何義娟, 李克麗, 李 倩, 張 鵬, 艾 萍, 袁黎明

(云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 昆明 650500)

手性是自然界中真實而普遍存在的現(xiàn)象,是自然界的基本屬性[1],手性問題涉及農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、材料、食品等諸多領(lǐng)域[2,3]。手性藥物雖有相同的理化性質(zhì),但生物活性和藥理作用等方面卻存在差異,甚至表現(xiàn)出截然相反的效果[4]。例如,左旋巴比妥酸鹽抑制神經(jīng)活動,而右旋巴比妥酸鹽卻興奮神經(jīng);右旋甲狀腺素鈉可降低血脂,而左旋甲狀腺素鈉對心臟有毒副作用[5]。由于手性分子生物活性不同,所以手性分離分析就顯得十分重要[6]。

界面聚合法是高分子制備中的一種常用方法,分別將兩種高活性的單體分散在互不相溶的兩相中[7],兩種單體在兩相的界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)而生成高分子。常用的活性單體如多元胺、多元醇和多元酚等常溶于水相,多元酰氯和多元異氰酸酯等常溶于有機(油)相。在膜科學(xué)及技術(shù)領(lǐng)域,界面聚合法也是反滲透和納濾等聚合物分離膜的實驗室以及工業(yè)級制備的最主要方法,尤其是以哌嗪或者間苯二胺為單體、多元酰氯或者多元異氰酸酯為交聯(lián)劑制備的復(fù)合膜由于膜性能十分優(yōu)良而在生產(chǎn)實際中廣泛使用[8-11]。

大環(huán)抗生素類化合物[12]的相對分子質(zhì)量大約在660～2 200 Da之間,分子中包括親水基團、疏水基團和眾多的可解離基團,其分子具有一定空間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和多個手性活性中心,能與手性客體分子發(fā)生多種作用,如π-π作用、包合作用、氫鍵之間作用、偶極-偶極相互作用、疏水作用、空間位阻作用等[13,14]。自1994年Armstrong等[15]首次用大環(huán)抗生素作為手性選擇劑應(yīng)用于HPLC以來,相繼報道了替考拉寧、利福霉素B、硫鏈絲菌素、去甲萬古霉素、瑞斯托菌素A等作為液相色譜手性固定相[16-18]。

目前已有文獻[19,20]報道將萬古霉素和替考拉寧通過共價鍵鍵合在硅膠基質(zhì)上制備色譜手性固定相。本文以萬古霉素和替考拉寧為手性選擇劑,哌嗪為單體,4,4′-二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)、1,6-己二異氰酸酯(HDI)和2,4-甲苯二異氰酸酯(TDI)為交聯(lián)劑,通過界面聚合反應(yīng)形成網(wǎng)狀層包裹硅膠載體,制得6種高效液相色譜手性固定相,用于分離外消旋化合物,并與MDI直接交聯(lián)萬古霉素和替考拉寧在硅膠表面所得固定相進行了分離性能的比較。研究還同時考察了色譜條件對手性色譜柱分離性能的影響。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

高效液相色譜儀配有P1201紫外檢測器、P1201恒流泵、ZW1201色譜柱溫箱和EC-2006型色譜工作站(大連依利特分析儀器有限公司);純水器(英國ELGA Lab Water公司); As3120超聲波清洗儀(天津Autoscience公司); 250 mm×2.0 mm型不銹鋼液相色譜空柱(美國Alltech公司);掃描電鏡(荷蘭FEI Quanta 200公司);液相色譜勻漿法裝柱機(美國Alltech公司)。

