劉虎威, 傅若農(nóng)

(1. 北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院, 北京 100871; 2. 北京理工大學(xué), 北京 100081)

1 色譜分析方法的出現(xiàn)[1]

文獻記載,有些科學(xué)家在19世紀(jì)下半葉就觀察到了吸附現(xiàn)象[2,3],如1850年龍格(F. F. Lunge)觀察到將一滴染料混合物溶液滴到吸墨紙上時會擴散成一層層的圓形環(huán);申拜恩(C. F. Schoenbein)在1861年注意到,如果把一滴無機鹽混合溶液滴在一張濾紙上,那么各種鹽分會以不同速度向四周擴散;德伊(D. T. Day)在1897年、克利特卡(S. K. Kritka)在1900年初發(fā)現(xiàn)把石油簡單地通過碳酸鈣的細(xì)粉柱,就會分離為不同餾分。這些工作可以說是平面色譜或者柱色譜的萌芽,但直到20世紀(jì)初,人們只是利用吸附現(xiàn)象實現(xiàn)了簡單的分離,今天看來,其原理基本都屬于前沿色譜或頂替色譜。進入20世紀(jì)后,人類社會的發(fā)展對科學(xué)技術(shù)提出了更高的要求,科學(xué)家需要在分子層面上實現(xiàn)復(fù)雜混合物的分離分析,乃至分離制備。完成這一歷史貢獻的是俄國的植物學(xué)家米哈伊5西蒙諾維奇5茨維特(Michael Semenovich Tswett)(見圖1)。正是這位杰出的科學(xué)家在20世紀(jì)初系統(tǒng)地研究了色譜分離現(xiàn)象,并認(rèn)識到這種分離方法的重要性。

圖 1 (從左到右) M. S. Tswett (1872-1919), R. Kuhn (1900-1967), K. I. Sakodynskii (1930-1996), L. S. Ettre (1922-2010)Fig. 1 (From left to right) M. S. Tswett (1872-1919), R. Kuhn (1900-1967), K. I. Sakodynskii (1930-1996), L. S. Ettre (1922-2010)

關(guān)于茨維特的生平及色譜的早期發(fā)現(xiàn)過程有不同的版本,但大同小異。不過,有些中文版本(包括網(wǎng)上資料)存在某些不符合事實的表述。20世紀(jì)90年代初,蘇聯(lián)著名色譜學(xué)者K. I. Sakodynskii教授(見圖1)和美國耶魯大學(xué)L. S. Ettre教授(見圖1)對色譜發(fā)現(xiàn)的歷史進行過深入研究,我們在這里僅根據(jù)他們的嚴(yán)肅考證[4,5]來簡述色譜的初期發(fā)展歷程。

茨維特1872年5月14日生于意大利的阿斯蒂(Asti),他父親是俄國外交官,當(dāng)時在瑞士工作,母親是意大利人,在茨維特出生后便去世。茨維特13歲前生活在瑞士洛桑,后隨其父到日內(nèi)瓦,1891年從日內(nèi)瓦學(xué)院(College of Geneva)畢業(yè)后進入日內(nèi)瓦大學(xué)(University of Geneva)學(xué)習(xí),并于1893年獲得物理與數(shù)學(xué)系的學(xué)士學(xué)位。而后轉(zhuǎn)學(xué)植物學(xué),1896年獲得細(xì)胞生理學(xué)博士學(xué)位。隨后回國與其父團聚于克里米亞半島,1896年底遷居到圣彼得堡,開始在俄羅斯帝國科學(xué)院(the Imperial Russian Academy of Sciences)的植物實驗室工作。由于俄羅斯不承認(rèn)他的瑞士學(xué)位,茨維特必須在俄羅斯再次攻讀(在職)博士學(xué)位。隨后他謀得一個植物學(xué)私人教職,工作于P. Lesgaft的生物實驗室。1900年其父在雅爾塔去世。茨維特于1901年通過題目為“葉綠素的物理化學(xué)研究”的學(xué)位論文答辯,獲得喀山大學(xué)(University of Kazan)的碩士學(xué)位。1901年10月他在圣彼得堡召開的第11屆俄國自然科學(xué)家與醫(yī)生協(xié)會大會上發(fā)表了“葉綠素生理學(xué)研究的方法和任務(wù)”的報告,并于年底作為實驗助理進入波蘭華沙大學(xué)工作。

1903年茨維特成為華沙大學(xué)的助理教授并在波蘭其他大學(xué)講授植物學(xué)課程。是年3月,他在華沙自然科學(xué)家協(xié)會的生物學(xué)會議上作了關(guān)于“新吸附現(xiàn)象”的報告,第一次公布了他的色譜研究結(jié)果。1906年3月他給德國的植物學(xué)刊物“the Berichte der Deutschen Botanischen Geselschaft (德國植物學(xué)報告)”投了兩篇關(guān)于色譜的重要學(xué)術(shù)論文,1907年5月在柏林舉行的一次德國植物學(xué)會會議上,他系統(tǒng)介紹了色譜技術(shù),并展示了分離得到的純色素。是年8月他受聘為華沙獸醫(yī)研究所的講師,后與波蘭女子Helena A. Trusevich結(jié)婚。1908年10月成為華沙工學(xué)院(Polytechnic Institute of Warsaw)化學(xué)與采礦系的資深講師,這期間他完成了俄羅斯博士學(xué)位論文“動物和植物界的葉綠素”,并于1910年在華沙出版(30年后此書對Kuhn的研究工作起了重要作用), 1910年11月在華沙大學(xué)通過了博士學(xué)位論文答辯。這期間他于1909年底的第12屆俄國自然科學(xué)家與醫(yī)生協(xié)會大會上宣讀了題為“分析色素混合物的物理新方法及其在葉綠素研究中的應(yīng)用”的報告,全面闡述了色譜分離方法。

