)胞損傷小,有利于后續(xù)分析,但是CTCs和白細(xì)胞在尺寸上存在交叉,容易造成部分白細(xì)胞被截留,捕獲純度(<10%)有待提高[5]。

1.2 基于密度的捕獲

血液中血漿的密度為1.03 g/mL,紅細(xì)胞的密度為1.10～1.15 g/mL,白細(xì)胞的密度為1.07～1.09 g/mL, CTCs的密度為1.7 g/mL[9]。Rosenberg等[10]采用密度梯度離心方式成功獲得CTCs。然而基于密度的捕獲方法很難消除白細(xì)胞的干擾,獲得的CTCs純度常常不足1%[5]。因此,常常作為過(guò)濾或抗體親和等其他捕獲方法的初步富集方法。

1.3 基于動(dòng)力學(xué)的捕獲

CTCs和白細(xì)胞大小和密度不同，導(dǎo)致其在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中具有不同的慣性,質(zhì)量相近的細(xì)胞可以通過(guò)慣性作用發(fā)生聚焦。因此可以通過(guò)設(shè)計(jì)微流控通道的尺寸、形狀,以及控制細(xì)胞流速等方式實(shí)現(xiàn)分離[11]。如圖1c所示,細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)中受到的剪切梯度升力將其引導(dǎo)至通道壁,而壁效應(yīng)升力又使細(xì)胞遠(yuǎn)離通道壁。通過(guò)優(yōu)化慣性升力與迪安流之間的平衡,細(xì)胞能夠在具有彎曲通道的微流控裝置的層流中遷移。該方法的通量可以達(dá)到2.5 mL/min,捕獲效率達(dá)到90%。獲得的細(xì)胞懸液中,干擾白細(xì)胞的濃度為600個(gè)/mL[12]。雖然該方法對(duì)細(xì)胞的影響較小,捕獲效率和純度較高,但是由于同一腫瘤患者CTCs的異質(zhì)性和不同腫瘤患者CTCs之間的明顯差異,需要對(duì)通道進(jìn)行個(gè)性化設(shè)計(jì)。

1.4 基于電極性的捕獲

細(xì)胞可被看成一種電中性但能被極化的電介質(zhì)粒子[13]。不同表型、生理狀態(tài)和形態(tài)的細(xì)胞在電場(chǎng)中產(chǎn)生大小和方向均不同的偶極矩。當(dāng)CTCs和血細(xì)胞處于空間不均勻的電場(chǎng)中時(shí),二者受到的電動(dòng)力不同,通過(guò)電旋轉(zhuǎn)或雙向電泳等方式可實(shí)現(xiàn)CTCs的捕獲[14]。該方法在整個(gè)捕獲過(guò)程中無(wú)物理接觸或摩擦,保持了細(xì)胞活性,得到的細(xì)胞可以后續(xù)培養(yǎng)和分析[15]。然而該系統(tǒng)對(duì)CTCs的回收率有待提高[16,17]。

1.5 基于聲感性的捕獲

最新研究表明,以超聲成像時(shí)采用的超聲波強(qiáng)度與頻率分離獲得的細(xì)胞,能夠保持良好的活性、功能和基因表達(dá)信息[18]。因此,將超聲波引入CTCs的捕獲與分離極具潛力[19,20]。如圖1d所示,當(dāng)兩股聲波相遇時(shí),二者之間會(huì)形成駐波。駐波維持在微通道內(nèi)的固定位置,產(chǎn)生壓力節(jié)點(diǎn)。CTCs和血細(xì)胞之間大小、密度等屬性的差異使二者形成不同的移動(dòng)距離。因此,通過(guò)優(yōu)化通道和聲波的強(qiáng)度及頻率,可以實(shí)現(xiàn)CTCs和血細(xì)胞的分離[21]。結(jié)果表明,該方法對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞和乳腺癌MCF-7細(xì)胞的回收率在83%以上。利用聲波分離細(xì)胞是一種相對(duì)溫和的方法,能夠最大程度保持CTCs的原始狀態(tài)、表型和基因型,然而該方法受環(huán)境因素影響較大,且通量有待提高。