替考拉寧(純度≥90%)購于孝感深遠化工有限公司;萬古霉素(純度≥90%)購于蘇州法母進出口有限公司;MDI(純度97%)購于日本TCI公司;HDI(純度99%)購于美國Alfa Aesar公司;TDI(純度98%)購于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;哌嗪(純度99%)購于上海Adamas-beta公司;球型硅膠YQG80(青島美高化工有限公司);正己烷、異丙醇、無水乙醇、甲醇、乙腈購于天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,所有試劑均為分析純。所用的外消旋化合物:氧氟沙星、1,2-二苯基乙二醇、扁桃酸、D,L-苯丙氨酸、反-1,2-二苯基環(huán)氧乙烷、3-芐氧基-1,2-丙二醇、特羅格爾堿、D,L-組氨酸、1-(9-蒽基)-2,2,2-三氟乙醇、華法林、馬來酸氯苯那敏、阿替洛爾、美托洛爾、氨氯地平、氟比洛芬、吡喹酮、萘普生購于美國Fluka公司,純度均≥99%; D,L-天冬氨酸、D,L-丙氨酸、1,2-二苯基乙醇酮、二氫黃酮、D,L-精氨酸、D,L-絲氨酸、D,L-賴氨酸、D,L-對羥基苯甘氨酸、D,L-脯氨酸、D,L-亮氨酸、D,L-苯甘氨酸、D,L-半胱氨酸購于美國Sigma-Aldrich試劑公司,純度均≥99%;聯(lián)糠醛、布洛芬、鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、1,1′-聯(lián)-2-萘酚、3,5-二硝基苯甲?；?DNB)-亮氨酸、鹽酸普萘洛爾、1-對氯苯基乙醇、D,L-纈氨酸、佐匹克隆、硫酸特布他林、奧美拉唑、酮洛芬、四米唑均購于比利時Acros公司,純度均≥99%。

1.2 手性固定相的制備

界面聚合反應(yīng)受很多因素的影響,例如手性選擇劑和單體以及交聯(lián)的量、兩相溶劑的種類、化學(xué)反應(yīng)時間和溫度等。通過大量的界面聚合反應(yīng)、成膜現(xiàn)象觀察、膜的穩(wěn)定性和機械強度試驗,篩選出以下手性固定相制備的“網(wǎng)包法”或交聯(lián)法,具體實驗步驟如下。

1.2.1替考拉寧手性固定相的制備

稱取2.0 g替考拉寧和1.0 g哌嗪于50 mL容量瓶中配制成水溶液,并滴加2 mL三乙胺。稱取3.0 g硅膠于燒杯中,加入上述配制的水溶液,浸泡一段時間后將多余的液體除去,室溫下晾干;稱取1.0 g MDI于50 mL容量瓶中,配制成正己烷有機溶液,待硅膠剛好晾干,加入一定量配制好的MDI正己烷溶液,浸泡1 h。倒出多余液體,于110 ℃烘箱中熱處理15 min,即制得CSP-A。圖1是“網(wǎng)包法”制備CSP-A的原理示意圖。

在界面聚合法制備高分子復(fù)合膜中哌嗪是最經(jīng)典的反應(yīng)單體之一。由于手性劑萬古霉素和替考拉寧分子結(jié)構(gòu)中伯胺數(shù)量較少,為了在硅膠表面聚合一層性能穩(wěn)定的高分子膜使萬古霉素或者替考拉寧能牢固地固載在硅膠的表面,因此在圖1的反應(yīng)中加入了哌嗪單體參加界面聚合反應(yīng)。

同時運用上述方法以HDI作為交聯(lián)單體制得CSP-C;以TDI作為交聯(lián)單體制得CSP-E;另外,采用直接交聯(lián)法制得CSP-G,其制備過程與CSP-A相似,但水溶液中沒有加入哌嗪。

圖 1 “網(wǎng)包法”制備替考拉寧-4,4′-二苯基甲烷二異氰酸酯的示意圖Fig. 1 Schematic representation of the preparation of teicoplanin-4,4′-diphenyl-methane-diisocyanate chiral stationary (MDI) by wrapping with a netT: backbone of teicoplanin; RT: room temperature; R: alkyl.

1.2.2萬古霉素手性固定相的制備

“網(wǎng)包法”萬古霉素手性固定相的制備過程和1.2.1節(jié)過程相似,均采用萬古霉素作為手性識別劑,其中MDI作為交聯(lián)單體制得CSP-B; HDI作為交聯(lián)單體制得CSP-D; TDI作為交聯(lián)單體制得CSP-F。與此同時,采用直接交聯(lián)法制得CSP-H,其制備過程與CSP-B相似,但水溶液中沒有加入哌嗪。

1.3 手性柱的填裝

液相色譜柱的填裝采用高壓勻漿法,稱取2.0 g制備好的手性固定相倒入23 mL正己烷溶液,懸浮均勻,快速倒進勻漿罐中。用正己烷∶異丙醇=(9∶1, v/v)為頂替液,在40～50 MPa壓力下裝柱5 min,然后將壓力調(diào)至25 MPa,保持30 min,緩慢減至常壓,然后安裝好篩板和柱頭即可。