1911年底,茨維特在莫斯科參加了普通和應(yīng)用化學(xué)Mendelew大會,作了題為“葉綠素化學(xué)的現(xiàn)狀”的報告,同年還獲得俄羅斯帝國科學(xué)院的M. N. Akhmatov獎。1914年位于西西伯利亞的托木斯克大學(xué)(University of Tomsk)聘請他為植物學(xué)教授,但被他以氣候不適的理由拒絕。1915年夏他偕妻子離開華沙去俄羅斯敖德薩,期間德國軍隊占領(lǐng)了波蘭,他無法返回華沙,便暫居莫斯科。此時波蘭一些高校遷徙到莫斯科,他便加盟華沙工學(xué)院。1916年8月他在遷移到諾夫哥羅德的華沙工學(xué)院繼續(xù)教學(xué)工作,后因健康原因在高加索山區(qū)休養(yǎng)。1917年3月愛沙尼亞塔爾圖大學(xué)(University of Tartu)聘請他為植物學(xué)教授和植物園主任,他隨即于9月到塔爾圖開始其教學(xué)和科研工作。1918年8月德國軍隊進犯塔爾圖后,他隨俄國教授們遷徙到沃羅涅什,1919年6月26日因喉部慢性感染而病故于沃羅涅什,終年47歲。其妻子則于1922年病逝于黑海東岸的格列博夫卡。二戰(zhàn)期間茨維特的墳?zāi)贡粴?直到1992年人們才在1919年埋葬他的地方(Okata-Alekseevsky寺院)立了一塊墓碑。值得一提的是,1918年有幾位著名科學(xué)家曾推薦茨維特作為諾貝爾化學(xué)獎候選人[6],但最后沒有頒給他。而到1919年這位色譜之父就辭世了,這令后來的很多色譜學(xué)者為之感嘆(事實上,1919年沒有頒發(fā)諾貝爾化學(xué)獎)。

圖 2 (a)1906年和(b)1908年茨維特發(fā)表的色譜裝置和 色譜圖示意Fig. 2 (a) Illustration of the chromatographic device published by Tswett in 1906 and (b) a chromatogram in 1908

由上可知,茨維特于1901年(甚至更早一些)在試驗中觀察到了色譜現(xiàn)象,這在其碩士學(xué)位論文中有所描述,并在俄國國內(nèi)學(xué)術(shù)會議上做了有關(guān)報告[7]。當(dāng)時,茨維特在一根玻璃管的底部塞上一團棉花,在管中填入粉末狀吸附劑,例如碳酸鈣等,然后把該吸附管與吸濾瓶連接,把有色植物葉子的石油醚萃取液傾注到管內(nèi)的吸附劑上面,然后用純石油醚洗脫,植物葉中的幾種色素就在管內(nèi)形成不同種顏色的色帶(見圖2)。此時,茨維特對吸附分離的認(rèn)識仍然沒有超出前人的認(rèn)識,只是觀察得更為仔細(xì)和系統(tǒng),這可以認(rèn)為是現(xiàn)代色譜的萌芽。1903年在華沙國際學(xué)術(shù)會議上用俄文發(fā)表的分離葉綠素的研究結(jié)果[8]更詳細(xì)地描述了實驗裝置和分離過程,他采用了109種有機和無機吸附劑來分離葉綠素等色素,并討論了吸附材料和淋洗過程對吸附分離的影響。在這篇論文中,茨維特第一次認(rèn)識到一種新的色譜類型,即洗脫色譜,并且用光譜方法檢測了分離后的物質(zhì)。盡管由于人們至今不知道的原因,登載該論文的俄文會議錄直到1905年出版,且在此論文中沒有出現(xiàn)“色譜”這個詞匯,但K. I. Sakodynskii堅持認(rèn)為,1903年3月8-21日應(yīng)該作為色譜分析方法的誕生日。

1906年茨維特在德文刊物上正式發(fā)表兩篇有關(guān)液-固色譜的學(xué)術(shù)論文[9,10],文中第一次提出了“Chromatographie”,英譯名為Chromatography,即“色譜法”的概念(中文也曾譯作“層析法”或“色層法”)。這個詞是由希臘語中“顏色”(chroma)和“書寫”(graphein)這兩個詞根組成的,因此,有人在英語中將色譜稱作“color writing”[11]。茨維特實驗方法中的玻璃管就是“色譜柱”,碳酸鈣就是“固定相”,純凈的石油醚就是“流動相”。圖2是茨維特分別于1906年和1908年發(fā)表的色譜分離裝置和色譜圖。由于20世紀(jì)初世界的科學(xué)中心在德國,只有用德文發(fā)表的論文才可能被大部分科學(xué)家所閱讀。因此,當(dāng)時西方很多頂級學(xué)者正是通過這兩篇文章了解了色譜,故他們認(rèn)為色譜的出現(xiàn)應(yīng)該是1906年的事情。這也就導(dǎo)致了色譜發(fā)現(xiàn)年份的不同說法,即1901年說、1903年說和1906年說;也因為如此,進入21世紀(jì)后人們用了5年多的時間來紀(jì)念色譜發(fā)現(xiàn)100周年。波蘭化學(xué)會的分析化學(xué)家于1994年9月在華沙大學(xué)生物學(xué)樓的墻上掛了一塊紀(jì)念牌,上面用波蘭語寫著銘文為(譯作中文) “M. S. Tswett博士于1901-1908年在此建筑內(nèi)發(fā)現(xiàn)了色譜”。