綜上所述,基于生物物理性質(zhì)的CTCs捕獲方法不依賴其表面抗原,最大程度降低了對(duì)細(xì)胞的損傷,可以為后續(xù)分析提供活性樣本。然而CTCs和白細(xì)胞等血細(xì)胞在生物物理性質(zhì)上具有一定重疊度,因此獲得的CTCs純度有待進(jìn)一步提高。

2 基于生物親和原理的CTCs捕獲方法

CTCs具有腫瘤細(xì)胞的特征和組織來(lái)源標(biāo)志物,如上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)、細(xì)胞角蛋白質(zhì)(CK)、癌胚抗原(CEA)和前列腺抗原(PSA)等[22]?；谏镉H和原理的CTCs捕獲方法是將上述標(biāo)志物的抗體固載于基質(zhì)材料表面,基于抗體與標(biāo)志物之間的特異性結(jié)合,實(shí)現(xiàn)CTCs的分離與捕獲。由于基質(zhì)材料的表面為抗體與細(xì)胞的結(jié)合提供微環(huán)境,因此對(duì)CTCs的捕獲具有一定影響。目前,基于生物親和原理的基質(zhì)材料主要包括磁珠、微流控芯片和具有微納米結(jié)構(gòu)的材料等[23]。

2.1 基于免疫磁珠的捕獲

免疫磁珠法是目前使用最廣泛且最成熟的CTCs捕獲方法。通過(guò)將帶有羧基、氨基、生物素等修飾的Anti-EpCAM抗體與相對(duì)應(yīng)帶有氨基、羧基、親和素等修飾的磁球進(jìn)行耦合反應(yīng),形成對(duì)CTCs具有特異性捕獲能力的免疫磁珠。基于免疫磁珠的CellSearch?系統(tǒng)是第一個(gè)獲得了臨床驗(yàn)證的CTCs檢測(cè)系統(tǒng)。該系統(tǒng)在外磁場(chǎng)存在時(shí),通過(guò)免疫磁珠捕獲細(xì)胞后,可以對(duì)CTCs進(jìn)行免疫熒光鑒定并計(jì)數(shù)[24,25]。由于患者血液中的CTCs數(shù)量會(huì)隨著病情和治療情況發(fā)生變化,因此CellSearch?系統(tǒng)能夠用于監(jiān)測(cè)腫瘤患者病情,為其預(yù)后和確定治療方案提供依據(jù)。但是,CellSearch?系統(tǒng)獲得的CTCs難以無(wú)損釋放。為解決該問(wèn)題,研究人員開(kāi)發(fā)了一種MagSweeper系統(tǒng)[26]。該系統(tǒng)利用磁性棒捕獲CTCs與免疫磁珠的復(fù)合物,并利用磁性棒運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的切變力洗脫血細(xì)胞,最后通過(guò)去除電磁場(chǎng)得到CTCs與免疫磁珠的復(fù)合物。利用該技術(shù),研究人員構(gòu)建了能夠收集前列腺癌患者血液中的CTCs,并進(jìn)行外顯子組測(cè)序和模塊化分析的新技術(shù)平臺(tái)。

2.2 基于免疫微流控芯片的捕獲

圖 2 (a)CTC-Chip、(b)HB-Chip、(c)CTC-iChip和(d)金納米顆粒修飾的HB-Chip用于捕獲CTCs的示意圖[31,34,36,38]Fig. 2 Schematic diagrams of (a) CTC-Chip, (b) HB-Chip, (c) CTC-iChip and (d) gold nanoparticle-modified HB-Chip for capturing CTCs[31,34,36,38] PLTs: platelets; AuNPs: gold nanoparticles; PDMS: polydimethylsiloxane; NHS: N-hydroxysuccinimide; GSH: glutathione; EpCAM: epithelial cell adhesion molecule.