1.4 色譜條件

流動相分別為正己烷∶異丙醇=9∶1(v/v)、乙腈∶水=6∶4(v/v)、甲醇∶水=6∶4(v/v)、甲醇∶水=2∶8(v/v)、無水乙醇、高純水和甲醇;流速為0.1 mL/min;檢測波長為254 nm或230 nm;柱溫為25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性固定相的掃描電鏡表征

為了觀察6種手性固定相在硅膠表面的固載情況,取一定量的純硅膠和6種手性固定相進行掃描電鏡表征,如圖2所示,a～g分別是純硅膠、CSP-A、CSP-B、CSP-C、CSP-D、CSP-E和CSP-F的掃描電鏡圖。通過圖2a與圖2b～2g對比可知,聚合后的硅膠表面上附著高分子聚合物,表明成功制備了6種手性固定相。圖2a和2d中的數(shù)值分別表示純硅膠和固定相C的直徑,隨機選取了形貌較好的硅膠進行標(biāo)注。

2.2 手性固定相的紅外表征

為了觀察6種手性固定相有沒有發(fā)生界面聚合反應(yīng),分別取一定量的純硅膠和6種手性固定相進行傅里葉紅外光譜法測定,其結(jié)果如圖3所示。圖3中1～7分別為純硅膠、CSP-A、CSP-B、CSP-C、CSP-D、CSP-E和CSP-F的紅外譜圖。可以看出相比圖中純硅膠的紅外譜圖,曲線2～7在1 631～1 645 cm-1處的峰是脲基中的C=O的伸縮振動吸收峰或是締合酰胺羰基的伸縮振動峰；2 833 cm-1處的峰是亞甲基、次甲基的CH鍵伸縮振動譜帶,手性選擇劑與交聯(lián)劑發(fā)生了反應(yīng),有聚合物生成。在2 200 cm-1處無吸收峰,說明異氰酸根N=C=O已經(jīng)完全反應(yīng)完。通過紅外表征,說明手性選擇劑與交聯(lián)劑發(fā)生了界面聚合反應(yīng),并且在反應(yīng)過程中異氰酸酯都反應(yīng)完全。

圖 2 純硅膠和6種手性固定相的掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electronic microscopy (SEM) images of the pure silica gel and six chiral stationary phasesa. pure silica gel; b. CSP-A; c. CSP-B; d. CSP-C; e. CSP-D; f. CSP-E; g. CSP-F.

圖 3 6種手性固定相與純硅膠的紅外對比圖Fig. 3 IR spectra comparison of the six chiral stationary phases and pure silica gel 1. pure silica gel; 2. CSP-A; 3. CSP-B; 4. CSP-C; 5. CSP-D; 6. CSP-E; 7. CSP-F.

2.3 手性柱的手性拆分能力

為了考察10種手性柱對外消旋化合物的手性分離能力,在一定的色譜條件下,對一系列手性化合物進行了拆分研究。表1是外消旋化合物的拆分?jǐn)?shù)據(jù),圖4是部分手性化合物的拆分譜圖,試驗結(jié)果表明,制備的8種手性柱對手性化合物都具有一定的拆分能力,并與商品柱(Chirobiotic T和Chirobiotic V)具有互補性。

在表1中,實驗室自制的8根手性柱從CSP-A至CSP-H,均分別以正己烷∶異丙醇=9∶1(v/v)、乙腈∶水=6∶4(v/v)、甲醇∶水=6∶4(v/v)、無水乙醇、高純水為流動相,而對于兩根商品柱則采用公司推薦的流動相甲醇∶水=2∶8(v/v)和甲醇。從表1中可以看出,“網(wǎng)包法”制備的萬古霉素手性柱CSP-B、CSP-D、CSP-F分別能拆分18、10、7對外消旋體,交聯(lián)法制備的萬古霉素手性柱CSP-H能拆分9對外消旋體,萬古霉素商品柱Chirobiotic V僅拆分了4對外消旋體,因此“網(wǎng)包法”制備的手性柱明顯優(yōu)于交聯(lián)柱,而交聯(lián)柱又明顯優(yōu)于商品柱。另外,“網(wǎng)包法”制備的替考拉寧手性柱CSP-A、CSP-C、CSP-E分別能拆分10、14、9對外消旋體,交聯(lián)法制備的替考拉寧手性柱CSP-G能拆分9對外消旋體,替考拉寧商品柱Chirobiotic T能拆分開24對外消旋體,明顯地替考拉寧商品柱優(yōu)于自制網(wǎng)包柱和交聯(lián)柱,而網(wǎng)包柱又好于交聯(lián)柱。但從表1中又可見,有11對商品柱Chirobiotic T不能拆分的外消旋體,利用自制的替考拉寧柱卻又能被拆分開,因此這些柱彼此之間具有很好的互補性。