2 色譜分析方法的發(fā)展[12]

茨維特發(fā)現(xiàn)的色譜在科學(xué)上有重大意義,但并沒有立即得到當(dāng)時化學(xué)界的重視。原因是多方面的:第一,茨維特是植物學(xué)家,他的研究工作主要在植物學(xué)界交流,其他領(lǐng)域的科學(xué)家不容易了解到;第二,他的工作開始以俄文發(fā)表,而當(dāng)時科學(xué)的中心在德國,德文被認(rèn)為是國際科學(xué)語言(正如今天科學(xué)的中心在美國,英文是國際科學(xué)語言),這就使得國際科學(xué)家沒有及時了解到色譜這一技術(shù);第三,當(dāng)時的茨維特不是一位著名的科學(xué)家,所以難以獲得科學(xué)界知名人物的關(guān)注和支持,即使當(dāng)時的植物學(xué)界也有一些著名的科學(xué)家對茨維特的色譜方法持否定態(tài)度;第四,當(dāng)時的科學(xué)技術(shù)及社會經(jīng)濟的發(fā)展對分析分離(separation,即分子水平的分離)還沒有迫切的需求,一般的制備分離(即isolation,主要是蒸餾和萃取方法)就能滿足要求了。因此,盡管在茨維特之后也有一些科學(xué)家使用了色譜方法進行化學(xué)物質(zhì)的分離,但并沒有引起科學(xué)界的廣泛注意。

直到1931年,著名的奧地利裔德國化學(xué)家R. Kuhn及其合作者E. Lederer使用了茨維特的液-固色譜法,用碳酸鈣吸附劑填充的玻璃管(內(nèi)徑1 cm,長度15cm)對來自蛋黃的30 mg葉黃素樣品經(jīng)過3次分離,得到了3種胡蘿卜素異構(gòu)體,即α-胡蘿卜素(mp 188 ℃)、β-胡蘿卜素(mp 184 ℃)、γ-胡蘿卜素(mp 178 ℃),從而證明蛋黃葉黃素是氧化胡蘿卜素的混合物,同時也證明了茨維特的方法可以實現(xiàn)快速有效的分離(有關(guān)Kuhn等人的這部分研究工作,文獻[13]有詳細(xì)而有趣的描述,有興趣者可以參閱)。有必要指出,Kuhn生于維也納,1922年在維也納大學(xué)獲得化學(xué)博士學(xué)位,其導(dǎo)師為1915年的諾貝爾化學(xué)獎得主R. Willst?tter教授(此人當(dāng)年對茨維特的色譜方法是持否定態(tài)度的,他將茨維特1910年出版的書給了其學(xué)生Kuhn, Kuhn又交給其學(xué)生Lederer,他們從書中學(xué)到了色譜技術(shù))。1925年Kuhn受聘于慕尼黑大學(xué),1938年因為其在胡蘿卜素和維生素方面的研究而獲得了諾貝爾化學(xué)獎(頒獎時間為1939年,當(dāng)時德國政府要求其棄獎,但他還是在二戰(zhàn)之后領(lǐng)了獎)[13]。如此著名的化學(xué)家采用了色譜方法,得到了極其重要的研究結(jié)果,很快就為科學(xué)界所熟知,從而使色譜獲得了“重生”,進入了飛快的發(fā)展階段。有人做過統(tǒng)計[11],迄今為止的諾貝爾化學(xué)獎得主中有超過12位科學(xué)家的獲獎工作是與色譜分不開的。

就在Lederer和Kuhn的上述工作之后,Kuhn實驗室的H. Brockman[14]和A. Winterstein[15]也采用色譜方法很快獲得了重要成果。瑞士的P. Karrer等[16]和匈牙利的L. Zechmeiister等[17]著名學(xué)者也發(fā)表了色譜應(yīng)用的論文,這些都對色譜的發(fā)展起了重要的推動作用。1937年Springer出版社就出版了第一本德文色譜專論[18], 1938年出現(xiàn)了新的色譜類型----薄層色譜(TLC)[19]。

以上討論的是液-固吸附色譜的早期發(fā)展,氣-固色譜又如何呢?事實上,1904年的諾貝爾化學(xué)獎得主W. Ramsay在1905年就利用活性炭的吸附性質(zhì)成功分離了復(fù)雜的氣體混合物[20],這應(yīng)該是氣-固色譜的萌芽。20世紀(jì)40年代初,有3組科學(xué)家同時研究氣體吸附色譜。首先是G. Hesse在1941-1942年采用裝有淀粉的玻璃管分離了氮氣中的溴和碘[21],后來又用硅膠填充柱和二氧化碳流動相分離了一些脂類化合物以及共沸物和順反異構(gòu)體[22];很可惜,他的有關(guān)研究因二戰(zhàn)而中斷了。再就是G. Damkǒhler和H. Theile分離了載氣流中的甲醇-乙醇混合物以及環(huán)己烷和苯的混合物,他們還將甘油涂在吸附劑上以降低吸附活性(這應(yīng)該是最早的氣-液色譜嘗試)[23]。第三組科學(xué)家是E. Cremer及其學(xué)生A. Kunte等人,他們研究了乙炔加氫的動力學(xué)并分析了乙炔和乙烯的混合物。Cremer的學(xué)生F. Prior則采用Kuhn在1947年開發(fā)的簡單色譜裝置,用炭黑作為固定相分離了空氣中的二氧化碳[24]。Cremer的另一個學(xué)生Microchem則分離了氮氣、乙烯和乙炔,采用的是熱導(dǎo)檢測器[25]。Cremer和她的學(xué)生在二戰(zhàn)期間還設(shè)計制造出第一臺氣-固色譜儀。基于這些史實,Sakodynskii教授[26]認(rèn)為,氣-固色譜的發(fā)明人應(yīng)該是G. Hesse和E. Cremer。有趣的是,Cremer的第一篇氣-固色譜論文于1944年投送給Naturwissenschaften雜志,經(jīng)修改后該雜志于1945年2月錄用了這一論文。然而,正當(dāng)出版社準(zhǔn)備以特刊付印時,印刷工廠在空襲中被炸毀,所以這篇文章就葬身于廢墟之中,直到31年后的1976年才作為歷史文件而發(fā)表。