微流控芯片是通過(guò)微加工技術(shù),在硅片、玻璃、聚二甲基硅氧烷等材料上制備得到的具有微米級(jí)結(jié)構(gòu)和特定功能的小型化、自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。微流控芯片尺寸和細(xì)胞尺寸匹配,因此近年來(lái)被成功用于捕獲CTCs[27-30]，其基本策略是在芯片內(nèi)部的微通道或微結(jié)構(gòu)上修飾能夠與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體,當(dāng)血液流經(jīng)微通道時(shí),CTCs會(huì)被抗體特異性結(jié)合在芯片內(nèi)部通道或結(jié)構(gòu)上。被捕獲的CTCs可以直接在芯片內(nèi)進(jìn)行計(jì)數(shù)與檢測(cè),也可以洗脫后收集進(jìn)行后續(xù)分析。主流的免疫微流控芯片技術(shù)大致可以分為3個(gè)發(fā)展階段。2007年,Nagrath等[31]設(shè)計(jì)了第一代用于CTCs捕獲的微流控裝置(CTC-Chip)。如圖2a所示,該芯片由78 000個(gè)表面經(jīng)過(guò)抗體修飾的微柱組成。通過(guò)優(yōu)化微柱的尺寸和排列以及液體的流速和流向,細(xì)胞與抗體微柱的接觸概率與黏附能力增強(qiáng),但是得到的CTCs的純度僅為50%。為進(jìn)一步降低白細(xì)胞的干擾,研究人員通過(guò)優(yōu)化CTC-Chip芯片中微柱的幾何組合,并引入流體動(dòng)力學(xué)色譜方法,制備了幾何增強(qiáng)差異型免疫捕獲芯片[32]。通過(guò)尺寸篩選,進(jìn)一步降低了白細(xì)胞的干擾;該芯片捕獲到的同一臨床樣本中CTCs的數(shù)量是CellSearch?系統(tǒng)的2～400倍[33]?；诳贵w修飾微柱的微流控芯片雖然提高了對(duì)CTCs的捕獲效率,但是難以用于較大規(guī)模的臨床研究。因此在CTC-Chip的基礎(chǔ)上,Stott等[34]開(kāi)發(fā)了第二代基于小室流動(dòng)槽的微流控芯片(HB-Chip)。如圖2b所示,該微流控芯片由人字形交叉溝槽結(jié)構(gòu)組成。血液樣本在流經(jīng)芯片時(shí)會(huì)形成微漩渦,增加了細(xì)胞與芯片表面抗體的接觸機(jī)會(huì),提高了CTCs的捕獲效率和樣品處理通量。結(jié)果表明,HB-Chip對(duì)CTCs的捕獲能力可以達(dá)到90%。Yu等[35]采用HB-Chip芯片對(duì)乳腺癌患者CTCs在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變過(guò)程中的特征進(jìn)行了分析。近期,Karabacak等[36]將免疫磁珠和微流體分選技術(shù)整合于微流控芯片中,成為第三代免疫微流控芯片(CTC-iChip),其原理見(jiàn)圖2c。首先利用鵝卵形微柱去除CTCs和白細(xì)胞之外的其他血液成分;其次利用正弦通道結(jié)構(gòu)使細(xì)胞魚(yú)貫通過(guò),實(shí)現(xiàn)精確和快速的分選;最后,被免疫磁珠捕獲的CTCs,通過(guò)磁場(chǎng)分選,實(shí)現(xiàn)了CTCs的捕獲。該芯片的處理速度可以達(dá)到每秒一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,對(duì)CTCs的回收率可以達(dá)到80%以上,因此臨床應(yīng)用性更強(qiáng)。Nanus等[37]采用CTC-iChip對(duì)前列腺癌患者的CTCs在單細(xì)胞水平上進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析。結(jié)果表明,只有1/6的CTCs會(huì)共表達(dá)一種以上的雄激素受體剪接變異體,顛覆了以往對(duì)CTCs同時(shí)表達(dá)多種變異體的認(rèn)知。