圖4是每種手性柱分別選取的一個代表性的色譜分離譜圖,從圖中可見商品柱的柱效明顯高于網(wǎng)包柱和交聯(lián)柱。產(chǎn)生的原因一方面是因為采用的界面聚合法在硅膠表面包裹了一層高分子,使球形硅球表面形狀有所改變,一定程度影響了分離柱效。另一方面可能是因為在硅膠表面引入了更多的極性基團,導(dǎo)致手性識別過程中的可逆性作用變差。除此之外,柱效還與待拆分的具體手性樣品的性能相關(guān),在報道的很多利用鍵合臂制備的手性固定相如Pirkle、環(huán)糊精、配體交換手性柱中,也有較多的低柱效柱。尤其是現(xiàn)在研究和應(yīng)用范圍最廣的多糖型手性固定相,其柱效也不高。但不管怎樣,“網(wǎng)包法”制備色譜柱還可有更多的條件和參數(shù)有待優(yōu)化、其選擇性和柱效還有較大的提升空間,進一步的研究正在進行中。

表 1 手性樣品在10種手性柱上的拆分結(jié)果Table 1 Resolution results of the chiral samples on the ten chiral columns

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

k1′: retention factor;α: separation factor;Rs: resolution; -: not separated. The mobile phases are: (a)N-hexane∶isopropanol=9∶1 (v/v); (b) acetonitrile∶water=6∶4 (v/v); (c) methanol∶water=6∶4 (v/v); (d) methanol∶water=2∶8 (v/v); (e) absolute ethanol; (f) high purity water; (g) methanol.

圖 4 10種手性柱對代表性化合物的拆分譜圖Fig. 4 Resolution spectra of typical compounds using the ten chiral columns

2.4 不同流動相對手性柱分離外消旋化合物的影響

不同流動相對手性柱分離外消旋化合物具有不同程度的影響,圖5顯示了不同的流動相在萬古霉素-MDI柱上拆分氧氟沙星、1-(9-蒽基)-2,2,2-三氟乙醇、氨氯地平、D,L-苯丙氨酸的色譜圖。在高純水作為流動相時這些化合物都有不同程度的分離,甚至D,L-苯丙氨酸在高純水流動相下分離效果更好,表現(xiàn)出了這些柱子作為全水手性色譜柱的潛力。

2.5 流速和進樣量對手性柱分離外消旋化合物的影響

圖6a和6b分別為流速和進樣量對萬古霉素-MDI手性柱分離外消旋化合物的影響。隨著流動相流速的增加,分離效果逐漸變差。隨著進樣量的增加,兩個對映異構(gòu)體的峰面積和峰高增加,出峰的保留時間變化不大,但峰變寬,分離度有所下降。

圖 5 不同流動相在萬古霉素-4,4′-二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)柱上的色譜圖Fig. 5 Chromatograms obtained using the vancomycin-MDI column with different mobile phases a. ofloxacin; b. 1-(9-fluorenyl)-2,2,2-trifluoroethanol; c. amlodipine; d. D,L-phenylalanine. Injection volume: 2 μL; flow rate: 0.1 mL/min; column temperature: 25 ℃; UV detection wavelength: 254 nm. Mobile phase for line 1 in (a)-(d): high purity water; mobile phase for line 2 in (a): N-hexane∶isopropanol=9∶1 (v/v); mobile phase for line 2 in (b)-(d): acetonitrile∶water=6∶4 (v/v).

圖 6 萬古霉素-MDI手性柱分離外消旋化合物的色譜圖Fig. 6 Chromatograms of the racemic compound separated by vancomycin-MDI chiral column a. D,L-Alanine at different flow rates; mobile phase: acetonitrile∶water=6∶4 (v/v); b. naproxen with different injection volumes; mobile phase: acetonitrile∶water=6∶4 (v/v).

3 結(jié)論

通過“網(wǎng)包法”成功制得了6種萬古霉素和替考拉寧的手性柱,它們對外消旋化合物表現(xiàn)出較好的分離能力,將其與交聯(lián)柱和商品手性柱相比較,彼此之間具有很好的互補性。

除此之外，“網(wǎng)包法”作為一種新穎的手性固定相的制備方法,還具有操作簡單、反應(yīng)快速等特點,為新型手性高效液相色譜柱的制備探索了新的途徑。