瑞典科學(xué)家A. W. K. Tiselius(見圖3)對色譜的發(fā)展也做出了重要貢獻,他和S. Claesson在20世紀(jì)40年代初對色譜方法進行了分類[27,28],這種分類法一直沿用至今。Tiselius最為人知的是其電泳研究成果,他因發(fā)明了分離蛋白質(zhì)的電泳裝置而獲得了1948年的諾貝爾化學(xué)獎。當(dāng)然,電泳一直是色譜的姐妹技術(shù),一般也包含在色譜的范疇。其實,Tiselius實驗室還有一個重要貢獻,即發(fā)明了液相色譜(LC)的梯度洗脫方法。

圖 3 (從左至右)A. W. K. Tiselius (1902-1971), A. J. P. Martin (1910-2002), R. L. M. Synge (1914-1994)Fig. 3 (From left to right) A. W. K. Tiselius (1902-1971), A. J. P. Martin (1910-2002), R. L. M. Synge (1914-1994)

分配色譜的發(fā)明要歸功于英國的化學(xué)家A. J. P. Martin和R. L. M. Synge(見圖3)。Martin生于倫敦,1932年從劍橋大學(xué)畢業(yè)后進入物理化學(xué)實驗室,此后他發(fā)展了采用氯仿-水的液-液多步萃取系統(tǒng)以分離維生素E。研究中他想到將對流中的兩種液體之一固定下來,而讓另一種流動,這就把萃取和色譜聯(lián)系了起來。1936年獲博士學(xué)位后,Martin和Synge一起用對流分配的方法分離氨基酸。他們把用水飽和的硅膠裝填在30 cm長的柱管中,用氯仿做流動相,將乙酰氨基酸加到柱上,同時加入甲基橙來監(jiān)控氨基酸在柱管中的移動。他們得到的分離效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于當(dāng)時任何復(fù)雜的裝置,這就是1940年分配色譜的發(fā)明[29]。很有趣的是,多年后Martin回憶當(dāng)年的研究工作時,寫到[13]“這一工作比科學(xué)更神奇,我們當(dāng)時根本不理解我們做的是什么”。為了從理論上解釋色譜分離過程,他們發(fā)展了色譜的塔板理論。此后,Martin和Condsen又發(fā)展了二維紙色譜[30]。

在Martin的第一篇色譜論文[29]中,作者就預(yù)言氣體也可以作為分配色譜的流動相,但當(dāng)時無人對此感興趣。直到十年之后Martin和A. T. James一起實現(xiàn)了自己的預(yù)言。他們采用涂敷了苯基甲基硅油(含10%的硬脂酸)的Celite顆粒裝填在40 cm的柱管中,成功分離了甲胺以及其他有機酸,從而發(fā)明了氣-液分配色譜[31]。這一成果發(fā)表于1952年,非常巧合的是,Martin和Synge分享了1952年的諾貝爾化學(xué)獎。當(dāng)然,獲獎理由是他們在1941年前后對分配色譜的貢獻,而不是1950年氣-液色譜的發(fā)明。

此后,氣相色譜(GC)進入了快速發(fā)展期,在高速發(fā)展的石油化工行業(yè)迅速得到了應(yīng)用。1957年英國人M. J. E. Golay[32]開創(chuàng)了開管柱(open tubular column)GC,習(xí)慣上稱為毛細(xì)管(capillary)GC,這是GC發(fā)展史上具有里程碑意義的技術(shù)創(chuàng)新。1979年彈性石英毛細(xì)管柱的出現(xiàn)使毛細(xì)管柱GC迅速普及,今天市場上85%以上的GC柱是這種柱型?？梢哉f,20世紀(jì)50-70年代色譜領(lǐng)域GC的發(fā)展由于其強大的分離能力而獨領(lǐng)風(fēng)騷,而LC的發(fā)展則相對緩慢一些。原因之一是GC、特別是毛細(xì)管柱GC技術(shù)滿足了這個時期石油化工發(fā)展對分析檢測的需求,也為日益受到重視的環(huán)境保護檢測提供了技術(shù)支持;二是當(dāng)時工業(yè)的發(fā)展對LC的要求相對不那么迫切;三是LC的發(fā)展受到技術(shù)上的限制,盡管理論研究表明,細(xì)內(nèi)徑色譜柱和小顆粒填料是提高LC分離效率的關(guān)鍵,但小顆粒填料的制備技術(shù)尚未成熟,同時,填料粒徑減小所導(dǎo)致的高壓也是當(dāng)時儀器所難以承受的。