雖然上述技術(shù)可以成功地捕獲和檢測(cè)CTCs,但細(xì)胞被捕獲在芯片表面,難以釋放。為了解決該問(wèn)題,如圖2d所示,Park等[38]將金納米顆粒引入HB-Chip中,利用谷胱甘肽破壞巰基和金納米顆粒之間的相互作用,實(shí)現(xiàn)了CTCs的釋放。另外,由于在芯片中引入了納米顆粒,芯片表面具有更大的比表面積,從而利于修飾更多的抗體,以提高捕獲效率。

圖 3 (a)具有微/納米棒陣列的電子聚合物、(b)具有納米森林的穿刺針、(c)三維氧化石墨烯水凝膠、(d)氧化石墨烯修飾花形 微流控芯片、(e)硅納米柱修飾人字形通道微流控芯片和(f)溫敏性修飾芯片用于CTCs捕獲的示意圖[42,43,45-48]Fig. 3 Schematic diagrams of (a) electronic polymer with micro/nano rod array, (b) puncture needle with nanopolymers, (c) three-dimensional graphene oxide hydrogel, (d) graphene oxide modified and flower-patterned microfluidic chip, (e) silicon nanonanopillar-modified herringbone microfluidic chip and (f) temperature sensitivity chip for capturing CTCs[42,43,45-48] NIR: near infrared; NSCLC: non-small cell lung cancer.

2.3 基于抗體修飾的具有微納米結(jié)構(gòu)材料的捕獲

作為人工細(xì)胞外基質(zhì),微納米結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附、細(xì)胞組織形成、細(xì)胞與基質(zhì)和細(xì)胞之間相互作用、細(xì)胞增殖分化以及天然細(xì)胞外基質(zhì)的形成[39-41]。因此,結(jié)合生物親和與微納米結(jié)構(gòu)既有利于提高抗體的接枝量,又有利于增加細(xì)胞與材料表面的接觸概率,進(jìn)而提高CTCs的捕獲與分離能力。

如圖3a所示,Hsiao等[42]在生物電子聚合物表面構(gòu)建了微/納米棒陣列;通過(guò)優(yōu)化結(jié)構(gòu)的尺寸和表面特性,并經(jīng)進(jìn)一步修飾抗體,成功應(yīng)用于CTCs的捕獲,捕獲效率超過(guò)70%。為進(jìn)一步提高捕獲效率,研究人員在穿刺導(dǎo)線表面修飾大量納米材料后,將Anti-EpCAM抗體修飾在材料表面(見(jiàn)圖3b)。當(dāng)含有穿刺導(dǎo)線的穿刺針插入患者體內(nèi)后,利用人體的血液循環(huán),在30 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)CTCs的體內(nèi)捕獲[43]。該技術(shù)已被成功用于乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌患者的CTCs檢測(cè)[44]。

石墨烯材料由于具有高比表面積和良好的生物兼容性,在生物傳感、藥物載體等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。近年來(lái),研究人員構(gòu)建了多種石墨烯材料,并用于捕獲CTCs。如圖3c所示,Li等[45]將石墨烯摻雜在水凝膠中,制備了抗體修飾的三維氧化石墨烯聚合物水凝膠。不僅能夠?qū)崿F(xiàn)CTCs的捕獲,而且還能夠通過(guò)近紅外激光的刺激使石墨烯吸收熱量,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)CTCs的釋放。