在理論方面,1956年荷蘭學(xué)者J. J. Van Deemter等[33]在Martin等人的塔板理論的基礎(chǔ)上發(fā)展了描述色譜過程的速率理論,美國猶他大學(xué)的J. C. Giddings教授總結(jié)和擴展了前人的色譜理論,從1955年開始研究色譜的分子動力學(xué)理論[34], 1965年出版了專著《Dynamics of Chromatography》[35],該書至今仍然被學(xué)術(shù)界認(rèn)為是色譜的經(jīng)典,這為色譜的進一步發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。他于1991年出版的著作《Unified Separation Science》[36]更是推動了整個分離科學(xué)的發(fā)展。Giddings對分離科學(xué)的發(fā)展還有兩項重要的貢獻,一是發(fā)明的類似洗脫色譜的場流分級(field-flow fractionation, FFF)技術(shù)[37],二是從1965年開始作為執(zhí)行編輯出版Elsevier的定期系列綜述《Advances in Chromatograph》直到1993年。1996年他因癌癥而逝世,享年66歲,被學(xué)界認(rèn)為是分離科學(xué)領(lǐng)域的重大損失。

在LC方面,1956年E. Stahl[38]系統(tǒng)地研究了硅膠的規(guī)格、性能、薄層厚度等對分離效果的影響,并研制出薄層色譜板涂布器,從而使TLC得到了廣泛應(yīng)用。柱色譜從茨維特的經(jīng)典LC到現(xiàn)代高效液相色譜(HPLC)則是20世紀(jì)60年代后半期的事情。GC難以直接分離高沸點強極性的化合物,雖然有些被分析物可以經(jīng)過衍生化處理或裂解后用GC分析,但增加了方法的復(fù)雜性,而經(jīng)典LC采用玻璃管裝填直徑為100 μm左右的填料,流動相主要依靠重力驅(qū)動通過色譜柱,一般需要幾個小時甚至幾天完成一次分離,時間長,分析效率低。從塔板理論到速率理論都證明,由于氣相分子擴散系數(shù)比液相大4～5個數(shù)量級,故要實現(xiàn)LC的高效分離,就需要小粒度填料和細(xì)內(nèi)徑色譜柱。另一方面,傳統(tǒng)的氣-固吸附色譜難以分離強極性混合物,而制藥工業(yè)的發(fā)展以及生命科學(xué)的發(fā)展卻非常需要能夠分離水溶液中極性化合物甚至生物大分子的方法。為此,20世紀(jì)60年代有一批科學(xué)家專注于研究提高LC分離效率和拓展應(yīng)用范圍的問題,從而發(fā)展了粒度在40 μm以下的填料,并采用高壓輸液泵迫使流動相通過色譜柱,這就是HPLC,或者稱為現(xiàn)代LC[39]。

對HPLC發(fā)展有重要貢獻的首先是耶魯大學(xué)的Cs. Horváth教授團隊。Horváth(1930-2004)出生在匈牙利,畢業(yè)于布達(dá)佩斯工學(xué)院(Budapest Institute of Technology)的化工專業(yè)。1956年匈牙利政治動亂中他到了西德,開始在一家公司工作。此后于1961年進入J. W. Goethe University攻讀博士學(xué)位。1963年進入哈佛醫(yī)學(xué)院(Harvard Medical School)做博士后,開始GC方面的研究,開發(fā)了載體涂漬開管柱(SCOT)。而后他受聘于耶魯大學(xué),于60年代中期開發(fā)了粒徑為30～40 μm的色譜填料,并設(shè)計制造了世界上首臺HPLC儀器[40]。他也是最早使用反相HPLC的科學(xué)家,深入研究了反相HPLC的保留機理。還使用頂替色譜進行制備分離,后來在毛細(xì)管電泳(CE)和毛細(xì)管電色譜(CEC)方面也有建樹,對生命分析化學(xué)的發(fā)展做出了重要貢獻。

杜邦公司的研究團隊在小顆粒填料方面做了開創(chuàng)性的工作,如P. Hamilton[41]在1960年就用小粒徑的離子交換樹脂很好地分離了氨基酸,J. Kirkland等人在60年代中期開發(fā)了粒徑為30～40 μm的硅膠填料Zipax[42],并且涂覆了β,β′-氧二丙腈作為液-液色譜固定相。這種固定相穩(wěn)定性差,固定液流失嚴(yán)重,柱壽命也就一兩天,且不能進行梯度洗脫。這迫使他們轉(zhuǎn)向高分子材料,先后開發(fā)了Zipax SCX、Zipax SAX和Zipax HCP 3種很受市場歡迎的填料。Zipax SCX很適合藥物分析,但當(dāng)時美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)還不認(rèn)可HPLC方法。Zipax SAX后來成為第一個被FDA認(rèn)可的填料,Zipax HCP則適合于分離所有疏水性化合物。在此期間,Kirkland基于硅化學(xué)方法開發(fā)了鍵合相[43],獲得了專利授權(quán)的Zipax Permaphase鍵合固定相,其中Permaphase ODS (C18)成為HPLC的經(jīng)典填料,流行至今。從20世紀(jì)60年代后期到70年代早期,其他實驗室也開發(fā)了類似的填料,如Waters公司的Corasil I和Corasil II、Merck公司的Perisorb等,都對HPLC的發(fā)展起了重要作用。然而,此時的填料比表面很低(1～10 m2/g),導(dǎo)致對很多物質(zhì)的保留作用太弱而不能分離。后來Kirkland團隊又開發(fā)了著名的Zorbax全多孔硅膠填料,最早的粒徑為7 μm,孔徑6 nm(60 ?),比表面積達(dá)到300 m2/g,色譜性能大為提高。因此可以說,HPLC的發(fā)展史很大程度上就是填料技術(shù)的進化史,表1列出了不同年代的填料粒徑變化情況。