雖然具有微納米結(jié)構(gòu)的材料在CTCs捕獲方面表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能,但上述方法一般采用靜態(tài)孵育使CTCs與抗體結(jié)合。近期,研究人員進(jìn)一步將該材料與微流控芯片結(jié)合起來(lái)。如圖3d所示,Wang等[46]將硅納米柱與人字形微流控芯片相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了對(duì)乳腺癌患者CTCs的捕獲與分離。其中,硅納米柱具有較大的比表面積與粗糙度,有利于提高抗體的固載量,并促進(jìn)CTCs的黏附;人字形結(jié)構(gòu)使血液在芯片內(nèi)形成渦流,有利于提高CTCs與硅納米柱表面抗體的接觸概率,從而提高捕獲效率。氧化石墨烯芯片也被開(kāi)發(fā)出來(lái)用于CTCs的捕獲。這種簡(jiǎn)化的表面捕獲裝置結(jié)構(gòu)更適合大規(guī)模生產(chǎn)并可以在更高流速下使用。如圖3e所示,氧化石墨烯芯片主要由58 957個(gè)花形圖案的金表面及有Anti-EpCAM抗體修飾的氧化石墨烯納米片組成。該圖案化的金表面有利于促進(jìn)CTCs捕獲,而對(duì)非靶細(xì)胞的捕獲效率小于10%[47]。利用該芯片,從轉(zhuǎn)移性乳腺癌、胰腺癌和早期肺癌患者中成功分離出CTCs。為了進(jìn)一步解決CTCs釋放的問(wèn)題,Ke等[48]和Rahong等[49]將抗體修飾的溫敏性納米纖維引入微流控芯片,通過(guò)控制溫度變化實(shí)現(xiàn)捕獲與釋放CTCs。如圖3f所示,在37 ℃時(shí),血液通過(guò)芯片聚合物刷收縮,CTCs被黏附在納米纖維表面,捕獲效率介于40%～90%之間;當(dāng)溫度降至4 ℃時(shí),聚合物刷舒展將被捕獲的CTCs釋放。該芯片有望用于監(jiān)控腫瘤預(yù)后,指導(dǎo)腫瘤治療。

綜上所述,相較于基于生物物理原理的捕獲技術(shù),特異性靶向CTCs的生物親和方法均能得到較高的捕獲純度,但是由于CTCs在血液中經(jīng)歷上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程,抗原性丟失,導(dǎo)致得到的CTCs樣本出現(xiàn)假陰性。此外,由于抗體與細(xì)胞結(jié)合常數(shù)過(guò)高,會(huì)增加CTCs無(wú)損釋放的難度。

3 基于人工抗體的CTCs捕獲方法

人工抗體是通過(guò)模擬抗體-抗原相互作用機(jī)理,以分子識(shí)別為基礎(chǔ)、能夠與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合的人工合成材料,包括適配體、特異性多肽和分子印跡材料[50],其既具有與抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合常數(shù),又具有成本低、穩(wěn)定性好、易化學(xué)合成和修飾等優(yōu)勢(shì),已在小分子藥物、環(huán)境污染物、多肽和蛋白質(zhì)識(shí)別與分離中得到廣泛應(yīng)用。雖然人工抗體在CTCs捕獲方面尚處于起步階段,但是已經(jīng)顯示出良好的應(yīng)用前景。

3.1 基于適配體的捕獲

適配體是人工合成與篩選的能夠與靶標(biāo)分子高特異性和高親和力結(jié)合的單鏈DNA或者RNA寡核苷酸。在CTCs捕獲領(lǐng)域常使用的適配體包括兩類。一類是基于細(xì)胞表面特異性表達(dá)的抗原篩選的適配體。主要針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和EpCAM等常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物。如Wan等[51]將與EGFR結(jié)合的適配體引至微流控裝置中。當(dāng)CTCs細(xì)胞液流經(jīng)通道時(shí),可對(duì)其高特異性的捕獲，再利用RNA互補(bǔ)鏈實(shí)現(xiàn)被捕獲細(xì)胞的釋放及下游分析。另一類是基于完整細(xì)胞篩選的適配體[52,53]。該類適配體不依賴細(xì)胞表面的某一種特定標(biāo)志物,以整個(gè)細(xì)胞為靶標(biāo)進(jìn)行篩選,能夠在一定程度上避免基于細(xì)胞表面標(biāo)志物篩選到的適配體帶來(lái)的假陰性鑒定結(jié)果,具有更為廣泛的應(yīng)用前景。

圖 4 (a)適配體功能化微流控芯片、(b)TD05適配體修飾的硅納米線、(c)多種適配體修飾的二維氧化石墨烯膜、(d)適配體修飾的 條碼顆粒、(e)特異性多肽修飾的納米磁球和(f)表面修飾有抗體的細(xì)胞印跡材料用于捕獲CTCs的示意圖[55-59,63]Fig. 4 Schematic diagrams of (a) aptamer-functionalized microfluidic chip, (b) TD05 aptamer modified silicon nanowire, (c) multiple aptamer modified two-dimensional graphene oxide film, (d) aptamer-modified barcode particles, (e) peptide-modified magnetic nanoparticles and (f) cell-imprinted material with antibody modification for capturing CTCs[55-59,63] SiNWAs: silicon nanowire arrays. TD05 aptamer: RAMOS cell-specific aptamer.

基于適配體的CTCs捕獲方法主要將適配體固定在基質(zhì)材料表面上,以實(shí)現(xiàn)CTCs的特異性分離。目前常用的基質(zhì)材料為微流控芯片和具有微納米結(jié)構(gòu)的材料。Liu等[54]將人急性白血病T淋巴細(xì)胞的適配體Sgc8修飾在微流控芯片通道上,實(shí)現(xiàn)了靶細(xì)胞的高效捕獲。Sheng等[55]對(duì)微流控芯片進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì),如圖4a所示,成功實(shí)現(xiàn)了血液中CTCs的捕獲,而且捕獲到的靶細(xì)胞中93%仍具有活性,可以用于后續(xù)的分析與表征。相較于陣列型微納米結(jié)構(gòu),納米線或納米纖維具有更高的比表面積和粗糙度。如圖4b所示,Xue等[56]采用表面引發(fā)的單電子轉(zhuǎn)移自由基聚合和點(diǎn)擊化學(xué)方法,在硅納米線表面修飾了N-丙烯?；咸烟前泛蛯?duì)人B淋巴細(xì)胞瘤RAMOS細(xì)胞具有特異性親和能力的TD05適配體,利用二者的協(xié)同作用,實(shí)現(xiàn)了CTCs的高效捕獲。如圖4c所示,Viraka Nellore等[57]采用旋轉(zhuǎn)涂膜技術(shù),制備了孔徑在20～40 μm的多孔氧化石墨烯膜。將分別對(duì)人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(HER2)、前列腺特異膜抗原和癌胚抗原具有特異性親和能力的S6、A9和YJ-1適配體修飾在氧化石墨烯表面,血細(xì)胞能夠被過(guò)濾,而CTCs被適配體捕獲于表面,捕獲效率可以達(dá)到95%。為了同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種類型CTCs的捕獲與檢測(cè),Zheng等[58]開(kāi)發(fā)了一種能夠捕獲、檢測(cè)和釋放多種類型CTCs的新型條碼顆粒。如圖4d所示,該顆粒由球形膠體晶體簇組成,其表面修飾有支化放大的適配體探針。該顆粒的編碼區(qū)具有特異性的反射峰,能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)CTCs的捕獲與檢測(cè)。但是該方法對(duì)靶細(xì)胞的捕獲效率和選擇性易受納米顆粒非特異性吸附影響。

綜上所述,結(jié)合適配體和微納米結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì),開(kāi)發(fā)新型的適配體功能化的微納米材料在CTCs捕獲中具有十分重要的應(yīng)用前景。

3.2 基于特異性多肽的捕獲

特異性多肽是人工篩選得到的對(duì)目標(biāo)分子具有特異性結(jié)合能力的肽段。因?yàn)榈鞍追肿幼R(shí)別過(guò)程主要由接觸界面處的多肽參與,所以特異性多肽在配體-受體和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中起關(guān)鍵作用。如圖4e所示,Bai等[59]將對(duì)EpCAM具有特異性識(shí)別能力的多肽修飾在磁珠表面,成功實(shí)現(xiàn)了EpCAM陽(yáng)性CTCs的捕獲,捕獲效率達(dá)到90%,捕獲純度超過(guò)93%。Peng等[60]采用相同的方法將對(duì)HER2具有特異性識(shí)別能力的多肽修飾在磁珠表面,成功實(shí)現(xiàn)了HER2陽(yáng)性CTCs的捕獲。目前,特異性多肽的結(jié)合力與抗體相比仍較低,結(jié)合常數(shù)約為抗體的10%,如能進(jìn)一步提高多肽與CTCs的結(jié)合力,基于特異性多肽的CTCs捕獲技術(shù)將會(huì)有更廣闊的應(yīng)用前景。