表 1 HPLC填料粒徑的發(fā)展變化Table 1 Development of particle size for HPLC

由表1可見,填料粒徑的減小直接導(dǎo)致柱壓力的升高,這對儀器的耐壓性能提出了更高要求。1960年中期Kirkland團隊采用裝配氣動放大泵的820型儀器,通過硅橡膠隔墊密封的注射器進樣。由于壓力高,幾次進樣后就會漏液,一般幾個小時就要更換密封墊。后來,他們開發(fā)了數(shù)字混合梯度裝置和帶樣品環(huán)的進樣閥,使得HPLC儀器性能大為提高。Waters公司在商品化的HPLC儀器方面起了非常重要的作用。此外,對HPLC發(fā)展有重要貢獻還有L. R. Snyder、I. Halász和B. Karger等人,這里不再一一介紹。總之,HPLC的出現(xiàn)是一批科學(xué)家在60年代后期到70年代初期共同研究的結(jié)果。

20世紀(jì)70年代后期色譜的發(fā)展進入了GC和HPLC并駕齊驅(qū)的時代,GC越來越趨于成熟,色譜-質(zhì)譜(MS)聯(lián)用技術(shù)、特別是基于毛細(xì)管柱的GC-MS技術(shù)得到了普遍應(yīng)用;HPLC的發(fā)展也加快了速度。因為在自然界已知的化合物中約15%可以用GC直接分析,而其余85%基本都可以用LC分析,所以,HPLC的發(fā)展越來越受到重視,特別是生命科學(xué)和生物制藥的快速發(fā)展,更使HPLC成為不可或缺的分離分析方法。到20世紀(jì)90年代后期,J. W. Jorgenson等[44-46]致力于開發(fā)粒徑小于2 μm的HPLC填料,他們稱之為超高壓LC,即UPLC。近幾年他們又在研發(fā)1.1 μm的UPLC填料[47,48]。需要指出,2004年Waters公司推出了基于亞2 μm填料色譜柱的超高效LC儀器,并將UPLC注冊為專利產(chǎn)品名稱。隨后其他公司也相繼推出商品化的超高效LC儀器,名稱有超高效液相色譜(UHPLC)或超高流速液相色譜(UFLC)等。也有人對HPLC、UPLC和UHPLC作了重新定義[49],我們將在其他文章中詳細(xì)討論。

隨著HPLC的飛速發(fā)展,LC-MS技術(shù)也取得了突破。獲得2002年諾貝爾化學(xué)獎的電噴霧技術(shù)逐步成為LC-MS/MS的標(biāo)配接口。同時,又出現(xiàn)了一些新的分離分析技術(shù)。主要是20世紀(jì)80年代初由Jorgenson等[50,51]在Hjertén等[52,53]的工作基礎(chǔ)上發(fā)展起來的毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE),由S. Terabe等[54]發(fā)展的膠束電動色譜(MEKC),以及90年代出現(xiàn)的集HPLC和CZE優(yōu)點的毛細(xì)管電色譜(CEC)[55],構(gòu)成了較為完整的CE分離模式。到90年代后期,基于整體材料的HPLC和CEC受到廣泛重視[56],隨后又出現(xiàn)了芯片技術(shù)的快速發(fā)展,開始叫作微全分析系統(tǒng)(μTAS)[57]或者芯片實驗室(lab-on-chip)[58],后來統(tǒng)稱為微流控學(xué)(microfludics)[59],現(xiàn)在發(fā)展成為微納流控(micro/nano-fludics)技術(shù)[60]。另一方面,超臨界流體色譜(SFC)經(jīng)歷了20世紀(jì)90年代的較快發(fā)展和隨后十來年的相對停滯,近幾年又有了新的進展,從樣品制備中的超臨界流體萃取,到生物分析、食品分析和藥物分析的SFC,以及制備SFC都展現(xiàn)了良好的應(yīng)用前景[61]。

在應(yīng)用領(lǐng)域,2000年6月人類基因組計劃的提前完成[62]在很大程度上得益于分析化學(xué)家發(fā)展的陣列毛細(xì)管電泳(ACE)技術(shù)[63]。從此,人類進入了功能基因組(后基因組)時代,科學(xué)家的研究重心從揭示生命的所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在整體水平上對生物功能的研究?；蚪MDNA的測序結(jié)果還不能回答某基因的表達(dá)時間、表達(dá)量、蛋白質(zhì)翻譯后修飾等問題,而這些問題可望在轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、糖組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等生命組學(xué)研究中找到答案。這也是目前色譜和電泳及其與MS的聯(lián)用技術(shù)最重要的應(yīng)用領(lǐng)域。生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)和新能源研究都是色譜相關(guān)技術(shù)可以發(fā)揮更大作用的領(lǐng)域。

3 色譜分析方法的現(xiàn)狀和未來

色譜法在100多年的發(fā)展過程中,各種方法的發(fā)展是不平衡的。LC出現(xiàn)雖然早,但GC是最早廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的技術(shù)。之所以如此是因為GC的分析靈敏度高,分離效率高,分析速度快,分析精度高,很好地滿足了當(dāng)時科學(xué)研究和社會發(fā)展的需求。后來HPLC突飛猛進,是基于小粒度填料和高壓輸液泵的技術(shù)突破,同時也是制藥工業(yè)和生命科學(xué)的發(fā)展使然。目前,GC和HPLC是世界上應(yīng)用最廣的分析技術(shù),在食品安全、石油化工、生物醫(yī)藥、環(huán)境保護、材料科學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著極其重要的作用。將來的發(fā)展趨勢是儀器的自動化、網(wǎng)絡(luò)化,特別是計算機技術(shù)和人工智能的應(yīng)用,以及專門的進樣裝置及樣品預(yù)處理裝置與色譜儀器的一體化,比如頂空進樣、吹掃捕集進樣、固相微萃取(SPME)、超臨界流體萃取(SFE)和加壓溶劑萃取(PSE)等技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)了與不同色譜儀器的在線聯(lián)用。GC-MS迅速普及,全二維GC、多維LC以及二維CE的發(fā)展也引人注目,它們將對復(fù)雜混合物的分析發(fā)揮重要作用。HPLC近年在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展很快,其中較為活躍的是離子色譜(IC)、疏水相互作用色譜(HIC)、手性分離及反相色譜與其他模式結(jié)合的多維色譜。HPLC應(yīng)用面廣,可以進行制備分離,在生命科學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域中有很好的應(yīng)用前景。HPLC的儀器市場將持續(xù)增長,主要表現(xiàn)在LC-MS系統(tǒng)以及LC-NMR系統(tǒng)的進一步成熟和應(yīng)用范圍的擴大,以及開發(fā)更為簡單高效的儀器系統(tǒng),包括各種新的MS技術(shù)。據(jù)中國行業(yè)研究報告網(wǎng)最新研究報告顯示,到2022年全球色譜儀器市場總規(guī)模將達(dá)109.9億美元[64]。

著名色譜學(xué)者G. Guiochon在1998年發(fā)表文章[65]認(rèn)為,GC和HPLC是分離分析領(lǐng)域極為成功的范例,而SFC和FFF發(fā)展緩慢,CE則處于前途未卜的狀態(tài)。關(guān)于SFC, Giddings和Myers早在20世紀(jì)60年代就發(fā)表了先驅(qū)性的研究工作,80年代初期毛細(xì)管柱SFC是一個研究熱點,而且當(dāng)時認(rèn)為SFC將掀起分析方法的革命,但是后來各大儀器公司紛紛停止了SFC的生產(chǎn),放棄了進一步開發(fā)SFC的計劃。毫無疑問,SFC具有一些獨特用途,兼具GC和LC的一些優(yōu)點,但是它也只能在GC和HPLC的夾縫中生存,而GC和HPLC已成為廣泛應(yīng)用的技術(shù),這就造成了SFC市場有限的局面。值得注意的是,近年來SFC又有東山再起之勢[66],特別是在手性藥物分離、生命分析化學(xué)和組學(xué)分析領(lǐng)域,SFC的多樣品適用性、快速分離和流動相綠色環(huán)保的特點逐漸被人們所重視。采用壓縮CO2流動相、亞2 μm填料的填充柱SFC的文獻越來越多[67]。SFC與UHPLC分離可以在一臺儀器上實現(xiàn),這被沃特世公司稱為超高效合相色譜(ultra performance convergence chromatography, UPC2)[68]; SFC與HPLC構(gòu)成的二維分離系統(tǒng)展示出優(yōu)于一般二維HPLC的分析速度和分離效率,有望應(yīng)用于更多的研究領(lǐng)域[69]。為此,幾個大的儀器廠商,如安捷倫、沃特世、賽默飛世爾和島津等公司又都推出了各自的SFC儀器,預(yù)示著這一技術(shù)可能有很好的市場前景。

20世紀(jì)80年代興起的CE因具有驚人的高柱效和相對簡單的儀器設(shè)備而吸引了許多分析化學(xué)家參與研究,特別是MEKC和CEC的出現(xiàn),使許多色譜學(xué)者覺得CE似乎要解決絕大部分分離問題。然而,進入21世紀(jì)以來,許多工業(yè)分析化學(xué)家逐漸對CE失望了,原因是CE的分析重現(xiàn)性和檢測靈敏度達(dá)不到HPLC的水平,這大大阻礙了其實際應(yīng)用。同時,很多CE研究人員轉(zhuǎn)移到了由微通道電泳發(fā)展而來的微納流控研究領(lǐng)域,致使CE的發(fā)展相對停滯了,有些儀器廠商已經(jīng)停止了CE儀器的生產(chǎn)。目前,CE的主要應(yīng)用領(lǐng)域是基因測序(陣列CE)、手性藥物分離、物化參數(shù)(如解離常數(shù))的測定以及相互作用研究等領(lǐng)域。最近采用CE分離表征納米材料,研究納米顆粒的性質(zhì)及其與其他分子的相互作用取得了很好的效果[70]。而各種納米材料如金屬有機骨架(MOFs)、磁性和非磁性納米顆粒、碳納米管和石墨烯在CE中的應(yīng)用也取得了很好的進展[71],這可能是一個很有前途的CE發(fā)展方向。在常規(guī)分析領(lǐng)域,雖然CE的分析重現(xiàn)性已經(jīng)在很大程度上得到了解決,在生物大分子分析中也顯示了其優(yōu)越性,但由于毛細(xì)管內(nèi)徑只有25～75 μm,光學(xué)檢測器的靈敏度仍然是一個瓶頸問題。基于納米孔的新一代基因檢測技術(shù)的出現(xiàn)有望取代陣列CE,而微納流控的發(fā)展又會進一步縮小CE的發(fā)展空間。因此,除非CE在進一步提高分析重現(xiàn)性的同時發(fā)展出更高靈敏度的通用檢測技術(shù),解決一些其他方法解決不了的問題,否則,其發(fā)展前景并不令人樂觀。