3.3 基于分子印跡的捕獲

分子印跡技術(shù)是一項(xiàng)以目標(biāo)分子為模板的人工抗體制備技術(shù)。該人工抗體具有能夠與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的印跡位點(diǎn),具有廣泛的適用性和可定制性。分子印跡技術(shù)最初用于小分子分離,現(xiàn)已擴(kuò)展至復(fù)雜體系中蛋白質(zhì)的純化、髙豐度蛋白質(zhì)的去除，以及病毒和細(xì)菌的分離鑒定[61,62]。

由于CTCs較常見(jiàn)的小分子和蛋白質(zhì)尺寸更大,結(jié)構(gòu)更復(fù)雜,利用印跡技術(shù)對(duì)其進(jìn)行捕獲,需要考慮更多因素,例如細(xì)胞大小、形狀、穩(wěn)定性和活性等;靶標(biāo)細(xì)胞表面的復(fù)雜度使特異性結(jié)合分子的篩選面臨挑戰(zhàn);靶標(biāo)細(xì)胞的脆弱性導(dǎo)致其溫和釋放較為困難。因此針對(duì)CTCs的細(xì)胞印跡技術(shù)研究鮮有報(bào)道。

如圖4f所示,Lv等[63]制備了表面修飾有抗體的細(xì)胞印跡材料,成功實(shí)現(xiàn)了血液中CTCs的特異性捕獲與檢測(cè),然而對(duì)CTCs的捕獲效率僅不足40%。本課題組通過(guò)設(shè)計(jì)細(xì)胞印跡位點(diǎn)的形狀與結(jié)構(gòu),得到了空間結(jié)構(gòu)、形貌和化學(xué)性質(zhì)與細(xì)胞表面更為匹配的細(xì)胞印跡材料,對(duì)CTCs的捕獲效率提高至70%[64]。盡管細(xì)胞印跡材料在CTCs捕獲中的應(yīng)用較少,但是作為一種融合形狀匹配和化學(xué)識(shí)別的親和技術(shù),分子印跡技術(shù)的通用性更強(qiáng),在CTCs捕獲的研究中具有十分重要的應(yīng)用前景。

綜上所述,近幾十年來(lái),研究人員開(kāi)發(fā)了多種CTCs捕獲方法(見(jiàn)表1),并成功實(shí)現(xiàn)了血液中CTCs的捕獲和鑒定,發(fā)現(xiàn)CTCs的數(shù)量與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后密切相關(guān)。

表 1 常見(jiàn)的CTCs捕獲方法Table 1 Common CTCs capture methods

+ The levels of each capture characteristic in different CTCs capture methods; -: no data.

4 結(jié)論與展望

作為腫瘤診療的有效途徑之一,研究人員不斷深入研究CTCs的分子特征、生物功能以及臨床應(yīng)用等,進(jìn)而對(duì)CTCs捕獲方法提出了更高的要求。因此,未來(lái)的CTCs捕獲方法需同時(shí)滿足更高的捕獲效率、選擇性和回收率,從而保證后續(xù)分析具有充足的樣本;需保證被捕獲細(xì)胞能夠無(wú)損釋放,從而用于后續(xù)細(xì)胞活性和藥敏性評(píng)價(jià);需具有通用性,從而降低臨床應(yīng)用的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。隨著現(xiàn)代分離分析技術(shù)的發(fā)展和對(duì)CTCs認(rèn)識(shí)的不斷深入,CTCs分離和捕獲的特異性將不斷提高,特別是捕獲、釋放和檢測(cè)分析一體化方法的建立,將有助于推動(dòng)CTCs從基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。