FFF也經(jīng)歷了長時間的發(fā)展,但應(yīng)用仍然有限。FFF是根據(jù)顆粒物質(zhì)在各種場中的擴散速度不同而實現(xiàn)分離的,故主要用于顆粒物如合成與天然高分子的分析,也可以分離細(xì)菌、病毒、微生物和脂質(zhì)體等生物顆粒。目前,FFF的主要應(yīng)用領(lǐng)域還是聚合物分析[72],采用熱FFF可以表征共聚物的自組裝[73]。近年來納米科技的發(fā)展為FFF提供了一個新的機遇[74],不對稱流FFF的應(yīng)用越來越多[75],在納米藥物分析方面展現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢[76],比如,不對稱流FFF與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用可以分析金屬納米顆粒。這是一個FFF可以展示其優(yōu)越性的領(lǐng)域,可能推動FFF的進一步發(fā)展?？傊?基礎(chǔ)研究產(chǎn)生的新方法能否得到廣泛的應(yīng)用,從而推動技術(shù)進步和社會經(jīng)濟的發(fā)展,主要取決于這種方法是否能解決其他方法所不能解決的實際問題,是否具有已有方法所不具備的優(yōu)點,以及是否有適當(dāng)?shù)氖袌鲂枨蟆?/p>

4 色譜發(fā)展史給我們的啟示

總結(jié)色譜100多年的發(fā)展史,給我們的啟示主要是:第一,基礎(chǔ)研究始終是科學(xué)技術(shù)進步的源泉。沒有茨維特當(dāng)初對色譜分離這一物理現(xiàn)象的仔細(xì)觀察,沒有Martin等人對分配色譜理論的系統(tǒng)研究,沒有Giddings對色譜理論的深入闡述,很難想象色譜的發(fā)展能有這么快。第二,社會經(jīng)濟發(fā)展的需求是各種分析技術(shù)創(chuàng)新的驅(qū)動力。無論是色譜的出現(xiàn),還是當(dāng)初Kuhn等人分離胡蘿卜素的工作,都是科學(xué)研究對分離技術(shù)的需要才導(dǎo)致了色譜的發(fā)展;至于20世紀(jì)50年代GC突飛猛進的發(fā)展,則是石油化工對分析技術(shù)的迫切需求所致。而20世紀(jì)90年代以來生命科學(xué)和醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展以及環(huán)境科學(xué)的發(fā)展更是為新的色譜技術(shù)提供了強大的驅(qū)動力。第三,學(xué)科交叉是分析技術(shù)創(chuàng)新的重要途徑。茨維特是植物學(xué)家,Martin是物理化學(xué)家,但他們對科學(xué)的貢獻最終主要體現(xiàn)在分析化學(xué)領(lǐng)域,這是典型的學(xué)科交叉。今天,很多物理學(xué)家、納米化學(xué)家、有機和無機化學(xué)家與分析化學(xué)家合作發(fā)展了很多用于色譜分析的新理論新材料新方法。在生命化學(xué)領(lǐng)域,化學(xué)與生物學(xué)的交叉、與臨床醫(yī)學(xué)的交叉更是催生了各種生命分析化學(xué)方法的出現(xiàn),包括用于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等前沿領(lǐng)域的色譜新方法。至于色譜儀器的創(chuàng)新則更是多學(xué)科研究人員共同參與的結(jié)果。第四,不懈堅持和勇于探索是技術(shù)創(chuàng)新的必要條件。對于科學(xué)工作者來說,這應(yīng)該是不言而喻的。歷史上重要的科學(xué)突破無不是科學(xué)家長期堅持的結(jié)果,色譜亦然。任何急功近利的浮躁做法都是和科學(xué)精神背道而馳的,因此科學(xué)研究的評價機制也必須符合科學(xué)發(fā)展的規(guī)律。

盡管色譜經(jīng)歷了100多年的發(fā)展,盡管已經(jīng)有各種很成熟的色譜方法,但我們相信,色譜技術(shù)在未來還會有重要的發(fā)展,這可能主要體現(xiàn)在:(1)分離材料的創(chuàng)新將使分析速度更快,分離效率更高;(2)新的檢測技術(shù)的出現(xiàn)將使分析靈敏度更高,從而使單分子分析真正成為可能;(3)色譜儀器與其他儀器(包括樣品處理、檢測和數(shù)據(jù)處理技術(shù))的聯(lián)用將使色譜分析的自動化程度更高,應(yīng)用也將更為廣泛。(4)在應(yīng)用方面,生命組學(xué)研究無疑是色譜發(fā)揮更大作用的領(lǐng)域;新藥的研發(fā)、重大疾病的診斷與治療、環(huán)境污染分析和治理都離不開色譜分離分析?？傊?隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展,各種色譜技術(shù)也將持續(xù)發(fā)展,這必將為社會為人類做出更大的貢獻。

致謝: 本文是在為色譜技術(shù)叢書第三版的《色譜分析概論》撰寫的第一章部分內(nèi)容的基礎(chǔ)上擴充而成的。叢書第三版的出版得到了化工出版社和安捷倫科技公司的大力支持,特此致謝!